单步检测测定法的制作方法

专利名称：：单步检测测定法的制作方法
技术领域：
：本发明提供了用于将靶反转录反应、扩增反应和信号扩增反应相组合以获得少量核酸(特别是在未纯化的体液(例如血液)中的核酸)的快速而灵敏的检测的方法。本发明还提供了用于优化多重扩增反应的方法。本发明还提供了用于进行与INVADER测定法相组合的高度多重PCR的方法。本发明进一步提供了在单一反应容器中相组合地进行反转录、PCR和INVADER测定法(例如使用未纯化的体液如血液)而无需千预操作或试剂添加的方法。背景随着人基因组的核酸测序的完成，对于用于基因组研究和相关药物设计努力的快速、可靠、有成本效益且用户友好的测试的需要大大地增加。许多机构正活跃地挖掘可获得的基因序列信息以鉴定基因、基因表达和表型(例如，疾病状况、代谢应答等)之间的相互关系。这些分析包括试图表征个体和群体中基因突变以及遗传和基因表达异质性的效应。反转录(RT)和聚合酶链式反应(PCR)对于许多分子生物学和相关的应用，特别是基因表达分析应用是至关重要的，在这些应用中，反转录用于从起始RNA样品(例如mRNA)制备模板DNA，然后使用PCR扩增该模板DM以产生足以用于目的应用的量的扩增产物。在核酸提取和扩增方面的进步极大地扩展了可从其中获得遗传物质的生物样品的类型。特别地，PCR已使得可能从固定的组织样品、考古学样本和大量许多类型的数目以个位数计量的细胞中获得足够量的DNA。类似地，大规模SNP基因分型项目需要大量的基因组DM，从标准的生物样品中获得所述大量的基因组DNA可能是非常困难的。解决该问题的一个方法依赖于基于PCR的靶扩增。尽管PCR使得能够分析极少量的核酸，但其在许多情况中和对于许多类型的问题的实际应用仍然存在问题。因为通过该反应可很容易地扩增少量的靶核酸，所以PCR应用易受从一个测定法至另一个测定法所遗留的污染物的影响。该弱点通常使得有必要建立专用的设施或设置使扩增后操作的次数减少至最少的工作流程。在一些情况下，使用可实时监控反应而无需打开反应容器的专用设备。因此，所需要的是这样的方法，即该方法通过使来自少量扩增序列的信号产生最大化来限制对靶扩增的需要，从而有效地消除了对所遗留的污染物的易感性而同时又保持检测灵敏度。发明概述本发明提供了用于开发和优化核酸检测测定法的方法和程序，所述核酸检测测定法用于基础研究、临床研究以及用于开发临床检测测定法。在一些实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和b)处理所述靶序列信息以产生引物組，其中所述引物组包含用于所述至少Y个靶序列中每个靶序列的正向和反向引物序列，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[l]是核苷酸A或C，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在其他实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和b)处理所述靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含用于所述至少Y个粑序列中每个乾序列的正向和反向引物序列，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列,其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸G或T，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在特定的实施方案中，方法包括a)提供至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和b)处理所述靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含U与所述Y个靶序列中每个耙序列的5，区域的至少一部分相同的正向引物序列，和ii)与所述至少Y个把序列中每个靶序列的3，区域的互补序列的至少一部分相同的反向引物序列，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-..-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸A或C,并且每个正向和反向引物的N[2]-N[1]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在其他实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和b)处理所述粑序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)与所述Y个把序列中每个靶序列的5，区域的至少一部分相同的正向引物序列，和ii)与所述至少Y个靶序列中每个靶序列的3，区域的互补序列的至少一部分相同的反向引物序列，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[l]是核苷酸G或T，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在特定的实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供至少Y个粑序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含单核苷酸多态性；b)确定每个靶序列上将与一种或多种测定法探针杂交的位置以检测单核苷酸多态性，从而将足迹区定位在每个靶序列上；和c)处理所述靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其与在所述至少Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的3，紧接着的靶序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸A或C，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[1]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在一些实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供至少Y个耙序列的耙序列信息，其中每个靶序列包含单核苷酸多态性；b)确定每个靶序列上将与一种或多种测定法探针杂交的位置以检测单核苷酸多态性，从而将足迹区定位在每个靶序列上；和c)处理所述靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个耙序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其与在所述至少Y个靶序列中每个乾序列的足迹区的3，紧接着的靶序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-....-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸T或G，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[1]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[1]-3'互补。在某些实施方案中，设置引物组以进行可扩增至少Y个扩增子的多重PCR反应，其中每个扩增子由正向和反向引物的位置界定。在其他实施方案中，以数字或打印的序列信息的形式产生引物组。在一些实施方案中，以物质化的引物寡核苷酸的形式产生引物组。在某些实施方案中，每个正向和反向引物的N[3]-N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[3]-N[2]-N[l]-3'互补。在其他实施方案中，所述处理包括最初将每个正向引物的N[l]选择为5'区域中最3'的A或C。在某些实施方案中，所述处理包括最初将每个正向引物的N[l]选择为5'区域中最3'的G或T。在一些实施方案中，所述处理包括最初将每个正向引物的N[l]选择为5'区域中最3'的A或C，并且其中对于不满足每个正向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中任一正向和反应引物的N[2]-N[l]-3'互补的要求的正向引物序列，所述处理进一步包括将N[1]改变成5'区域中次最3'的A或C。在其他实施方案中，所述处理包括最初将每个反向引物的N[l]选择为3'区域的互补序列中最3'的A或C。在一些实施方案中，所述处理包括最初将每个反向引物的N[l]选择为3'区域的互补序列中最3'的G或T。在进一步的实施方案中，所述处理包括最初将每个反向引物的N[l]选择为3'区域中最3'的A或C,并且其中对于不满足每个反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中任一正向和反应引物的N[2]-N[l]-3'互补的要求的反向引物序列，所述处理进一步包括将N[l]改变成3'区域中次最3'的A或C。在特定的实施方案中，所述足迹区包含单核苷酸多态性。在一些实施方案中，足迹包含突变，在一些实施方案中，每个靶序列的足迹区包含与一种或多种设置用于检测单核苷酸多态性的测定法探针杂交的靶序列的一部分.在某些实施方案中，足迹是这样的区域，即在该区域中探针进行杂交。在其他实施方案中，足迹还在任一末端包含额外的核苷酸。在一些实施方案中，所述处理进一步包括选择每个正向和反向引物的N[5]-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'，以使与测定法组分序列存在低于80%的同源性。在优选的实施方案中，测定法组分是FRET探针序列。在某些实施方案中，靶序列的长度为大约300-500个碱基对，或大约200-600个碱基对。在某些实施方案中，Y是2至500或2至IO，OOO的整数。在某些实施方案中，所述处理包括选择每个正向和反向引物的x,以使每个正向和反向引物具有大约50°C(例如，50'C，或至少50。C和不超过55X:)的与靶序列的解链温度。在优选的实施方案中，引物的解链温度(当与靶序列杂交时)为至少50匸，但与所选择的检测测定法的最佳反应温度相差至少10匸。在一些实施方案中，确定引物组的正向和反向引物对的最佳浓度。在其他实施方案中，所述处理是自动化进行的。在进一步的实施方案中，用处理器来自动化进行所述处理。在其他实施方案中，本发明提供了包含通过本发明的方法产生的引物组和至少一种其他组分(例如，切割剂(cleavageagent)、聚合酶、INVADER寡核苷酸)的试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了包含通过本发明的方法产生的引物和引物组的组合物。在特定的实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供i)设置用于接受序列数据的用户界面，ii)其中储存了多重PCR引物应用软件的计算机系统；和b)将序列数据从所述用户介面传输至所述计算机系统，其中所述序列数据包括至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和c)使用多重PCR引物对应用软件处理靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和H)反向引物序列，其与在所述至少Y个乾序列中每个耙序列的足迹区的3，紧接着的靶序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-..-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸A或C，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补。在一些实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括a)提供i)设置用于接受序列数据的用户界面，ii)其中储存了多重PCR引物应用软件的计算机系统；和b)将序列数据从所述用户介面传输至所述计算机系统，其中所述序列数据包括至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，U)紧接在足迹区上游的区域，和iii)紧接在足迹区下游的3'区域；和c)使用多重PCR引物对应用软件处理靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和n)反向引物序列，其与在所述至少Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的3，紧接着的靶序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]-….-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸G或T，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物組中的任一正向和反向引物的N[2]-N[1]-3'互补。在某些实施方案中，本发明提供了系统，所述系统包括a)设置用于从用户界面接受数据的计算机系统，其中所述用户界面被设置成用于接受序列数据，其中所述序列数据包括至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含i)足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和Ui)紧接在足迹区下游的3'区域；b)与所述用户界面有效地连接的多重PCR引物对应用软件，其中所述多重PCR引物应用软件被设置成用于处理靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和ii)反向引物序列，其与在所述至少Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的3，紧接着的乾序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]…-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸A或C，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补；和c)其中储存了多重PCR引物对应用软件的计算机系统，其中所述计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器。在其他实施方案中，本发明提供了系统，所述系统包括a)设置用于从用户界面接受数据的计算机系统，其中所述用户界面被设置成用于接受序列数据，其中所述序列数据包括至少Y个靶序列的靶序列信息，其中每个靶序列包含U足迹区，ii)紧接在足迹区上游的5'区域，和Ui)紧接在足迹区下游的3'区域；b)与所述用户界面有效地连接的多重PCR引物对应用软件，其中所述多重PCR引物应用软件被设置成用于处理靶序列信息以产生引物组，其中所述引物组包含i)正向引物序列，其与在所述Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的5，紧接着的靶序列的至少一部分相同，和n)反向引物序列，其与在所述至少Y个靶序列中每个靶序列的足迹区的3，紧接着的靶序列的互补序列的至少一部分相同，其中每个正向和反向引物序列包含由5'-N[x]-N[x-l]...-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]表示的核酸序列，其中N表示核苷酸碱基，x至少为6，N[1]是核苷酸G或T，并且每个正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'不与所述引物组中的任一正向和反向引物的N[2]-N[l]-3'互补；和c)其中储存了多重PCR引物对应用软件的计算机系统，其中所述计算机系统包括计算机存储器和计算机处理器。在某些实施方案中，所述计算机系统被设置成用于将引物组返传回用户界面。在一些实施方案中，本发明提供了用于在单个反应容器中进行反转录以及耙和信号扩增反应的方法.在一些优选的实施方案中，所述靶扩增反应是PCR反应.在一些特别优选的实施方案中，所述信号扩增反应是侵入性切割(invasivecleavage,INVADER)测定法。在其他实施方案中，在任一反应起始之前加入用于组合式靶和信号扩增反应的试剂。在某些实施方案中，靶扩增反应在20个循环后结束。在一些优选的实施方案中，靶扩增反应在15个循环后结束。在一些特别优选的实施方案中，靶扩增反应在第11个循环后结束。在一些实施方案中，在加入其余的测定法组分之前将一些组分预先分配于反应容器中。在优选的实施方案中，在反应容器中干燥预先分配的试剂。在特别优选的实施方案中，所述预先分配的试剂包括一种或多种INVADER测定法试剂。在一些实施方案中，反应容器包括微观流体卡(microfluidiccard)。在优选的实施方案中，反应容器包括被设置成用于离心或向心分布或操控流体反应和反应组分的微观流体卡。在其他实施方案中，本发明提供了用于例如在单个反应或反应容器中进行多染料多重FRBTINVADER测定法的方法和组合物。在一些优选的实施方案中，对合成的靶进行多重FRET测定法。在其他优选的实施方案中，对核酸片段靶例如PCR扩增子进行多重FRET测定法。在一些特别优选的实施方案中，对基因组DNA靶进行多重FRET测定法。在其他优选的实施方案中，对RNA靶进行多重FRET测定法。在一些特别优选的实施方案中，所述多重FRET测定法是四重反应。在一些实施方案中，可以以预先分配的形式(即，预先进行测量以用于该过程的步骤中而无需再测量或再分配)提供一种或多种INVADER测定法试剂。在一些实施方案中，将所选择的INVADER测定法试剂组分混合并且一起预先分配。在其他实施方案中，在优选的实施方案中，对预先分配的测定法试剂组分进行预先分配并提供于反应容器(包括但不限于反应管或孔如微量滴定板中的孔)中。在特别优选的实施方案中，在反应容器中干燥(例如，烘干或冻干)预先分配的INVADER测定法试剂组分.在一些实施方案中，以试剂盒的形式提供INVADER测定法试剂。如此处所用的，术语"试剂盒"是指用于递送材料的任何递送系统。在反应测定法的情况下，这样的递送系统包括允许从一个地方至另一个地方贮存、运输或递送反应试剂(例如，合适的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，緩沖液、施行该测定法的书面说明书等)的系统。例如，试剂盒包含一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的封围物(例如，盒子)。如此所用的，术语"分部式试剂盒(fragmentedkit)"是指包含两个或更多个分开的容器的递送系统，所述容器各装有全部试剂盒组分的亚部分(subportion)。可一起或分开地将所述容器递送至想要的接受者。例如，第一个容器可装有用于测定法的酶，而第二个容器装有寡核苷酸。术语"分部式试剂盒"意在涵盖装有在联邦食品、药品和化妆品法案(FederalFood,Drug,andCosmeticAct)的条款520(e)的管制之下的分析物特异性试剂(ASR，s)的试剂盒，但并不局限于此。事实上，在术语"分部式试剂盒"中包括任何包含两个或更多个分开的容器的递送系统，所述容器各装有全部试剂盒组分的亚部分。相反地，"组合式试剂盒(combinedHt)"是指在单个容器中(例如，在装有各想要的组分的单个盒子中)装有反应测定法的所有组分的递送系统。术语"试剂盒"包括分部式试剂盒和组合式试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了包含一种或多种对于实施本发明所必需的组分的INVADER测定法试剂盒。例如，本发明提供了用于贮存或递送对于实施INVADER测定法所必需的酶和/或反应组分的试剂盒。该试剂盒可包含对于测定法所必需的或所想要的任何和所有组分，包括但不限于试剂本身、緩沖液、对照试剂(例如，组织样品、正和负对照靶寡核苷酸等)、固体支持物、标签、文字和/或图示的说明书和产品信息、抑制剂、标记和/或检测试剂、包装环境控制物(例如，冰、干燥剂等)，等等。在一些实施方案中，试剂盒提供所需组分的亚组，其中期望用户可提供其余的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含两个或更多个分开的容器，其中每个容器装有待递送的组分的亚组。例如，第一个容器(例如，盒子)可包含酶(例如，在合适的贮存緩冲液和容器中的结构特异性切割酶)，而第二个盒子可包含寡核苷酸(例如，INVADER寡核苷酸、探针寡核苷酸、对照靶寡核苷酸等)。在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的乾核酸的方法，其包括在所述靶核酸在单步反应中被检测到的条件下，将样品暴露于检测测定法试剂，其中所述单步反应包括反转录反应、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应。在优选的实施方案中，所述单步反应在单个反应管中发生。在一些实施方案中，单步反应包括多用途寡核華酸(multipurposeoligonucleotide)，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸(例如，侵入性切割反应中的探针或INVADERoligo)。在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的靶核酸的方法，其包括在所迷靶核酸，如果存在，在单步反应中被检测到的条件下，将所述样品暴露于检测测定法试剂，其中所述单步反应包括反转录反应、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应。在一些实施方案中，样品是未纯化的体液。在一些实施方案中，所述液体包括血液。在一些实施方案中，聚合酶链式反应具有少于20个的扩增循环。在一些实施方案中，聚合酶链式反应具有少于15个的扩增循环。在优选的实施方案中，聚合酶链式反应具有少于12个的扩增循环。在一些实施方案中，单步反应包括多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是哺乳动物基因组DNA。在一些实施方案中，所述靶核酸来自病原体。在一些实施方案中，所述靶核酸来自植物。在一些实施方案中，通过荧光来检测所述靶核酸。在一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶、聚合酶、5'核酸酶和緩沖液。在一些实施方案中，所述緩沖液的氯化钾浓度为0mM。本发明提供了用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，其包含下列中的一种或多种逆转录酶、聚合酶、5，核酸酶、设置用于在所述靶核酸存在的情况下形成侵入性切割结构的寡核苷酸和允许样品中所述靶核酸的反转录和可检测的扩增的緩沖液.在一些实施方案中，5'核酸酶包括FEN-1内切核酸酶。在一些实施方案中，所述緩沖液的氯化钾浓度为0mM。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含扩增引物。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷本发明还提供了用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，其包含样品和多用途寡核苷酸，所述多用途寡核苷酸被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。本发明还提供了用于靶核酸的多重检测的方法，其包括a)在微观流体卡中提供反转录、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法试剂，其中所述试剂被设置用于反转录、扩增和检测所述靶核酸；b)使用离心力将怀疑含有所述靶核酸的样品暴露于所述试剂；和c)检测所述把核酸的存在或不存在。在一些实施方案中，所述暴露包括进行20个或更少循环的聚合酶链式反应。在一些实施方案中，所述试剂包括逆转录酶、聚合酶和5'核酸酶。在一些实施方案中，5'核酸酶包括FEN-1内切核酸酶。本发明还提供了包含酶组合物的试剂盒，其中所述酶组合物包含一种或多种具有逆转录酶活性和FEN-1内切核酸酶活性的酶。在一些实施方案中，试剂盒包含逆转录酶。在一些实施方案中，试剂盒包含FEN-1内切核酸酶。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含聚合酶。本发明还提供了用于定量样品中的靶核酸序列的方法，其包括在所述革巴核酸在单步反应中被定量的条件下，将所述样品暴露于检测测定法试剂，其中所述单步反应包括反转录反应、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应。在一些实施方案中，所述定量确定相对于所述样品中细胞核酸序列的量来说所述靶核酸序列的量。在一些实施方案中，所述测定法试剂包括多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。附图描述下面的附图形成了本说明书的一部分，并用于进一步证明本发明的某些方面和实施方案。通过参考这些附图中的一个或多个以及此处提供的具体实施方案的描述可更好地理解本发明。图l显示了INVADER测定法的实施方案的示意图。在第一反应中，靶分子(划阴影线的矩形)与侵入性探针(空心矩形)和包含靶特异性区域(空心矩形)和5'翼片(flap)(实心矩形)的第一探针(pri歸ryprobe)形成重叠-翼片(overlap-flap)结构。该重叠-翼片被结构特异性5'核酸酶切割。由箭头所示的重叠-翼片结构的切割位点位于第一探针的靶特异性区域的5'末端核苷酸之后。为进行SNP鉴定，将探针之间的重叠定位在与多态性位点(X)相对的位置。如果X核苷酸不与笫一探针互补，那么不发生特异性切割。在第二反应中，经切割的5'翼片与用染料(D)和猝灭剂(Q)标记的FRET盒(灰色线)形成重叠-翼片结构。通过5'核酸酶切割FRET盒而释放未猝灭的染料。半环形箭头表明信号扩增所必需的寡核苷酸周转过程。类似的级联反应(未显示)用于在双重(biplex)INVADER测定法中检测可选择的SNP核苷酸。图2显示了对于PCR5，扩增系数的对数/gF对PCR循环次数"的依赖性。图3A显示了对于PCR1()、PCR2(O)、PCR4(■)和PCR5(□)，引物浓度c对/g尸的影响。图3B显示了使用3A中所显示的数据的//7^-Z"和c之间的关系。图4显示了，在实施例7中所描述的反应中，8个基因组DNA样品的净FAM和REDINVADER测定法信号的散布图。图5显示了，在实施例7中所描述的反应中，作为PCR靶长度的函数，对于161个成功的INVADER测定法，每等位基因的经标准化的净RED荧光信号.图6显示了，在实施例7中所描述的反应中，8个DNA样品的净FAM和RED信号的散布图。图7所显示的图展示了按照实施例8的方法进行的组合式靼和信号扩增反应的结果。图8显示了流程图，其概述了为生产用于多重PCR的引物组而可施行的步骤。图9A和9B所显示的图展示了按照实施例8的方法进行的组合式多重靶和信号扩增反应的结果。图IO所显示的图展示了实施例9中所描述的四重INVADER测定法的结果。图11A-11G所显示的图展示了微观流体卡中多重PCR所扩增的乾DNA的INVADER测定法检测的结果。图12A-12G所显示的图展示了微观流体卡中组合式多重PCR和INVADER测定法信号扩增反应的结果。定义为了帮助理解本发明，下面定义了许多术语和短语如此处所用的，术语"SNP"、"SNPs"或"单核苷酸多态性"是指生物(例如，人)基因组中特定位置上的单个碱基的改变。"SNPs"可位于基因组中不编码基因的部分中。可选择地，"SNP，，可位于基因的编码区中。在该情况下，"SNP"可改变RNA或与其关联的蛋白质的结构和功能。如此处所用的，术语"等位基因"是指给定序列的变体形式(例如，包括但不限于，包含一个或多个SNPs的基因)。大量的基因在群体中以多个等位基因形式存在。携带基因的2个不同等位基因的二倍体生物被认为对于该基因来说是杂合的，而纯合子携带相同等位基因的2个拷贝，如此处所用的，术语"连锁"是指染色体上两个或更多个标记物(例如，基因)的邻近。如此处所用的，术语"等位基因频率"是指在给定的群体(例如，特定的性别、种族或人种群)中给定的等位基因(例如，包含SNP的序列)出现的频率。和其他群体相比，某些群体可在更高百分比的其成员中包含给定的基因。例如，发现在称为BRCA1的乳腺癌基因的一个特定突变在一般的犹太人群体中以1%的频率存在。相比之下，在一般的美国人口中具有BRCA1的任何突变的人的百分比据估计为0.1%至0.6%。两种其他的突变(一种在BRCA1基因中，一种在称为BRCA2的另一个乳腺癌基因中)在德裔犹太人群体中具有更高的流行率，这使携带这三种突变中一种突变的总风险达到2.3%。如此处所用的，术语"计算机分析(insilicoanalysis)"是指使用计算机处理器和计算机存储器进行的分析。例如，"计算机SNP分析"是指使用计算机处理器和存储器的SNP数据的分析。如此处所用的，术语"基因型"是指生物的实际基因组成(例如，就遗传基因座上携带的特定等位基因来说)。基因型的表达产生生物的物理表现和特征——"表型"。如此处所用的，术语"基因座"是指基因或任何其他经表征的序列在染色体上的位置。如此处所用的，术语"疾病"或"疾病状态"是指偏离被认为是不利的:件下对i影响的;体有害的状况(例如，腹泻、恶心、发烧、疼痛和发炎等)。如此处所用的，术语"治疗"，当指医疗行为过程时，是指因为怀疑的、预期的或存在的疾病状态或者其中存在疾病状态的风险或可能的风险而对于受影响的个体所采取的步骤或行为。可在预期出现疾疗，其可包括但不限于预防、改善、緩解或治愈步骤，术语"疗法"是指特定的治疗过程。术语"基因"是指包含对于产生多肽、RNA(例如，rRNA、tRNA等)或前体所必需的编码序列的核酸(例如，DNA)序列。多肽、RM或前体可以由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要全长序列或片段的想要的活性或功能特征(例如，配体结合、信号转导等)得到保留。该术语也涵盖了结构基因的编码区和在5'和3'末端邻近编码区的包含序列(includingsequence)，所述包含序列在任一末端上离编码区大约1kb，从而使该基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'且存在于mRNA上的序列被称为5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游且存在于mRNA上的序列被称为3'非翻译序列。术语"基因"涵盖了基因的cDNA和基因组形式。基因的基因组形式或克隆包含被称为"内含子"或"间插区"或"间插序列"的非编码序列间断的编码区。内含子是当基因被转录成不均一核RNA(hnRNA)时所包含的片段；内含子可包含调控元件例如增强子。内含子被从细胞核或初级转录物中除去或"剪接掉"；因此在信使RNA(mRNA)转录物中通常不存在内含子。mRNA在翻译过程中起着在新生多肽中确定氨基酸的序列或顺序的作用。基因的被转录部分中的变异(例如，突变、SNPS、插入、缺失)在所产生的RMs(例如，hnRNAs、mRNAs、rRMs、tRNAs)的相应部分中得到反映并且通常可以被检测到。此处引用的短语"氨基酸序列"是指天然发生的蛋白质分子的氨基酸序列，氨基酸序列和类似的术语，例如多肽或蛋白质，并不表示将氨基酸序列限定于与所述的蛋白质分子相关的完整的、天然的氨基酸序列。除了包含内含子以外，基因的基因组形式还可包含位于存在于RNA转录物上的序列的5'和3'末端上的序列。这些序列称为"侧翼"序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5'或3。。5'侧翼区域可包含调控序列例如控制或影响基因的转录的启动子和增强子.3'侧翼序列可包含指导转录的终止、转录后切割和聚腺苷酸化的序列。术语"野生型"是指基因或基因产物，所述基因或基因产物具有当从天然发生的来源分离时的该基因或基因产物的特征。野生型基因是在群体中最常观察到的从而被专断地设定为该基因的"正常"或"野生型"形式的基因。相反地，术语"修饰的"、"突变体"和"变体"是指当与野生型基因或基因产物相比较时，展示出序列和/或功能特性的修饰(即，改变的特征)的基因或基因产物。要指出的是，可分离天然发生的突变体；通过当与野生型基因或基因产物相比较时，它们具有改变的特征这样的事实来鉴定这些突变体。如此处所用的，术语"编码...的核酸分子"、"编码...的DNA序列"和"编码...的DNA"是指沿着脱氧核糖核酸链的脱氧核糖核普酸的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸的顺序。在该情况下，DNA序列因此编码氨基酸序列。因为以使一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸在一个方向上通过磷酸二酯键附着至其相邻者的3'氧的方式使单核苷酸反应从而生成寡核苷酸或多核苷酸，所以认为DNA和RNA分子具有"5'末端"和"3'末端"。因此，如果其5'磷酸不连接至单核苷酸戊糖环的3'氧，则寡核苷酸或多核普酸的末端被称为"5'末端"，并且如果其3'氧不连接至随后的单核苷酸戊糖环的5'磷酸，则被称为"3'末端"。如此处所4吏用的，核酸序列，即使位于更大的寡核苷酸或多核苷酸的内部，也可被认为具有5'和3'末端。在线性或环状DNA分子中，离散的元件被称为处于"下游"或3'元件的"上游"或5'。该术语反映了转录沿着DNA链以从5'至3'的方式进行。指导所连接的基因的转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5'或上游。然而，增强子元件即使当位于启动子元件和编码区的3'时也可发挥其作用。转录终止和聚腺苷酸化信号位于编码区的3'或下游。如此处所用的，术语"具有编码基因的核苷酸序列的寡核苷酸"和"具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸"是指包含基因的编码区的核酸序列，换句话说，编码基因产物的核酸序列.编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷例如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等，如果需要，可位于(即，有义链)或双链的.合适的控制元件非常邻近基因的编码区的位置以允许转录的正确起始和/或初级RNA转录物的正确加工。可选择地，在本发明的表达载体中使用的编码区可包含内源的增强子/启动子、剪接点、间插序列、聚腺苷酸化信号等，或内源和外源的控制元件的组合。如此处所用的，术语"互补"或"互补性"用于涉及通过碱基配对法则建立联系的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，对于序列"5,+G-T-3,，，，其与序列"3'-T-C-A-5'"互补。互补性可以是"部分的"，其中核酸的碱基中只有一些按照碱基配对法则相匹配。或者，核酸之间可存在"完全"或"全部，，互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有重大影响。这在扩增反应以及依赖于核酸之间的结合的检测方法中是特别重要的。术语"同源性"是指互补的程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一)。部分互补序列是至少部分地抑制完全互补序列与靶核酸杂交的序列，并适合于使用功能术语"基本上同源的"。术语"结合的抑制"，当用于涉及核酸结合时，是指由同源序列竟争对靶序列的结合而导致的结合的抑制。可使用在低严紧性条件下的杂交测定法(Southern或Northern印迹法、溶液杂交法等)来检查完全互补序列与靶序列的杂交的抑制。基本上同源的序列或探针在低严紧性条件下将竟争和抑制完全同源序列与靶的结合(即，杂交)。这并非说低严紧性条件是允许非特异性结合的条件；低严紧性条件要求两个序列相互之间的结合是特异性(即，选择性)的相互作用。可通过使用甚至缺少部分互补性程度(例如，低于大约30%的同一性)的第二个靶来检测非特异性结合的不存在；在非特异性结合不存在的情况下，探针将不与第二个非互补的靶杂交。本领域熟知，可使用许多等效的条件来包括低严紧性条件；所考虑的因素例如为探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)以及盐和其他组分(例如，曱酰胺、疏酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)的浓度，并且可以改变杂交溶液以产生与上面列出的条件不同但等效的低严紧性杂交条件.此外，本领域已知在高严紧性条件下促进杂交的条件(例如，增加杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中使用曱酰胺，等等)。当用于涉及双链核酸序列例如cDNA或基因组克隆时，术语"基本上同源的"是指可在如上所述的低严紧性条件下与双链核酸序列的^f壬一条链或两条链杂交的任何探针。基因可产生出通过初级RNA转录物的不同剪接而产生的多种RNA种类。作为相同基因的剪接变体的cDNAs将包含序列同一或完全同源的区域(表示在两种cDNA上存在相同的外显子或相同外显子的部分)和完全不同一的区域(例如，表示在cDNAl上存在外显子"A"，而cDNA2却改为包含外显子"B")。因为两种cDNA包含序列同一的区域，所以它们将都与探针杂交，所述探针来源于完整基因或包含在两种cDNA上都发现的序列的基因部分；因此两种剪接变体基本上与这样的探针同源并且相互同源。当用于涉及单链核酸序列时，术语"基本上同源的"是指可在如上所述的低严紧性条件下与该单链核酸序列杂交的任何探针(即，其是该单链核酸序列的互补序列)。如此处所用的，术语"杂交"用于涉及互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间结合的强度)受到例如下列因素的影响核酸之间的互补程度，所涉及的条件的严紧性，所形成的杂交物的Tm，和核酸内的G:C比。如此处所用的，术语"Tn"用于表示"解链温度"。解链温度是一群双链核酸分子有一半解离成单链时所处的温度。计算核酸的L的公式在本领域内是熟知的。如由标准参考文献所指出的，当核酸在1MNaCl的水溶液中时，可通过公式Tra-81.5+0.41(%G+C)来简单地估算"L值(参见例如，Anderson和Young,QuantitativeFilterHybridization,肠/e/c爿"？酬r油'z"/'o/7[1985])。其他参考文献包括考虑结构和序列特征来计算L的更复杂的计算方法.如此处所用的，术语"严紧性"用于表示进行核酸杂交所处的温度、离子强度和存在其他化合物例如有机溶剂的条件。本领域技术人员将认识到，可通过单个地或一致地改变刚刚所描述的参数来改变"严紧性"条件。使用"高严紧性"条件时，只在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间才发生核酸碱基配对(例如，在具有大约85-100%同一性，优选地大约70-100%同一性的同源物之间可发生在"高严紧性"条件下的杂交)。使用中等严紧性条件时，核酸碱基配对将在具有中间频率的互补碱基序列的核酸之间发生(例如，在具有大约50-70%同一性的同源物之间可发生在"中等严紧性，，条件下的杂交)。因此，对于来源于在遗传上不同的生物的核酸，通常需要"弱，，或"低"严紧性的条件，因为互补序列的频率通常较低。"高严紧性条件"，当用于涉及核酸杂交时，包括等效于下列情况的条件当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42C下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04H20和1.85g/1EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5%SDS、5XDenhardt's试剂和100Hg/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中进行结合或杂交，然后在42匸下在含有0.IXSSPE、1.0%SDS的溶液中进行洗涤。"中等严紧性条件"，当用于涉及核酸杂交时，包括等效于下列情况的条件当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42t:下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P041120和1.85g/1EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.5%SDS、5XDenhardt's试剂和100Mg/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中进行结合或杂交，然后在42。C下在含有1.OXSSPE、1.0%SDS的溶液中进行洗涤。"低严紧性条件"包括等效于下列情况的条件当使用长度为大约500个核苷酸的探针时，在42匸下在由5XSSPE(43.8g/1NaCl，6.9g/1NaH2P04H20和1.85g/1EDTA，用NaOH将pH调节至7.4)、0.1%SDS、5XDenhardt's试剂[每500ml50XDenhardt's含有5gFicoll(Type400，Pharamcia)、5gBSA(FractionV;Sigma)]和100g/ml变性的鲑精DNA组成的溶液中进行结合或杂交，然后在42r下在含有5XSSPE、0.1%SDS的溶液中进行洗涤。下列术语用于描述两个或更多个多核苷酸之间的序列相互关系"参照序列"、"序列同一"、"序列同一性百分比"和"基本上同一"。"参照序列"是用作序列比较的基础的确定的序列；参照序列可以是更大序列的子序列(subset)，例如，序列列表中给出的全长cDM序列的片段，或者可包含完整的基因序列，通常，参照序列的长度为至少20个核苷酸，常常为至少25个核苷酸，并通常为至少50个核苷酸。因为两个多核苷酸可各自(1)包含在所述两个多核苷酸之间相似的序列(即，完整的多核苷酸序列的部分)，和(2)还可包含在两个多核苷酸之间不同的序列，通常通过在"比较窗口"的范围内比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性，来进行两个(或更多个)多核苷酸之间的序列比较。"比较窗口"，如此处所用的，是指至少20个连续核苷酸位置的概念上的片段，其中可将多核苷酸序列与至少20个连续核苷酸的参照序列进行比较，并且其中当与参照序列(其不包含添加或缺失)相比较时，比较窗口内的多核苷酸序列的部分可包含20%或更少的添加或缺失(即，缺口)以获得两个序列的最佳比对。可通过Smith和Waterman的局部同源性算法[Smith和Waterman,Jdy.^/A船M.2:482(1981)]、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法[Needleman和Wunsch，/.編.5iol48:443(1970)]、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法[Pearson和Lipman，户roc.A"a〃.力c".Sc/(US.丄j85:2444(1988)]、通过这些算法的计算机化执行(WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison，Wis.)或通过目视检查来进行用于对齐比较窗口的序列的最佳比对，并选择通过各种方法产生的最佳比对(即，在比较窗口的范围内导致最高的同源性百分比)。术语"序列同一"是指两个多核苷酸序列在比较的窗口范围内是相同的(即，在每个核苷酸的基础上)。这样来计算术语"序列同一性百分比"，即在比较窗口的范围内比较两个最佳排列的序列，确定在两个序列中都出现相同的核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)的位置的数目以产生匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)，并将所述结果乘以100，从而产生序列同一性百分比。当用于多核苷酸时，术语"基本上同一"是指多核苷酸序列的特征，其中多核苷酸包含这样的序列，所述序列，当在至少20个核苷酸位置的比较窗口范围内，通常至少25至50个核苷酸的窗口范围内与参照序列比较时，具有至少85°/。的序列同一性、优选地至少90-95%的序列同一性、更通常至少99%的序列同一性，其中通过将参照序列与多核苷酸序列比较来计算序列同一性百分比，所述多核苷酸序列可包含比较窗口范围内总共20%或更少的参照序列的缺失或添加。参照序列可以是更大序列的子序列，例如，作为全长序列的剪接变体。当用于多肽时，术语"基本上同一"是指，两个肽序列，当例如使用缺省缺口权重通过程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，共享至少80%的序列同一性、优选地至少90%的序列同一性，更优选地至少95%的序列同一性或更高的同一性(例如，99%的序列同一性)。优选地，不相同的残基位置的差异在于保守性氣基酸置换。保守性氨基酸置换是指具有相似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族側的氨基酸的组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸的组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸的组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸的组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸的组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸置换组是缬氛酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。"扩增"是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。其与非特异性模板复制(即，为模板依赖性的但不依赖于特定模板的复制)形成鲜明的对比。此处，模板特异性不同于复制的保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性.模板特异性通常根据"靶"特异性来描述。靶序列在其被寻求以从其他核酸中分选出来的意义上来说是"乾"。已设计出了主要用于该分选的扩增技术。通过酶的选择在大多数扩增技术中获得了模板特异性。扩增酶是在其使用的条件下只加工在核酸的异质混合物中的特定核酸序列的酶。例如，在Q复制酶的情况下，MDV-1RNA是该复制酶的特异性才莫板(D.L.Kacian等人，^〃，5W.yW69:3038[1972])。其他核酸将不被该扩增酶复制。类似地，在T7RNA聚合酶的情况下，该扩增酶对其自身的启动子具有严格的特异性(M.Chamber1in等人，A^Mre228:227[1970])。在T4连接酶的情况下，当连接接合处存在寡核苷酸或多核苷酸底物与模板之间的错配时，该酶将不连接所述两个寡核苷酸或多核苷酸(D.Y.Wu和R.B.Wallace,&"0顶/"4:560[1989])。最后，ra《和户尸w聚合酶，由于其在高的温度下起作用的能力，被发现展示出对于被引物结合从而被定义的序列的高度特异性；(H.A.Erlich(ed.)，iOrec力/2o/o^r，StocktonPress[1989])。如此处所用的，术语"可扩增的核酸"用于指可被任何扩增方法扩增的核酸。预期"可扩增的核酸"通常将会包括"样品模板"。如此处所用的，术语"样品模板"是指来源于就"靶"(下面定义)的存在接受分析的样品的核酸。相反地，"背景模板"用于指除了样品模板外的其他核酸，其可存在或不存在于样品中。背景模板最常见地是因疏忽造成的。其可以是遗留物的结果，或其可以是由于存在寻求从样品中纯化除去的核酸污染物而造成的。例如，来自生物的但不是被检测的核酸可作为背景存在于受试样品中。如此处所用的，术语"引物"是指寡核苷酸(无论是如在纯化的限制性消化物中天然发生的，还是合成产生的)，当被置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下(即，在核苷酸和诱导剂例如DM聚合酶存在的情况下和在合适的温度和pH下)，所述寡核苷酸能够用作合成的起始点.为了扩增的最大效率，引物优选地是单链的，但可选择地可以是双链的。如果是双链，在被用于制备延伸产物前，首先应处理引物以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应当长至足以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度依赖于许多因素，包括温度、引物的来源和所使用的方法。如此处所描述的，术语"探针"或"杂交探针"是指寡核苷酸(即，核苷酸的序列)(无论是如在纯化的限制性消化物中天然发生的，还是合成、重组或通过PCR扩增产生的)，所述寡核苷酸能够，至少部分地，与另一个目的寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针用于特定序列的检测、鉴定和分离。在一些优选的实施方案中，用"报告分子"标记用于本发明的探针，这样其在任何检测系统中都可被检测，所述检测系统包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定法)、荧光、放射性和发光系统。这并不意味着本发明限定于任何特定的检测系统或标记。如此处所用的，术语"耙"是指被检测或表征的核酸序列或结构。如此处所用的，术语"聚合酶链式反应"("PCR")是指K.B.Mullis(参见例如，美国专利4,683,195、4，683，202和4，965，188，在此引用作为参考)的方法，其描述了用于在基因组DNA的混合物中增加靶序列的片段的浓度而无需克隆或纯化的方法。用于扩增靶序列的该方法包括，向包含想要的靶序列的DNA混合物中引入大大过量的两种寡核苷酸引物，然后在DNA聚合酶存在的情况下进行精确的一系列的热循环。这两种引物与其各自的双链靶序列的链互补。为了有效扩增，使混合物变性，然后引物与其在靶分子内的互补序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以形成新的互补链对。可重复变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤许多次(即，变性、退火和延伸构成了一个"循环"；可存在许多"循环")以获得高浓度的想要的靶序列的扩增片段。通过引物相互之间的相对位置来确定想要的靶序列的扩增片段的长度，因此，该长度是可控制的参数。根据该方法的重复方面，所述方法被称为"聚合酶链式反应"(下文中称为"PCR"),因为想要的靶序列的扩增片段成为混合物中的占优势的序列(在浓度方面)，所以其被称为"PCR扩增的"。借助于PCR，可能扩增基因组DNA中单拷贝的特定靶序列至可通过几种不同的方法(例如，与经标记的探针杂交；整合入生物素化的引物，然后进行抗生物素蛋白-酶缀合物检测；将"P-标记的脱氧核苷酸三磷酸，例如dCTP或dATP整合入扩增的片段中)进行检测的水平。除了基因组DNA外，可用合适的引物分子组扩增任何寡核普酸或多核苷酸序列。特别地，由PCR方法本身产生的扩增片段本身是随后PCR扩增的有效模板。如此处所用的，术语"PCR产物"、"PCR片段"和"扩增产物"是指在完成两轮或更多轮变性、退火和延伸的PCR步骤后所得的化合物的混合物。这些术语包括其中已经扩增了一个或多个靼序列的一个或多个片段的情况。如此处所用的，术语"扩增试剂"是指除了引物、核酸模板和扩增酶以外的扩增所需的试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、緩冲液等)。一般地，将扩增试剂和其他反应组分一起置于和装入反应容器(试管、微孔等)中。如此处所用的，术语"反应容器"是指在其中可进行反应的系统，包括但不限于试管、孔、微孔(例如，微量滴定测定板例如96孔、384孔和1536孔测定板中的孔)、毛细管、纤维例如光纤的末端、微观流体装置例如微观流体芯片(fluidicchip)、药筒(cartridge)和卡(包括但不限于例如在下列文献中所描述的Woudenberg等人的美国专利6,126，899;Bedingham等人的美国专利6，627，159、6，720，187和6，734，401;Mian等人的美国专利6，319，469和6,709，869;Wilding等人的美国专利5，587，128和6,660,517)或者任何表面(包括但不限于玻璃、塑料或硅表面、小珠、微芯片或非固体表面，例如凝胶或树枝状聚合物)上的测试位置。如此处所用的，此处所用的术语"重组DAN分子"是指由通过分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成的DNA分子。如此处所用的，术语"反义"用于涉及与特定的RNA序列(例如，mRNA)互补的RNA序列。术语"反义链"用于表示与"有义"链互补的核酸链。标记(-)(即，"负")有时用于表示反义链，而标记(+)有时用于表示有义(即，"正")链。术语"分离的"，当用于涉及核酸时，如在"分离的寡核普酸"或"分离的多核苷酸"中，是指从至少一种污染性核酸中鉴定和分离出的核酸序列，所述分离出的核酸序列在其天然来源中通常与所述污染性核酸相联合。分离的核酸以与其在自然界中被发现的形式或状况不同的形式或状况存在。相反地，未分离的核酸是以其在自然界中存在的状态被发现的核酸例如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如，基因)被发现在宿主细胞染色体上与相邻基因接近；RNA序列，例如编码特定蛋白质的特定mRAN序列，被发现在细胞中为与编码许多蛋白质的许多其他mRM在一起的混合物。然而，编码多肽的分离的核酸包括，例如，这样的核酸，该核酸存在于通常表达该多肽的细胞中，在所述细胞中该核酸位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置上，或者其侧翼另外连接有与天然状态下发现的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以以单链或双链的形式存在。当使用分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸表达蛋白质时，寡核苷酸或多核苷酸最低限度将包含有义或编码链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是单链的)，也可包含有义和反义链(即，寡核苷酸或多核苷酸可以是双链的)。如此处所用的，术语"部分"，当涉及核苷酸序列(如在"给定的核普酸序列的部分"中)时，是指该序列的片段。片段在大小上可在从4个核苷酸至完整的核苷酸序列减去一个核苷酸的范围内变化(例如，IO个核苷酸、11.....20、…)。如此处所用的，术语"纯化的"或"纯化"是指从样品中除去污染物。如此处所用的，术语"纯化的，，是指从其天然环境中取出、分离或分开的分子(例如，核酸或氨基酸序列).因此，"分离的核酸序列"是纯化的核酸序列。"基本上纯化的"分子是至少60%地不含、优选地至少75%地不含和更优选地至少90%地不含天然地与其相联合的其他组分.术语"重组蛋白"或"重组多肽"，如此处所用的，是指从重组DNA分子表达的蛋白质分子。术语"天然蛋白质"，如此处所用的，表示蛋白质不包含由栽体序列编码的氨基酸残基；即天然蛋白质只包含当其天然地发生时在该蛋白中发现的那些氨基酸。天然蛋白质可通过重组方法产生或可从天然发生的来源中分离。如此处所用的，术语"部分，，，当用于指蛋白时(如在"给定的蛋白的部分"中)时是指该蛋白的片段。所述片段可在大小上在从4个连续氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内变化。术语"Southern印迹法"是指这样一种DNA的分析方法，即在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶上按照大小对DNA进行分级，然后将DNA从凝胶转移至固体支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用经标记的探针探查经固定的DNA以检测与所用的探针互补的DNA种类。可在电泳前用限制性酶切割DNA。电泳后，在转移至固体支持物上之前或期间可对DNA进行部分脱嘌呤和变性。Southern印迹法是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等人，Vo/ecu/arC7an//7fJZ^60r"or/她/2ua(ColdSpringHarborPress,NY，pp9.31-9.58[1989])。术语"Western印迹法"是指对固定在支持物例如硝酸纤维素或膜上的蛋白质(或多肽)的分析。将蛋白质在丙烯酰胺凝胶上跑胶以分开蛋白质，然后将蛋白质从凝胶转移至固体支持物例如硝酸纤维素或尼龙膜上。然后将经固定的蛋白质暴露于具有抗目的抗原的反应性的抗体。可通过各种方法来检测所述抗体的结合，包括使用经标记的抗体。术语"受试化合物"是指就任何想要的活性(例如，包括但不限于，治疗或预防疾病、疾患或躯体功能障碍的能力，或者改变样品的生理或细胞状态的能力)在测定法(例如，药物筛选测定法)中进行测试的任何化学实体、药物、药品等。受试化合物包含已知的和潜在的治疗性化合物。可通过使用本发明的筛选方法进行筛选来确定受试化合物是治疗性的。"已知的治疗性化合物"是指已显示(例如，通过动物试验或以前的关于给人施用的经验)在这样的治疗或预防中是有效的治疗性化合物。术语"样品"，如此处使用的，以其最广泛的意义使用。怀疑含有人染色体或与人染色体相关的序列的样品可包括细胞、从细胞分离的染色体(例如，散开的分裂中期染色体)、基因组DNA(在溶液中或结合至固体支持物例如对于Southern印迹分析)、RM(在溶液中或结合至固体支持物例如对于Northern印迹分析)、cDNA(在溶液中或结合至固体支持物)等。怀疑舍有蛋白质的样品可包括细胞、组织的部分、含有一种或多种蛋白质的提取物等。样品包括，但不限于，组织切片、血液、血液级分(例如，血清、血浆、细胞)、唾液、脑脊液、胸膜液、乳汁、淋巴、痰、精液、尿、粪便、羊膜液、绒毛膜绒毛样品(CVS)、子宫颈拭子和口腔试子(buccalswabs)。术语"标记"，如此处所用的，是指可用于提供可检测的(优选地可定量的)效果且可附着至核酸或蛋白质的任何原子或分子。标记包括但不限于染料；放射性标记例如"P;结合部分例如生物素；半抗原例如洋地黄毒苷；发光的、发磷光的或发荧光的部分；以及荧光染料，其是单独的或者与可通过荧光共振能量转移(FRET)抑制或移动发射光谦的部分相组合。标记可提供通过荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁力、酶活性等进行检测的信号。标记可以是带电荷的部分(正或负电荷)，或者可选择地，可以是电中性的。标记可包括或由核酸或蛋白质序列组成，只要包含标记的序列是可检测的。术语"信号"，如此处所用的，是指任何可检测的效果，例如可由标记或测定反应引起或提供的效果。如此处所用的，术语"检测器"是指可向用户或向系统的另一组件(例如，计算机或控制器)传送信号或效果的存在的系统或系统的组件，例如仪器(例如照相机、荧光计、电荷耦合器件、闪烁计数器等)或反应性介质(X-射线或照相胶片、pH指示剂等)。检测器可以是光度或分光光度系统，其可检测紫外光、可见光或红外光，包括荧光或化学发光；放射检测系统；光镨系统，例如核磁共振光镨学、质镨法或表面增强拉曼光谦学；诸如凝胶或毛细管电泳或者凝胶排阻层析的系统；或本领域已知的其他检测系统，或其组合。如此处所用的，术语"分配系统"是指能够将材料从一个实体转移和/或递送至另一个实体或从一个位置转移和/或递送至另一个位置的系统。例如，用于将检测板(detectionpanel)从制造商或批发商转移至用户的分配系统可包括，但不限于，包装部门、邮寄室和邮件递送系统。可选择地，分配系统可包括，但不限于，一个或多个递送交通工具和相关的递送人员、展示台(displaystand)和分配中心。在本发明的一些实施方案中，有关的当事人(例如，检测板制造商)利用分配系统以无费用的方式、以费用补助的方式或以费用减少的方式将检测板传递给用户。如此处所用的，术语"以费用减少的方式"是指以直接费用减少的方式将货物或服务传递给接受者(例如用户)。在一些实施方案中，"以费用减少的方式"是指以无费用的方式将货物或服务传递至接受者。如此处所用的，术语"以费用补助的方式"是指货物或服务的传递，其中接受者的费用的至少部分可延期或由另一方支付。在一些实施方案中，"以价格补助方式"是指以无费用的方式将货物或服务传递至接受者。如此处所用的，术语"以无费用的方式"是指以没有直接资金开支的方式将货物或服务传递给接受者。例如，当由制造商或批发商将检测板以无费用的方式提供给用户(例如研究科学家)时，用户不直接为测试付款。术语"检测"，如此处所用的，是指定量或定性地鉴定样品中的分析物(例如，DNA、RNA或蛋白质)，术语"检测测定法"，如此处所用的，是指为了检测样品中的分析物核酸而采用的试剂盒、测试或方法.当在靶分析物存在的情况下进行时，检测测定法产生可检测的信号或效应，并且所述检测测定法包括但不限于整合了杂交、核酸切割(例如，外切核酸酶或内切核酸酶)、核酸扩增、核苷酸测序、引物延伸或核酸连接这些程序的测定法。如此所用的，术语"功能性检测寡核苷酸"是指用作检测测定法的组分的寡核苷酸，其中当功能性检测寡核苷酸提供所述检测测定法的寡核苷酸组分时，所述检测测定法能够成功地检测(即，产生可检测的信号)所希望的靶核酸。这与非功能性检测寡核苷酸相反，当将非功能性检测寡核苷酸作为检测测定法的寡核苷酸组分提供时，所述非功能性检测寡核苷酸不能在针对特定靶核酸的检测测定法中产生可检测的信号。可通过在特定靶核酸存在的情况下使用检测测定法测试寡核苷酸，从而通过实验来确定寡核苷酸是否是功能性寡核苷酸。如此处所用的，术语"来源于不同受试者"，例如来源于不同受试者的样品或核酸，是指来源于多个不同个体的样品。例如，包含来自笫一个人的基因组DNA的血液样品和包含来自第二个人的基因组DNA的血液样品被认为是来源于不同受试者的血液样品和基因组DNA样品。包含来源于不同受试者的5种靶核酸的样品是包含来自5个不同个体的至少5个样品的样品。然而，所述样品还可包含来自给定的个体的多个样品。如此处所用的，术语"一起处理"，当用于涉及实验或测定法时，是指同时或相继地进行实验，其中一起(即，在相同的时间段期间)产生、收集或分析实验结果。例如，在检测测定法中一起处理位于多孔板的分开的孔中或微阵列的不同位置中的多种不同的靶序列，在所述检测测定法中同时或顺次地对样品进行检测反应并且在所述检测测定法中一起分析采集自该测定法的数据。术语"测定法数据"和"测试结果数据"，如此处所用的，是指从测定法的施行(例如，用于检测或定量基因、SNP或RNA)中收集的数据.测试结果数据可以以任何形式存在，即，其可以是原始测定法数据或经分析的测定法数据(例如，以前通过不同方法分析的数据)。还未进一步处理或分析的经收集的数据在此处称为"原始"测定法数据(例如，对应于信号例如来自芯片或反应容器上的点的荧光信号的测量的数字，或对应于峰例如峰高或面积(如来自例如质镨仪、HPLC或毛细管分离设备)的测量的数字)，而已通过进一步步骤或分析而处理过(例如，通过计算而进行标准化、比较或处理)的测定法数据被称为"分析过的测定法数据"或"输出的测定法数据"。如此处所用的，术语"数据库"是指经整理以易于检索的信息(例如，数据)的集合，其例如储存在计算机存储器中。"基因组信息数据库"是包含基因组信息的数据库，所述基因组信息包括，但不限于，多态性信息(即，关于遗传多态性的信息)、基因组的信息(即，基因组信息)、连锁信息(即，关于例如在染色体中一个核酸序列相对于另一个核酸序列的物理定位的信息)和疾病相关性信息(即，使疾病的存在或易感性与受试者的物理性状例如受试者的等位基因相关联的信息)。"数据库信息"是指被送入数据库、贮存在数据库中、在数据库中加工或从数据库中取回的信息。"序列数据库信息"是指关于核酸序列的数据库信息。如此处所用的，术语"不同的序列数据库"是指包含相互之间彼此不同的信息的两个或更多个数据库。例如，dbSNP和GenBank数据库是不同的序列数据库，因为每个包含在另一数据库中未找到的信息。如此处所用的，术语"处理器"和"中央处理单元"或"CPU"可互换使用，并且是指能够从计算机存储器(例如，ROM或其他计算机存储器)中读取程序并按照程序执行成套步骤的设备。如此处所用的，术语"计算机存储器"和"计算机存储设备"是指可被计算机处理器读取的任何储存介质。计算机存储器的实例包括，但不限于，RAM、R0M、计算机芯片、数字影像盘(digitalvideodisc)(DVD)、光盘(CD)、硬盘驱动器(HDD)和磁带。如此处所用的，术语"计算机可读取介质"是指用于储存信息和提供信息(例如，数据和指令)给计算机处理器的任何设备或系统。计算机可读取介质的实例包括，但不限于DVD、CD、硬盘驱动器、磁带和用于网络上的流媒体的服务器。如此处所用的，术语"超链接"是指从一个文件至另一个文件或者从一个文件的一个部分(或组分)至另一部分(或组分)的导航连接。一般地，超链接显示为加亮的单词或短语，所述单词或短语可通过使用鼠标在其上点击来选择，从而跳转至相关的文件或所引证的部分。如此处所用的，术语"超文本系统"是指基于计算机的信息系统，在该系统中可通过超链接将文件(和可能地其他类型的数据实体)连接在一起以形成用户可操作的(user-navigable)"网(web)"。如此处所用的，术语"因特网"是指使用标准协议的网络的任何集合。例如，所述术语包括通过成套标准协议(例如TCP/IP、HTTP和FTP)连接在一起而形成全球的分布式网络的互联(公共和/或私人的)网络的集合。尽管该术语意在表示现在普遍称为因特网的是什么，但其也嚢括可在将来产生的变化，包括对现存的标准协议的改变和增加或与其他媒体(例如，电视、广播等)的整合。该术语也意在嚢括非公共网络例如私人(例如，社团)内联网。如此处所用的，术语"环球网"或"网"通常是指(i)通过因特网可达到的互联的、用户可视的超文本文件(通常称为网络文件或网页)的分布式集合，和(ii)使用标准的因特网协议为用户提供对这些文件的访问的客户和服务器软件组成部分。目前，用于允许放置和获得网络文件的应用的主要标准协议是HTTP,并且使用HTML编码网页。然而，术语"网"和"环球网"意在包括可用于取代(或对其作添加)HTML和HTTP的未来的标记语言和传输协议。如此处所用的，术语"网站，，是指使用环球网的标准协议在网络上提供信息内容服务的计算机系统。一般地，网站对应于特定的因特网域名且包含与特定组织相关的内容。如此处所用的，所述术语通常意在包括(i)在网络上提供信息内容服务的硬件/软件服务器组成部分，和(ii)与服务器组成部分相互作用以为网站用户提供服务的"后端"硬件/软件组成部分，包括任何非标准或专门的组成部分。如此处所用的，术语"HTML"是指超文本标记语言，该语言是用于将呈文粘贴至和将属性连接至文件内的信息内容中的标准编码协定和成套代码。HTML基于SGML(标准通用标记语言)。在文件编辑阶段，HTML代码(称为"标签")被嵌入文件的信息内容内。当随后将网络文件(或HTML文件)从网络服务器转移至浏览器时，所述代码由浏览器进行解释，并且所述代码用于解析和显示文件。此外，在明确规定网络浏览器如何显示文件时，HTML标签可用于建立与其他网络文件的连接(通常称为"超链接")。如此处所用的，术语"XML，，是指可扩展标记语言，即和HTML—样是基于SGML的应用配置文件(applicationprofile)。XML与HTML的不同在于信息提供者可随意定义新的标签和属性名称；可将文件结构嵌套至任何复杂水平；任何XML文件可包含其语法的任选的描述以用于通过需要进行结构验证的应用的用途。XML文件由称为实体的储存单元组成，所述储存单元包含解析的数据或未解析的数据。解析的数据由字符组成，其中一些形成字符型数据，其中一些形成标记。标记编码文件的储存布局(storagelayout)和逻辑结构的描述。XML提供一种机制，从而对储存布局和逻辑结构施加限制以确定对逻辑结构的限制和支持预先确定的储存单元的使用。称为XML处理器的软件模块用于读取XML文件和提供对其内容和结构的访问。如此处所用的，术语"HTTP"是指超文本传输协议，该协议是用于浏览器和网络服务器之间的信息(例如HTML文件和对这些文件的客户请求)交换的标准的环球网客户-服务器协议。HTTP包括许多不同类型的信息，其可从客户发送至服务器以请求不同类型的服务器动作。例如具有格式GET的"GET"信息使服务器返回位于特定URL的文件或文档。如此处所用的，术语"URL"是指统一资源定位器(UniformResourceLocator)，其是完全确定文档或其他资源在因特网上的位置的唯一地址。URL的一般格式是协议〃机器地址端口/路径/文件名。端口说明(portspecification)是任选的，并且如果用户没有进入任何端口，则无论服务器被指定为何种协议，浏览器默认为标准端口。例如，如果确定HTTP为协议，那么浏览器将使用HTTP默认端口80。如此处所用的，术语"PUSH技术"是指用于在网络上将数据传送至用户的信息传播技术。与其中客户浏览器在网页被发送前应当进行请求的环球网("pull"技术)相反，PUSH协议通常基于由用户预先指定的信息自动地将信息内容传送至用户计算机。如此处所用的，术语"通讯网络"是指允许信息从一个位置传输至另一个位置的任何网络。例如，用于将信息从一台计算机传递至另一台计算机的通讯网络包括使用电子、光学、卫星传播等传送信息的任何公共或私人网络。作为通讯网络的一部分从而其可直接或间接将信息从一个设备传输至另一个设备的两个或更多个设备被认为相互之间处于"电子通讯中"。包含多台计算机的计算机网络可具有中央计算机("中心结点")，该中央计算机将信息加工至一台或多台执行特定任务的子计算机(sub-computer)("子节点")。一些网络包含相互之间处于"不同地理位置"的计算机，即所述计算机位于不同的物理位置(即，不是物理上相同的计算机，例如位于不同的国家、州、城市、房间等)。如此处所用的，术语"检测测定法组分"是指能够施行检测测定法的系统的组成部分。检测测定法组分包括，但不限于，杂交探针、緩冲液等。如此处所用的，术语"被设置成用于靶检测的检测测定法"是指当使用乾核酸来施行时能够产生可检测的信号的测定法组分的集合。例如，已通过经验证明可检测特定单核苷酸多态性的检测测定法被认为是被设置成用于乾检测的检测测定法。如此处所用的，短语"独特的检测测定法"是指与位于相同检测板上的其他检测测定法相比，具有不同的检测测定法组分集合的检测测定法。独特的测定法不是必须检测与相同检测板上的其他测定法不同的耙(例如，SNP)，但其确实在用于检测给定的靶的组分集合中具有至少一个差异(例如，独特的检测测定法可使用在长度上比在相同检测板上的其他测定法更短或更长的探针序列)。如此处所用的，术语"候选物"是指测定物或分析物，例如，怀疑具有特定特征或性质的核酸。"候选序列"是指怀疑包含特定序列的核酸，而"候选寡核苷酸"是指怀疑具有这样的性质的寡核苷酸，所述性质例如为包含特定序列，或者具有在检测测定法中与乾核酸杂交或进行实施的能力。"候选检测测定法"是指可能为有效的检测测定法的检测测定法。如此处所用的，术语"检测板"是指包含至少两种被设置成用于靶检测的独特的候选检测测定法的基质或装置。如此处所用的，术语"有效的检测测定法"是指已显示出可精确地预测靶的检测和表型(例如，医学状况)之间的关联性的检测测定法。有效的检测测定法的实例包括，但不限于，当检测靼时，以时间的95%、96%、97%、98%、99°/。、99.5%、99.8%或99.9%精确地预测医学表型的检测测定法。有效的检测测定法的其他实例包括，但不限于，有资格作为分析物特异性试剂(Analyte-SpecificReagents)(即，如由FDA条例所定义的)或体外诊断剂(In-VitroDiagnostics)(即，由FDA批准的)的和/或以这些形式市售的检测测定法。如此处所用的，术语"试剂盒"是指用于递送材料的任何递送系统。在反应测定法的情况下，这样的递送系统包括允许从一个地方至另一个地方贮存、运输或递送反应试剂(例如，合适的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，緩冲液、施行该测定法的书面说明书等)的系统。例如，试剂盒包含一个或多个装有相关反应试剂和/或支持材料的封围物(例如，盒子)。如此所用的，术语"分部式试剂盒(fragmentedkit)"是指包含两个或更多个分开的容器的递送系统，所述容器各装有全部试剂盒组分的亚部分(subportion)。可一起或分开地将所述容器递送至想要的接受者。例如，第一个容器可装有用于测定法的酶，而第二个容器装有寡核苷酸。术语"分部式试剂盒"意在涵盖装有在联邦食品、药品和化妆品法案(FederalFood，Drug,andCosmeticAct)的条款520(e)的管制之下的分析物特异性试剂(ASR，s)的试剂盒，但并不局限于此。事实上，在术语"分部式试剂盒"中包括任何包含两个或更多个分开的容器的递送系统，所述容器各装有全部试剂盒组分的亚部分。相反地，"组合式试剂盒(combinedkit)"是指在单个容器中(例如，在装有各想要的组分的单个盒子中)装有反应测定法的所有组分的递送系统。术语"试剂盒"包括分部式试剂盒和组合式试剂盒。如此处所用的，术语"信息"是指事实或数据的任何集合。关于使用计算机系统(包括但不限于因特网)存储或处理的信息，所述术语是指以任何形式(例如，模拟的(analog)、数字的、光的等)存储的任何数据。如此处所用的，术语"与受试者相关的信息"是指与受者(例如，人、植物或动物)有关的事实或数据。术语"基因组信息"是指与基因组有关的信息，包括，但不限于，核酸序列、基因、等位基因频率、RNA表达水平、蛋白质表达、与基因型相关的表型等。"等位基因频率信息"是指与等位基因频率相关的事实或数据，包括，但不限于，等位基因同一性、等位基因的存在和受试者(例如，人受试者)的特征之间的统计学相关性、个体或群体中等位基因的存在或不存在、等位基因在具有一个或多个特定特征的个体中存在的百分比可能性，等等。如此处所用的，术语"测定法确证信息(assayvalidationinformation)"是指由测试结果数据的处理(例如借助计算机进行处理)而产生的基因组信息和/或等位基因频率信息。测定法确证信息可用于例如将特定的候选检测测定法鉴定为有效的检测测定法。发明详述生物样品中的检测分子诊断的目的是用尽可能少的劳力和步骤在尽可能短的时间内获得分析物的精确、灵敏的检测。实现该目的的一种方式是样品中的分析物的多重检测，其允许在单个反应容器或溶液中施行多个检测事件。然而，许多现有的诊断方法，包括多重反应，仍然需要许多步骤，包括增加进行反应的时间、复杂度和成本的样品制备步骤。本发明，在一些实施方案中，通过提供可直接在未纯化或未处理的生物样品(例如，血液)中进行的测定法为这些问题提供了解决办法。生物样品(例如，血液、唾液、尿等)中的直接检测一直是难以把握的，因为在天然样品中存在大量可干扰诊断反应的功能、精确度和一致性的生物因子。例如，许多核酸检测技术使用酶或其他试剂，其对于特定的盐和PH条件敏感或者易遭到被天然因子蛋白水解或抑制。本发明提供了系统和方法，其用于单独地使用或与反转录和PCR或相关技术相组合地使用INVADER测定法，从而直接检测在任何想要的样品(例如，未纯化的体液)中的核酸靶序列。下面的实施例13和14提供了这样的例子。这样的方法可以以单独的反应的形式使用或可以以多重反应的形式使用。下面详述几个多重的实施方案。因此，在一些实施方案中，本发明提供了用于检测样品中的一种或多种靼核酸的系统、组合物、试剂盒和方法，其包括下述步骤在所述耙核酸(如果存在)被检测到的条件下将所述样品暴露于检测测定法试剂。在优选的实施方案中，在单步反应中进行该方法。例如，一旦将样品暴露于试剂，就无需在检测步骤前加入另外的试剂。因此，可在反应容器(例如，密闭的反应容器)中进行该方法而无需另外的人或其他干预。在优选的实施方案中，该方法包括使用或不使用反转录和聚合酶链式反应的侵入性切割反应。在其他优选的实施方案中，所述单步反应包含被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸(例如，侵入性切割反应中的探针或INVADERoligo)的寡核苷酸。因为使用侵入性切割反应(其中使用聚合酶链式反应)的信号扩增、灵敏度和定量信号的能力，所以只需要使用有限的循环(例如，20、15、12、IO或更少)。用于进行或协助该方法的试剂盒可包含用于该方法的试剂中的任一种或多种试剂。例如，在一些实施方案中，试剂盒包含逆转录酶(例如，AMV、MMLV等)、聚合酶、5'核酸酶(例如，FEN-1内切核酸酶)和緩沖液，其允许在未纯化的体液中进行靶核酸的可检测的扩增。多重反应自1988年对其进行介绍(Chamberlain等人，^/c7e/cWe-.16:11141(1988))以来，多重PCR已成为在单一反应中扩增多个遗传基因座的常规方法。该方法已用于许多研究以及临床应用中。除其他以外，多重PCR已被描述用于诊断病毒学(Elnifro等人，13:559(2000))、亲权认定(Hidding和Schmitt，尸ore/7Wc5W.M，113:47(2000);Bauer等人，M/.Zega/#ef/.116:39(2002))、植入前遗传诊断(Ouhibi等人，Cz/rr^边e/^^3fl〃A1:138(2001))、环境和食品样品中的微生物分析(Rudi等人，J/f/Food#/croWo/o^r，78:171(2002))和兽医学(Zarlenga和Higgins，r"户aras27o厶101:215(2001))。最近，将遗传分析扩展至整个基因组水平，特别是对于单核苷酸多态性或SNP，这种扩展已产生了对高度多重化的PCR容量的需要。可比较的全基因组关联(genome-wideassociation)和候选基因研究需要在每个体100，000-500，000SNP之间进行基因分型的能力(Kwok，#o/ecw/ar射/c/z2e7"。麵5:538-5435(1999);Kwok，户力ai7Zwcc^e/7o/B/cs，1:231(2000);Risch和Merikangas，5We/ce，273:1516(1996))。此外，编码和调控区域中的SNP以重要的方式改变基因的功能(Cargill等人，^"wrefe/3e〃c^，22:231(1999);Halushka等人，艇f/reCe/e〃"，22:239(1999))，这使得这些SNP在个体化医学(personalizedmedicine)中成为有用的诊断工具(Hagmann，5W歸e，285:21(1999);Cargill等人，fe/7e〃"，22:231(1999);Halushka等人，A^wr"e/ze〃"，22:239(1999))。同样，作为诊断板(diagnosticpanel)的部分，验证以前就其潜在的临床相关性而鉴定为诊断板的一部分的一组SNP的医学关联性将意味着同时就数千个标记物测试数千个个体。尽管其广泛的吸引力和效用，但几个因素使多重PCR扩增复杂化。这些因素中最主要的因素是PCR或扩增的偏倚的现象，其中某些基因座扩增的程度高于其他基因座。已描述了两类扩增偏倚。一类，称为PCR飘移，归因于在诸如在反应的早期阶段期间的引物退火这些步骤中的随机变异(Polz和Cavanaugh，J/^/e^/a/f/^2Wro咖e/3fa/#/cro6/o7o^r，64:3724(1998))，其是不可重复的，且当扩增非常少量的靶分子时可能会更盛行(Walsh等人，户CT#e^o"a/d^/7/2'ca〃oz^，1:241(1992))。另一类，称作PCR选择，与基于引物特征、扩增子长度、G-C含量和基因组的其他特征而产生的一些基因座的优先扩增相关(Polz，同上)。影响PCR反应可被多重化的程度的另一个因素是PCR反应达到平台期的固有倾向。在晚期PCR循环中观察到平台期，其反映了这样的观察，即扩增子产生从指数积累移向假线性积累，然后最终停止增加。该效应似乎是由于DNA聚合酶和双链产物本身之间的非特异性相互作用造成的。平台期中产物对酶的摩尔比对于几种DNA聚合酶来说通常是一致的，即使当在反应中包括不同量的酶时亦如此，该比率为大约30:1产物酶。因此，该效应限制可在PCR反应中产生的双链产物的总量，从而被扩增的不同基因座的数目必须就各扩增子的总量进行平衡，所述扩增子是想要用于随后例如通过凝胶电泳、引物延伸等进行的分析。因为这些和其他考虑，尽管报导了包括50个基因座的多重PCR(Lindblad-Toh等人，^"i/reCe/2".4:381(2000))，但多重化通常被限制于少于10种不同的产物。然而，如果需要分析多达100，000至450，000个来自单个基因组DNA样品的SNP时，很明显存在对扩展PCR反应的多重化容量的方法的需要。本发明提供了用于通过例如将INVADER测定法与多重PCR扩增相组合来对PCR反应进行显著多重化的方法。该INVADER测定法提供了允许在多重反应中检测非常大量的靶的检测步骤和信号扩增。如想要的，可在多重反应中检测成百至成千至数十万的靶。依赖于检测平台，通过INVADER测定法直接进行基因分型通常使用每SNP5至100ng的人基因组DNA。对于少数测定法，可用基因组DNA直接进行反应而无需靶的预扩增，然而，随着发展出超过100，000个INVADER测定法和预期对于全基因组关联研究时将具有更大数目，样品DNA的量可能变成限制性因素。因为INVADER测定法提供信号的106至107倍扩增，所以与典型的PCR相比，与INVADER测定法相组合的多重化的PCR将只使用有限的靶扩增。结果，低靶扩增水平减少了混合物中单独的反应之间的干扰和降低了PCR由于其产物的积累而受到的抑制，从而提供了更大的多重化。此外，预期低扩增水平减少靶交叉污染的概率和减少PCR诱导的突变的数量。不同基因座的不均一扩增给出了多重化的PCR发展中的最大杏匕战。两个基因座之间的扩增系数的差异可导致这样的状况，即在该状况中，对于慢速扩增的基因座，由INVADER反应产生的信号低于该测定法的检测极限，而来自快速扩增的基因座的信号超过了该测定法的饱和水平。该问题可通过几个方法来解决。在一些实施方案中，可在不同时间点上例如实时地读取INVADER反应，从而显著地扩展该检测的动态范围。在其他实施方案中，可在允许不同基因座达到更相似的扩增水平的条件下进行多重PCR。例如，可限制引物浓度，从而使得每个基因座达到更一致的扩增水平。在其他实施方案中，可调整PCR引物的浓度以平衡不同基因座的扩增系数。本发明提供了高度多重PCR(在单个反应中包含数百至数千种产物)的设计和特征。例如，由百重PCR提供的靶预扩增将对于基于INVADER的SNP基因分型来说所需的人基因组DNA的量减少至低于0.1ng/测定。下面描述了高度多重PCR优化的特性和用于引物设计的计算机程序。除了提供用于高度多重PCR的方法外，本发明还提供了在单个反应容器中进行反转录以及靶和信号扩增反应而无需随后的操作或试剂添加(除了起始的反应设定外)的方法。这样的组合式反应适合于在非常短的反应时间内对有限的靶数量进行定量分析。下列讨论提供了本发明的某些优选的说明性实施方案的描迷，其并不意在限定本发明的范围。1.多重PCR引物设计INVADER测定法可用于使用少至10-100ng基因组DNA来检测单核苷酸多态性(SNPs)而无需靶的预扩增。然而，随着发展出超过50，000个的INVADER测定和对于涉及数十万SNPs的全基因组关联研究的可能性，样品DNA的量成为大规模分析的限制因素。由于INVADER测定法在无靶扩增时对人基因组DNA(hgDNA)的灵敏性，所以与需要大量扩增(109至1012)以进行常规凝胶检测方法的典型多重PCR反应相比，与INVADER测定法相偶联的多重PCR只需要有限的靶扩增(103至104)。用于INVADERTM检测的低水平耙扩增通过避免了通常由把积累而引起的扩增抑制，而提供了更大的多重化。本发明提供了允许产生用于多重PCR的引物组的方法和选择标准(例如，可与检测测定法例如INVADER测定法相偶联)。在优选的实施方案中，本发明提供了多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作用于侵入性切割测定法反应的INVADERoligo。在一些实施方案中，本发明的应用软件提供了自动化的多重PCR引物选择，从而允许使用由此设计的引物来进行高度多重化的PCR。如实施例2中所示，通过使用INVADER医学相关板(MedicallyAssociatedPanel)(MAP)作为相应的SNP检测的平台，本发明的方法、软件和选择标准使得能够准确地对来自单个PCR反应的101个可能的扩增子中的94个(大约93%)进行基因分型。最初的PCR反应只使用10nghgDNA作为模板，对应于少于150pghgDNA/INVADER测定。所述INVADER测定法允许在采用等温、单次添加形式的相同反应中同时检测两个不同的等位基因。通过探针的"结构特异性"切割，从而释放对应于给定的多态性的5'翼片，来进行等位基因区分.在第二反应中，释放的5'翼片通过合适的FRET盒的切割来介导信号的产生。使用本发明的应用软件的一个实施方案，从可用于在INVADER医学相关板上的分析的序列产生101个引物的组中的一个引物对(正向和反向引物)，包括单个条目(entry)的样品输入文件(例如，包含SNP的单个靶序列的靶序列信息，其由本发明的方法和软件进行处理)。把序列信息包括ThirdWaveTechnologies'sSNP#、短名称标识符(shortnameidentifier)和具有括号内标示的SNP位置的序列。相同条目的样品输出文件(例如在经本发明的系统和方法和软件处理后，显示出靶序列)包括足迹区的序列(位于SNP位点的侧翼的大写字母，显示了这样的区域，在其中INVADER测定法探针与该靶序列杂交以检测乾序列中的SNP)、正向和反向引物(粗体)和其对应的Tra。在一些实施方案中，以自动化的方式(例如通过应用软件)来进行引物的选择，所述引物用于产生能够进行多重PCR的引物组。可使用如图8中的流程图所示进行设计的软件程序来完成用于多重PCR的自动化引物选择。多重PCR通常需要广泛的优化以避免选择扩增子的偏倚扩增和由于引物二聚体的形成而产生的假产物的扩增。为了避免这些问题，本发明提供了方法和应用软件，所述方法和应用软件提供了产生被设置成用于多重PCR和随后用于检测测定法(例如INVADER检测测定法)的引物組的选择标准。在一些实施方案中，本发明的方法和应用软件始于用户确定的序列和对应的SNP位置。在某些实施方案中，所述方法和/或应用软件确定各序列的乾序列(INVADER检测所需的最小扩增子)内的足迹区。足迹区包括其中测定法探针进行杂交的区域以及任何用户定义的由此向外延伸的额外碱基(例如在测定法探针进行杂交的位置的每一侧上所包含的5个额外的碱基)。然后，从足迹区向外设计引物并就几个标准(包括与前面设计的在当前多重化组中的引物形成引物二聚体的可能性)评估所述引物。经过相同的序列组的多个重复可继续该过程，直至可以设计出针对在当前多重化组中的所有序列的引物来.一旦设计了引物组，可例如在标准的条件下只使用10nghgDNA作为模板来进行多重PCR。在95TC下进行IO分钟后，向50Ml反应物中加入Taq(2.5个单位)并进行50个循环的PCR。可稀释PCR反应体系并直接将其上载至INVADERMAP板上(3jal/孑L)。可向INVADERMAP板上的各反应体系中加入额外的3m115mMMgCl2，并用6jn1矿物油覆盖。然后将整块板加热至95匸并进行5分钟，并在631c下温育40分钟。然后可在Cytofluor4000荧光板读取器上测量FAM和RED荧光，并计算各扩增子的"FoldOverZero"(F0Z)值。可在表中用颜色来编码来自每个SNP的结果，如"通过"(绿色)、"错误判读(mis-call)"(粉红色)或"无判读(no-call)，，(白色)(参见，下面的实施例2)。在一些实施方案中，PCR反应的数目是从大约1至大约IO个反应。在一些实施方案中，PCR反应的数目是从大约10至大约50个反应。在其他实施方案中，PCR反应的数目是从大约50至大约100个反应。在另外的实施方案中，PCR反应的数目是从大约大于100至1000个反应。在其他实施方案中，PCR反应的数目大于1，000。本发明还提供了用于优化多重PCR反应(例如在引物组产生后，可优化每个引物或引物对的浓度)的方法。例如，在引物组已产生并以相等的摩尔浓度用于多重PCR后，可分开地评估引物以确定最佳的引物浓度，从而使多重引物组表现更好。与标准的单重PCR反应相比，多重PCR反应在科学、研究、临床和生物技术学工业中正被公认为是获得核酸信息的可能省时和省钱的方法。与在每个反应容器(例如管或多孔板的孔)只进行单个扩增反应不同，在单个反应容器中进行许多扩增反应。通过免除技术人员在测定法建立和数据分析中花费的时间和通过显著的试剂节约(特别是酶的成本)在理论上降低了每靶的成本。多重方法的另一个益处是只需要少得多的靶样品.在涉及数十万单核苷酸多态性(SNPs)的全基因组关联研究中，靶或受试样品的量限制了大规模分析，因此，使用一个样品等分试样来进行单个反应以获得例如100个结果的概念相对于使用100个样品等分试样以获得相同数据组来说是吸收人的选择。为了设计用于成功的多重PCR反应的引物，应当解决引物之间的异常相互作用的问题。引物二聚体的形成，即使在长度上只有少数碱基，可抑制两个引物对靶序列的正确杂交。此外，如果在引物的3'末端或靠近3'末端形成二聚体，则不发生扩增或扩增的水平非常低，因为3'末端是引发事件所必需的。很明显，每个多重反应所使用的引物越多，异常的引物相互作用发生的可能性就越大。本发明的方法、系统和应用帮助在大引物组中防止形成引物二聚体，使该引物组适合于高度多重化的PCR。特别地，在优选的实施方案中，本发明提供了被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作用于侵入性切割测定法反应的INVADERoligo的多用途寡核苷酸，从而显著地减少了每个多重反应所使用的引物/寡核苷酸的数目，从而限制了背景异常(例如，引物二聚体)。当设计用于大量位点(例如，在多重PCR反应中的IOO个位点)的引物对时，设计引物对时所按照的顺序可影响用于反应的可相容的引物对的总数。例如，如果设计用于恰好为富含A/T的靶区域的第一乾区域的第一组引物，那么这些引物将富含A/T。如果选择的第二靶区域也恰好为富含A/T的靶区域，那么很可能，设计用于这两组的引物将由于异常相互作用例如引物二聚体的原因而是不相容的。然而，如果，选择的第二靶区域不是富含A/T的，则很可能可以设计出不与第一富含A/T的组相互作用的引物组。对于任何给定的输入靶序列組，本发明使设计引物组时所按照的顺序随机化(参见，图8)。此外，在一些实施方案中，本发明以多个不同的随机顺序重排输入靶序列组的顺序，以使对于任何给定的多重反应，可相容的引物组的数目最大化(参见，图8)。本发明提供了用于引物设计的标准，其在多重设计中使3'相互作用最小化，同时使用于给定的反应靶组的可相容的引物的数目最大化。对于描述为-N[x]-N[x-l]-......-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'的引物，N[l]是A或C(在可选择的实施方案中，N[1]是G或T)。设计的正向和反向引物中每个引物的N[2]-N[l]不应当与任何其他寡核苷酸的N[2]-N[l]互补。在某些实施方案中，N[3]-N[2]-N[l]不应当与任何其他寡核苷酸的N[3]-N[2]-N[l]互补。在优选的实施方案中，如果这些标准在给定的N[l]处得不到满足，那么正向引物的5'方向中的下一个碱基或反向引物的3'方向中的下一个碱基可被当作N[l]位点进行评价。与靶随机化相组合地，重复该方法，直至对于所有或绝大部分靶序列(例如，95%的靶序列可具有对于满足这些标准的引物组而制成的引物对)满足所有标准。多重引物设计中要克服的另一个挑战是实际的、所需的核苷酸序列、序列长度和寡核苷酸解链温度(Tm)限制之间的平衡。重要的是，因为反应中多重引物组中的引物应当在相同的緩冲液、盐和温度的反应条件下发挥作用，因此，无论目的区域的GC或AT丰度如何，它们均需要具有基本上相似的Tm。本发明使得能够获得满足最小Tm和最大Tm要求以及最小和最大长度要求的引物设计。例如，在各引物的式-N[x]-N[x-l]-......-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'中，选择x以使引物具有预先确定的解链温度(例如将碱基纳入引物中直至引物具有经计算的大约50X:的解链温度)。PCR反应的产物通常用作另一种核酸检测方法例如杂交型检测测定法或INVADER反应测定法的耙材料。应当考虑引物放置的位置以使笫二反应成功地发生，并且还，应当使扩增引物和第二反应寡核苷酸之间的异常相互作用减少至最低，以获得精确的结果和数据。可如此使用选择标准以使经设计用于多重引物组的引物不与检测测定法的寡核苷酸组分反应(例如，与之杂交或触发反应)。例如，为了阻止引物与bi-plexINVADER测定法的FRET寡核苷酸反应，使用某些同源性标准。特别地，如果组中每个引物被定义为5'-N[x]-N[x-l]-……-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'，那么这样选择N[4〗-N[3]-N[2]-N[1]-3'以使其与FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于90%。在其他实施方案中，这样选择每个引物的N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'以使其与FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于80%。在某些实施方案中，这样选择每个引物的N[4]-N[3]-N[2]-N[l]-3'以使其与FRET或INVADER寡核苷酸的同源性低于70%。当使用本发明的标准来产生引物组时，一些引物对可能并不满足所述标准的全部(这些引物可作为错误而被放弃)。例如，在100个靶的组中，30个经设计且满足所有列出的标准，然而，第31套不满足。在本发明的方法中，第31套被标记为失败，所述方法可以继续通过该列100个乾，并同样标记出不满足标准的那些套(参见图8)。当所有IOO个靶在已进行了引物设计后，所述方法将记录失败的套的数目，以新的随机顺序重新排列这100个把的顺序并重复设计过程(参见，图8)。在进行可设置的轮数后，选择具有最多通过的引物对的组(失败的套数最少的组)用于多重PCR反应(参见图8)。图8显示了流程图，其涉及本发明的方法和应用软件的某些实施方案的基本流程。在优选的实施方案中，将图8中详述的过程整合入应用软件中以易于使用(尽管，也可使用例如图8作为指南人工地进行所述方法)。将靶序列和/或引物对输入图8中所示的系统中。第一组框显示了如何将靶序列加至足迹被确定的序列的列表中(参见图8中的"B")，而其他序列立即4皮送入引物组库(例如PDPass，前面已进行处理且显示可一起使用而不形成引物二聚体或不具有与FRET序列的反应性的序歹'J)，以及DimerTest条目(DimerTestentries)(例:ft口用户想j吏用但还未就引物二聚体或fret反应性进行测试的引物对或引物)。换句话说，导向"输入结束(endofinput)"的起始组的框这样分选序列以使它们可在以后被正确地处理。在图8中的"A"处开始，引物库基本上被清空或"腾空"以开始新的一轮。然后将靶序列发送至"B"进行处理，并将DimerTest对发送至"C"进行处理，把序列被发送至"B"，在该处用户或应用软件确定靶序列的足迹区(例如，测定法探针将在何处进行杂交以检测靶序列中的突变(例如SNP))。设计该区域(通过定义可加入超出该杂交区域的额外碱基，用户可进一步扩展所述区域)以使设计的引物完全包含该区域是非常重要的。在图8中，使用应用软件INVADERCREATOR来设计将与乾区域杂交的INVADER寡核苷酸和下游探针(尽管可使用任何类型的系统程序来产生任何类型的探针，但用户的兴趣在于设计用于靶序列的探针，从而确定靶序列上的足迹区)。因此，然后通过这两个测定法探针在靶上的位置来定义核心足迹区。然后，该系统始于足迹的5'边缘并沿5'方向行进直至到达笫一碱基，或直至到达第一A或C(或者G或T)。将该位置设定为用于定义正向引物的序列的最初起始点(即，该位置用作起始N[l]位点)。从该起始N[l]位点开始，正向引物的引物序列与在靶区域上遇到的那些碱基相同。例如，如果将引物的默认大小设定为12个碱基，系统从选择作为N[l]的碱基开始，然后加入在靶序列中发现的紧接着的11个碱基。然后就解链温度测试该12聚体引物(例如使用INVADERCREATOR)，从耙序列加入额外的碱基直至序列具有由用户指定为默认最低和最高解链温度(例如，大约50'C，和不超过55X:)的解链温度。例如，系统使用式5'-N[x]-N〖x-l]……-N[4]-N[3〗-N[2]-N[l]-3、且x最初为12。然后将x调整为更大的数目(例如更长的序列)直至发现预设的解链温度。在某些实施方案中，使用最大引物大小作为用作所设计的引物的长度上限的缺省参数。在一些实施方案中，最大引物大小为大约30个碱基(例如，29个碱基、30个碱基或31个碱基)。在其他实施方案中，使用标准的数据库操作工具能够改变缺省设置(例如最小和最大引物大小，以及最小和最大Tm)。图8中的下一个框用于确定目前为止已设计的引物是否会产生引物二聚体和/或fret反应性(例如，与已存在于库中的其他序列)。上面解释了用于该确定的标准。如果引物通过该步骤，则将正向引物加入至引物库中。然而，如果正向引物不满足该标准，如图8中所示，则将起始点(N[l])沿5'方向移动一个核苷酸(或移至下一个A或C，或者下一个G或T)。系统首先进行检查以确保移动在靶序列上留下足够的空间以成功地产生引物.如果是，系统回环返回并就解链温度检查该新的引物。然而，如果没有可被设计的序列，那么将靶序列标记为错误(例如表明不能为该靶制得正向引物)。然后如图8中所示就设计反向引物重复该相同的过程。如果成功地制得反向引物，那么将引物对或引物放入引物库中，并将系统返回至"B"(如果有更多的耙序列要处理)，或至"C"以测试DimerTest对。开始图8中的"C"显示出，系统是如何处理作为引物(DimerTest)而登入的引物对的。如果不存在DimerTest对，如图8中所示，系统转向"D"。然而，如果存在DimerTest对，如上所述就引物二聚体和/或FRET反应性测试这些引物对。如果DimerTest对不满足这些标准则将其标记为错误。如果DimerTest对通过了所述标准，则将其加入至引物组库，然后如果还有DimerTest对要评估，那么系统返回"C",或者如果不再有DimerTest对要评估，那么系统转至"D"。在图8中的"D"处开始，评估已产生的引物库。该部分中的第一步是检查由序列的该特定的随机化轮的序列产生的错误(失败)的数目。如果没有错误，那么该组是作为可能输出给用户的最佳的组。如果存在多于0个的错误，那么系统将该轮与任何其他前前的轮进行比较以找出那一轮导致最少的错误。如果当前轮具有更少的错误，则将其指定为当前最佳组。在该点上，系统可返回"A"以起始使用相同序列的另一随机化组的轮，或者在该轮(例如，该轮为第5轮，且最大轮数被设定为5)上可能已经达到预设的最大轮数(例如5轮)。如果已达到最大数目，那么将最佳的组输出为最佳组。然后可将该最佳组引物用于产生物理寡核苷酸组以使得可进行多重PCR反应。关于多重PCR反应的另一个要克服的挑战是导致标准多重反应的不相等的扩增子浓度。被靶向进行扩增的不同基因座各自在扩增反应中可具有不同的表现，从而产生浓度极不相同的每种不同的扩增子产物.本发明提供了方法、系统、应用软件、计算机系统和计算机数据存储介质，其可用于相对于第一次检测测定法读数(例如INVADER测定法读数)调整引物浓度，然后使经平衡的引物浓度接近不同扩增子的基本上相同的浓度。可通过实验来确定各种引物对的浓度。在一些实施方案中，用等摩尔浓度的所有引物进行第一轮。然后进行时间读数。基于时间读数，确定每个扩增子的相对扩增系数。然后基于统一校正公式，估算应当获得多大的引物浓度才能使信号在相同的时间点内更接近。这些检测测定法可在不同大小的阵列(384孔板)上进行。要认识到，将本发明与检测测定法和检测测定的阵列相组合提供了显著的处理效率。通过使用利用本发明产生的引物或引物对的平衡混合物，可进行单点读数，这样一般用户可在进行检测中获得很高的效率，所述检测在整个不同靶的阵列上要求高灵敏度和特异性。在单个反应容器中优化引物对浓度后，使得用户能够在单个反应容器和单个步骤中进行多个或许多扩增靶的扩增。然后使用单步过程的产物成功地获得对于例如数百个测定法的检测结果数据。例如，384孔板上的每个孔可在其上具有不同的检测测定法。单步多重PCR反应的结果扩增了基因组DNA的384个不同的靶，且每个板为你提供了384个测试结果。当那个孔具有多个测定法时，甚至可获得更大的效率。因此，本发明提供了将每个引物组的浓度在高度多重化的PCR中用作参数以获得每种PCR产物的无偏倚扩增。任何PCR包括引物退火和引物延伸步骤。在标准的PCR条件下，luM量级的高引物浓度确保了引物退火的快速动力学，而引物延伸步骤的最佳时间依赖于扩增产物的大小且可比退火步骤长得多。通过降低引物浓度，引物退火动力学可变成限速步骤，并且PCR扩增系数应当强烈地依赖于引物浓度、引物的结合速率常数和退火时间。可通过下列模型来描述引物户与靶r的结合<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>(i)其中A是引物退火的结合速率常数。我们假定在低于引物解链的温度下发生退火，且逆向反应可被忽略不计。在引物过量的条件下用于该动力学的解决方法是公知的<formula>formulaseeoriginaldocumentpage53</formula>(2)其中/77是与引物结合的靶分子的浓度，n是起始靶浓度，c是起始引物浓度，和f是引物退火时间。假定复制与引物结合的每个乾分子以产生完整大小的PCR产物，则单个PCR循环中的靶扩增系数是在/7次循环后，总PCR扩增系数由下式给出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>(4)如根据公式4所知，在引物退火动力学是PCR的限速步骤的条件下，扩增系数应当强烈地依赖于引物浓度。因此，偏倚的基因座扩增，无论其由个体的结合速率常数、引物延伸步骤造成还是由任何其他因素造成，可通过调整多重PCR中每个引物组的引物浓度而得到修正。也可使用经调整的引物浓度来修正偏倚的INVADER测定法的性能，所述INVADER测定法用于PCR预扩增的基因座的分析。使用该基本原理，本发明已证明扩增效率和引物浓度之间的线性关系，并使用该公式来平衡不同扩增子的引物浓度，从而导致实施例1中的IO个不同扩增子的等同扩增。该技术可用于任何大小的组的多重引物对。II.检测测定法的设计下列部分描述了可用于本发明的检测测定法。例如许多不同的测定法可用于确定靶核酸序列上的足迹，然后用作对多重PCR的输出物进行的检测测定法(或者所述检测测定法可以与多重PCR反应同时进行)。存在各种各样可获得的用于在一个或多个位置上确定靶核酸的序列的检测技术。例如，存在大量可获得的用于检测SNP的存在或不存在的技术.许多这些技术需要使用与靶杂交的寡核苷酸.依赖于所用的测定法，寡核苷酸然后被切割、延长、连接、解离或改变，其中监测其在测定法中的表现以作为表征该靶核酸的序列的手段。在下面，许多这些技术详细地描述于第IV部分中。本发明提供了用于设计在检测测定法中使用的寡核苷酸的系统和方法。特别地，本发明提供了用于寡核苷酸设计的系统和方法，所述寡核苷酸在想要的用于检测测定法的反应条件(例如，温度、緩沖液条件等)下成功地与靶核酸的合适区域(例如，不包含二级结构的把核酸的区域)杂交。所述系统和方法还允许设计出多个不同的寡核苷酸(例如，与靶核酸的不同部分杂交或与两个或更多个不同把核酸杂交的寡核苷酸)，其都在相同的或基本上相同的反应条件下在检测测定法中起作用。这些系统和方法还可用于设计出在实验反应条件下工作的对照样品。尽管本发明的系统和方法不限定于任何特定的检测测定法，但当与INVADER测定法(ThirdWaveTechnologies,MadisonWI;参见，例如，美国专利5，846，717、5,985,557、5，994，069和6，001，567，PCT公开号WO97/27214和WO98/42873，和deArruda等人，Expert.Rev.Mol.Diagn.2(5)，487-496(2002)，它们都以其全文在此引用作为参考)相组合地使用以检测SNP时，下列描述举例说明了本发明。INVADER测定法提供了易用性(ease-of-use)和灵敏度水平，即当与本发明的系统和方法组合使用时，可在检测板、ASRs和临床诊断中使用。本领域技术人员将认识到，该说明性例子的特殊和一般的特征通常可应用于其他检测测定法。A.INVADER测定法INVADER测定法提供了用于形成依赖于靶核酸存在的核酸切割结构并切割该核酸切割结构以释放不同切割产物的方法。例如，使用5'核酸酶活性切割靶依赖性切割结构，并且所得的切割产物表明样品中存在特定的靶核酸序列。当核酸或寡核苷酸的两条链都与靶核酸链杂交从而它们形成重叠的侵入性切割结构时，如下面所描述的，就可发生侵入性切割。通过切割试剂(例如，5'核酸酶)和上游寡核苷酸的相互作用，可以使切割试剂以产生不同片段的方式在内部位点切割下游寡核苷酸。在一些实施方案中，INVADER测定法提供了检测测定法，在其中，在多轮与寡核苷酸探针的杂交以及探针的切割中重新使用或再循环靶核酸而无需使用温度循环(即，用于靶核酸链的周期性变性)或核酸合成(即，用于靶或探针核酸链的基于聚合的置换)。当在探针在靶链上被连续替代(例如，通过探针-探针置换或通过探针/靶结合和解离之间的平衡，或通过包含这些机制的组合(Reynaldo，等人，J.Mol.Biol.97:511-520[2000]))的条件下进行切割反应时，多个探针可与相同的靶杂交，从而允许进行多个切割和产生多个切割产物。B.用于INVADER测定法的寡核苷酸设计在其中寡核苷酸设计用于INVADER测定法以检测SNP的一些实施方案中，将目的序列输入INVADERCREATOR程序(ThirdWaveTechnologies,Madison,WI)中。如上所述，可输入来自许多来源的序列以进行分析，直接输入装有INVADERCREATOR程序的计算机或经由通过通讯网络(例如，LAN、内联网或因特网)连接的远程计算机输入。所述程序设计有义和反义链的探针。链选择通常基于合成的容易度、二级结构形成的最小化和可制造性。在一些实施方案中，用户选择序列将被设计的链。在其他实施方案中，软件自动地选择链。通过整合用于最佳的探针循环和信号产生的热动力学参数(Allawi和SantaLucia，Biochemistry,36:10581[1997])，可i殳计寡核苷酸探针以在预先选择的测定法温度(例如，63t:)下进行操作。基于这些标准，选择最终探针组(例如，用于2个等位基因和INVADER寡核苷酸的第一探针)。在一些实施方案中，INVADERCREATOR系统是基于网络的具有安全站点访问(securesiteaccess)的程序，其包含至BLAST(可在NationalCenterforBiotechnologyInformationNationalLibraryofMedicine、NationalInstitutesofHealth网站上获得)的连接和可连接至RNAstructure(Mathews等人，M":1458[1999])(整合了mfold(Zuker，5^/e/zce，244:48[1989])的软件程序)。Restructure就单分子或双分子复合物的形成测试由INVADERCREATOR产生的被推荐的寡核苷酸设计。INVADERCREATOR是适应开放式数据库连通性(ODBC)的，并且使用Oracle数据库进行输出/整合。用Oracle设置INVADERCREATOR系统以与UNIX系统一起很好地工作，因为大多数基因组中心是基于UNIX的。在一些实施方案中，在分开的服务器(例如，Sun服务器)上提供INVADERCREATOR分析，这样其可进行大批量工作的分析。例如，顾客可在一封电子邮件中提交多至2,000个SNP序列。服务器将成批的序列传递至INVADERCREATOR软件，并且，当被起始时，该程序设计检测测定法寡核苷酸组。在一些实施方案中，在接收到序列24小时内，将探针组设计返回给用户。每个INVADER反应包括至少两个用于第一反应的靶序列特异的、未标记的寡核苷酸上游INVADER寡核苷酸和下游探针寡核苷酸。INVADER寡核苷酸通常被设计成用于在反应温度下稳定地结合，而所述探针被设计成用于自由地与靶链结合和解离，只有当未切割的探针邻近重叠的INVADER寡核苷酸进行杂交时才发生切割。在一些实施方案中，所述探针包含不与靶互补的5'翼片或"臂"，并且当切割发生时，该翼片从探针释放。在一些实施方案中，释放的翼片作为INVADER寡核苷酸参与第二反应。下面的讨论提供了可以如何设置INVADERCREATOR程序的用户界面的一个实例。用户通过例如点击计算机的桌面显示(例如，Windows桌面)上的图标打开工作屏幕。用户输入与为其设计测定法的靶序列相关的信息。在一些实施方案中，用户输入靶序列。在其他实施方案中，用户输入根据其从数据库检索序列的代码或编号。在其他实施方案中，可提供额外的信息，例如用户的名字、与靶序列相关的标识号码和/或顺序编号.在优选的实施方案中，用户指明(例如通过复选框或下拉式菜单)靶核酸是DNA或RNA.在其他优选的实施方案中，用户指明核酸所来源的物种。在特别优选的实施方案中，用户指明设计是用于单重(即，一个靶序列或等位基因/反应)还是多重(即，多个靶序列或等位基因/反应)检测。当完成必需的选择和输入时，用户开始分析过程。在一个实施方案中，用户点击"GoDesignIt"按钮以继续进行。在一些实施方案中，软件在运行前验证所述字段输入(fieldentries).在一些实施方案中，软件证明，任何所需的字段(field)均用合适类型的信息完成。在其他实施方案中，软件证明，输入序列满足选择的要求(例如，最小或最大长度、DNA或RNA含量)。如果发现任何字段中的输入是无效的，可显示错误信息或对话框。在优选的实施方案中，错误信息表明哪个字段是不完全和/或不正确的。在序列输入被校验后，软件进行测定法设计。在一些实施方案中，以定购条目字段(orderentryfields)提供的信息指定将要产生的设计的类型。在优选的实施方案中，靶序列和多重复选框指定要建立的设计的类型。设计选项包括但不限于SNP测定、多重化的SNP测定(例如，其中将用于不同等位基因的探针组合在单个反应中)、多个SNP测定(例如，其中输入序列具有多个变异位点，针对所述变异设计探针组)和多个探针臂测定(MultipleProbeArmassays)。在一些实施方案中，通过WebOrderEntry(WebOE)过程(即，通过内联网/因特网浏览器介面)来起动INVADERCREAT0R软件，并通过applet<param>标签而不是通过菜单或复选框输入来从WebOE传递这些参数。在多个SNP设计的情况下，用户选择两个或更多个设计一起工作。在一些实施方案中，该选择打开了新的屏幕视窗(例如，多个SNP设计选择视窗)。在一些实施方案中，所述软件产生了用于靶序列中每个基因座的设计，对各设计评分，并在该视窗中将其呈递给用户。然后，用户可选择任何两个设计一起工作。在一些实施方案中，用户选择第一和第二设计(例如，通过菜单或按钮)并点击"GoDesignIt"按钮以继续进行设计.为了选择在预先选择的反应温度下表现最佳的探针序列，使用DM双链体形成的最邻近模型和公开的参数(Allawi和SantaLucia，Biochemistry,36:10581[1997])来计算待检测的SNP的解链温度(Tffl)。在其中靶链是RNA的实施方案中，可使用适合于RNA/DNA异源双链体形成的参数。因为测定法的盐浓度通常与其中获得最邻近参数的溶液条件(lMNaCl，和无二价金属)不同，并且因为酶的存在和浓度影响最佳反应温度，所以应当对计算的L进行调整以确定进行反应所处的最佳温度。补偿这些因素的一个方法是在解链温度计算值范围内改变提供的盐浓度的值。该调整称为'盐效校正，。如此处所用的，术语"盐效校正"是指为了反映影响所述双链体的非盐参数或条件对于核酸双链体的L计算值的影响，在提供的盐浓度的值上产生的变化。提供的链浓度的值的变化也会影响这些计算的结果。通过使用0.5MNaCl的值(SantaLucia，,roC""c"5W""，95:1460[1998])以及大约1fflM探针和1fM靶的链浓度，已对于用于计算探针-耙解链温度的算法进行调整以适合用于预测最佳INVADER测定法反应温度。对于30个探针的组，通过该方法计算的最佳测定法温度和通过实验测定的最佳测定法温度之间的平均偏差为大约1.5X:。通过选择的用于进行反应的温度(例如，63t:)来确定对于给定的SNP的下游探针的长度。从靶DNA上的变异的核苷酸(与想要的切割位点的5'的探针核苷酸配对的乾碱基)的位置开始，使用反复的过程在3'末端上加入碱基直至达到匹配想要的反应温度的计算出的最佳反应温度(L加上补偿酶效应的盐效校正)，通过所述反复的过程，探针的靶结合区域的长度每次增加一个碱基对。优选地选择探针的非互补臂以使第二反应在相同的反应温度下循环。使用程序例如mfold(Zuker，Sc/e/7ce，244:48[1989])或Oligo5.0(Rychlik和Rhoads，^/c/e/cJc/cTsyes，17:8543[1989])就可干扰反应的二聚体复合物或二级结构的可能形成来筛选整个探针寡核苷酸。INVADER寡核苷酸的设计也遵循相同的原理。简而言之，从靶DNA上的位置N开始，设计INVADER寡核苷酸的3'末端使之具有不与怀疑包含在待测试的样品中的任一等位基因互补的核苷酸。所述错配不会不利地影响切割(Lyamichev等人，A^wr"/o^//7o/og7，17:292[1999])，且其可增加探针循环，推测这是通过使两个探针之间的同轴稳定性效应减少至最低限度而引起的.然后在5'方向上加入从残基N-1开始与靶DNA互补的额外残基直至INVADER寡核苷酸-靶杂交物的稳定性超过探针的稳定性(从而超过计划的测定法反应温度)，通常超过15-20x:。所述测定法设计的一个方面是，可选择所有探针序列以使第一反应和第二反应在相同的最佳温度下发生，从而可同时进行反应步骤。在可选择的实施方案中，可设计探针以使之在不同的最佳温度下进行操作，这样反应步骤并不是同时在其最适温度下发生。在一些实施方案中，软件给用户提供了改变设计的各种不同方面的机会，包括但不限于探针、靶和INVADER寡核苷酸；最适温度和浓度；阻断基团；探针臂；染料、封端基团和其他加合物(adducts);探针和靶的单个碱基(例如，从乾和/或探针的末端添加或删除碱基，或改变INVADER和/或探针和/或靶寡核苷酸中的内部碱基)。在一些实施方案中，通过从菜单选择来进行改变。在其他实施方案中，将改变输入文本框或对话框。在优选的实施方案中，该选项打开了新的屏幕(例如，DesignerWorksheet视窗)。在一些实施方案中，软件提供了评分系统以表明测定法设计的质量(例如，执行的可能性)。在一个实施方案中，评分系统包括起始评分点(例如，100点)，其中起始评分表示理想的设计，和其中已知或怀疑对测定法性能具有不利影响的设计特征被赋予罚分值(penaltyvalues)。罚分值可依赖于除了序列以外的其他测定法参数而变化，包括但不限于意欲进行设计的测定法的类型(例如，单重、多重)和进行测定法反应的温度。下列例子提供了举例说明性的评分标准，其用于基于由实验确定的情报的INVADER测定法的一些实施方案。可能招致评分罚分的设计特征的例子包括但不限于下列[罚分值显示在括号中，笫一个数字用于较低温度测定法(例如，62-64iC)，第二个数字用于较高温度测定法(例如，65-661C)]:1.[100:100]INVADER寡核苷酸的3'末端类似于探针的臂臂序列如果INVADER末端在下列序列中，给予罚分臂1:CGCGCCGAGG...GAGGX或5'...GAGGXX臂2:ATGACGTGGCAGAC..，CAGACX或5'...CAGACXX臂3:ACGGACGCGGAG.…GGAGX或...GGAGXX臂4:TCCGCGCGTCC5'...GTCCX或5'...GTCCXX2.[70:70]探针具有包含多态性的5-碱基片段(5-basestretch)(即成排的5个相同碱基)；3.[60:60]探针具有与多态性相邻的5-碱基片段；4.[50:50]探针具有离多态性l个碱基的5-碱基片段；5.[40:40]探针具有离多态性2个碱基的5-碱基片段；6.[50:50]探针5-碱基片段具有Gs-额外的罚分；7.[100:100]探针具有任何位置的6-碱基片段；8.[90:90]2或3碱基序列重复至少4次；9.[100:100]在探针中出现简并碱基；10.[60:90]探针杂交区域短(对于设计65-67X:，13个碱基或更少；对于设计62-64匸，12个碱基或更少)；11.[40:90]探针杂交区域长(对于设计65-67°C，29个碱基或更多，对于设计62-64t:，28个碱基或更多)；12.[5:5]探针杂交区域长度-每碱基的额外罚分；13.[80:80]在探针臂后的前3个碱基中的具有差区分性的Ins/Del设计；14.[100:100]计算的INVADER寡核苷酸Tm在探针把Tm的7.5匸之内(对于INVADER寡核苷酸低于《70.5"C，设计65-67'C，对于INVADER寡核苷酸《69.5匸,设计62-64C);15.[20:20]计算的探针Tm的差异超过2.0*C;16.[100:100]探针的计算的Tm低于其靶Tm2匸；17.[10:10]靶的一条链比另一条链长8个碱基；18.[30:30]INVADER寡核苷酸具有任何位置的6-碱基片段—初始罚分；19.[70:70]INVADER寡核苷酸6-碱基片段具有Gs—额外罚分；20.[15:15]探针杂交区域的长度为14、15或24-28个碱基(65-67匸)或者13、14或26、27个碱基(62-64T);21.[15:15]探针具有包含多态性的Gs的4-碱基片段。在特别优选的实施方案中，随着变化发生，重新计算设计中的每个寡核苷酸的温度和重新计算得分。在一些实施方案中，可通过点击"descriptions"按扭来观看评分描述。在一些实施方案中，提供了BLAST搜索选项。在优选的实施方案中，通过点击"BLASTDesign"按扭来进行BLAST检索。在一些实施方案中，该操作提供了描述BLAST过程的对话框。在优选的实施方案中，BLAST检索结果在DesignerWorksheet上以高亮的设计进4亍显示。在一些实施方案中，用户通过点击"Accept"按扭而接受设计。在其他实施方案中，程序批准设计而无需用户干预。在优选的实施方案中，程序将批准的设计送至下一个处理步骤(例如，进入生产；进入文件或数据库)。在一些实施方案中，程序提供了屏幕视窗(例如，输出页)，从而允许观看所产生的最终设计和允许将注释粘帖至该设计。在优选的实施方案中，用户可返回至DesignerWorksheet(例如，通过点击"GoBack"按钮)或可保存设计(例如，通过点击"SaveIt"按钮)和继续(例如，提交设计出的寡核苷酸以进行生产)。在一些实施方案中，程序提供了选项以产生用于打印(例如，仅文本形式的视图)或其他输出(例如，输出视图)而优化的设计的屏幕视窗。在优选的实施方案中，输出视图提供了特别适合于打印或输出至另一个应用程序(例如，通过拷贝和粘帖入另一个应用程序)的设计的描述。在特别优选的实施方案中，输出视图在分开的窗口中打开。本发明并不限定于使用INVADERCREATOR软件。事实上，各种软件程序是可考虑的且是可商购获得的，包括但不限于GCGWisconsinPackage(GeneticscomputerGroup,Madison,WI)和VectorNTI(Informax，Rockville，Maryland)。其他检测测定法可用于本发明。1.直接测序测定法在本发明的一些实施方案中，使用直接测序技术来检测变体序列。在这些测定法中，首先使用任何合适的方法从受试者分离DNA样品。在一些实施方案中，将目的区域克隆入合适的栽体中并通过在宿主细胞(例如，细菌)的生长来进行扩增。在其他实施方案中，使用PCR扩增目的区域中的DNA。在扩增后，使用任何合适的方法对目的区域(例如，包含目的SNP或突变的区域).中的DNA进行测序，包括但不限于使用放射性标记核苷酸的人工测序或者自动测序。使用任何合适的方法显示测序结果。检查序列，并确定是否存在给定的SNP或突变。2.PCR测定法在本发明的一些实施方案中，使用基于PCR的测定法来检测变体序列。在一些实施方案中，PCR测定法包括使用只与变体或野生型等位基因(例如与多态性或突变的区域)杂交的寡核苷酸引物。同时使用两组引物来扩增DNA的样品。如果只有突变的引物导致产生PCR产物，那么患者具有突变的等位基因。如果只有野生型引物导致产生PCR产物，那么患者具有野生型等位基因。3.片段长度多态性测定法在本发明的一些实施方案中，使用片段长度多态性测定法检测变体序列。在片段长度多态性测定法中，使用酶(例如，限制性内切酶或裂解酶I[ThirdWaveTechnologies,Madison，WI])产生基于在一系列位置切割DNA的独特的DNA带型。来自包含SNP或突变的样品的DNA片段将具有与野生型不同的带型。a.RFLP测定法在本发明的一些实施方案中，使用限制性片段长度多态性测定法(RFLP)来检测变体序列。首先使用PCR分离目的区域。然后用已知对于给定的多态性产生独特长度片段的限制性内切酶切割PCR产物。通常通过凝胶电泳来分离经限制性内切酶消化的PCR产物，且可通过溴化乙锭染色来显现。将片段的长度与分子量标记和从野生型和突变型对照产生的片段进行比较。b.CFLP测定法在其他实施方案中，使用裂解酶(CLEAVASE)片段长度多态性测定法(CFLP;ThirdWaveTechnologies,Madison，WI;参见例如，美国专利5,843,654、5,843,669、5，719，208和5，888，780;其各自在此引用作为参考)来检测变体序列。该测定法基于这样的观察，即当DNA的单链自身折叠时，它们釆取对于DNA分子的精确序列来说高度特有的高级结构。这些二级结构包括DNA的部分双链体区域，这样单链区域与双链DNA发夹结构并置。裂解酶I，是识别和切割这些单链和双链区域之间的连接点的结构特异的、热稳定的核酸酶。首先例如使用PCR分离目的区域。在优选的实施方案中，标记一条链或两条链。然后，通过加热分开DNA链。然后，冷却反应物以^f吏链内二级结构形成。然后用裂解酶I处理PCR产物以产生对于给定的SNP或突变来说独特的一系列片段。分离和检测(例如，通过变性凝胶电泳)以及显现(例如，通过放射自显影、荧光成像或染色)经裂解酶处理的PCR产物。将所述片段的长度与分子量标记和从野生型和突变型对照产生的片段进行比较。4.杂交测定法在本发明的优选的实施方案中，通过杂交测定法来检测变体序列。在杂交测定法中，基于来自样品的DNA与互补DNA分子(例如，寡核苷酸探针)杂交的能力来确定给定的SNP或突变的存在或不存在。使用各种用于杂交和检测的技术的各种杂交测定法是可用的。下面提供了测定法的选择的描述。a.杂交的直接检测在一些实施方案中，通过显现结合的探针(例如，Northern或Southern测定法；参见例:ft口Ausabel等人(eds.)，Cwrre/^户rofoco/s//#o/ecw/ar5/0/og/，JohnWiley&Sons,NY[1991])而直接检测探针与目的序列(例如，SNP或突变)的杂交。在这些测定法中，从受试者分离基因组DNA(Southern)或RNA(Northern)。然后用切割位点在基因组中稀少且不靠近被测定的任何标记物的一系列限制性内切酶切割DM或RNA。然后分开(例如，在琼脂糖凝胶上)DNA或RNA并转移至膜上。使对于被检测的SNP或突变来说特异的经标记的(例如，通过整合入放射性核苷酸)探针在低、中或高严紧性条件下与所述膜接触。除去未结合的探针，并通过显现经标记的探针来检测结合的存在。b.使用"DNA芯片"测定法进行的杂交的检测在本发明的一些实施方案中，使用DNA芯片杂交测定法来检测变体序列。在该测定法中，将一系列寡核苷酸探针固定于固体支持物上。将寡核苷酸探针设计成对于给定的SNP或突变是独特的。将目的DNA样品与DNA"芯片"接触并检测杂交。在一些实施方案中，所述DNA芯片测定法是GeneChip(Affymetrix，SantaClara,CA;参见，例如美国专利6，045，996、5，925，525和5，858，659;其各自在此引用作为参考)测定法。GeneChip技术使用小型化、高密度的固定在"芯片"上的寡核普酸探针阵列。通过Affymetrix的光引导化学合成(1ight-directedchemicalsynthesis)方法来生产探针阵列，该方法将固相化学合成与用于半导体工业中所使用的光刻蚀制造技术(photolithographicfabricationtechniques)相结合。通过使用一系列光刻蚀掩膜来确定芯片暴露位点，然后进行特异的化学合成步骤，该方法构建出高密度的寡核苷酸阵列，其中每个探针位于阵列中预先确定的位置中。在大的玻璃薄片上同时合成多个探针阵列。然后将薄片切成小片，并将单个的探针阵列包装入注塑成型的塑料吸纳盒(cartridge)中，该吸纳盒保护探4f阵列免受环境的破坏和用作杂交室。分离待分析的核酸，通过PCR进行扩增，并用荧光报告基团进行标记。然后使用全自动洗涤工作站(fluidicsstation)，将经标记的DM和该阵列一起进行温育。然后将阵列插入扫描仪，在扫描仪中检测杂交图式。作为从已整合入靶的荧光报告基团发射出的光，收集杂交数据，所述靶已被结合至该探针阵列。完全匹配靶的探针通常产生比具有错配的探针更强的信号。因为阵列上每个探针的序列和位置是已知的，通过互补性，可确定施加于探针阵列上的靶核酸的身份。在其他实施方案中，使用包含电子捕获探针(electronicallycapturedprobes)(Nanogen，SanDiego，CA)的DNA微芯片(参见例如，美国专利6，017,696、6，068，818和6,051,380;其各自在此引用作为参考)。通过使用微电子学，Nanogen的技术使带电分子在其半导体微芯片上主动运动和浓集至指定的测试位点和从指定的测试位点移开。将对于给定的SNP或突变来说独特的DM捕获探针通过电子作用置于或"送"至微芯片上的特定位点。因为DNA具有强负电荷，所以其可通过电子作用移动至正电荷区域。首先，用正电荷电子地激活微芯片上的测试位点或成排的测试位点。然后，将含有DM探针的溶液导至微芯片上。带负电荷的探针快速地移动至带正电荷的位点，在那里它们浓集并化学地结合至微芯片上的位点。然后洗涤该微芯片并加入另一种不同DNA探针的溶液直至完成特异性结合的DM探针的阵列。然后通过确定哪些MA捕获探针与受试样品中的互补DM(例如，PCR扩增的目的基因)杂交，而就靶DNA分子的存在分析受试样品。电子电荷也用于将靶分子移动和浓集至微芯片上的一个或多个测试位点。样品DNA在每个测试位点处的电子浓集促进了样品DNA与互补的捕获探针的快速杂交(杂交可在数分钟内发生)。为了从每个位点除去未结合或非特异性结合的DNA，将所述位点的极性或电荷逆转成负的，从而迫使任何未结合或非特异性结合的DNA离开捕获探针返回入溶液中。使用基于激光的荧光扫描仪来检测结合。在其他实施方案中，使用基于通过表面张力的差异而在平面(芯片)上分聚流体的阵列技术(ProtoGene，PaloAlto，CA)(参见例如，美国专利6，001，311、5，985，551和5，474，796;其各自在此引用作为参考)。Protogene的技术基于这样的事实，即通过由化学包衣所赋予的表面张力的差异可以在平面上分聚(segregate)流体。当如此进行分聚时，通过试剂的喷墨打印而直接在芯片上合成寡核苷酸探针。将具有由表面张力确定的反应位点的阵列置于处在一套四个压电喷嘴(一个喷嘴用于4个标准DNA碱基中的一个碱基)下的X/Y平移工作台上。平移工作台沿着阵列的各行移动，并将合适的试剂递送至每个反应位点。例如，Aamidite只被递送至在该合成步骤期间amiditeA进行偶联的位点处。通过冲洗整个表面递送共同的试剂和洗涤剂，然后通过旋转来除去它们。使用Protogene的技术将对于目的SNP或突变来说独特的DNA探针固定在芯片上。然后将该芯片与经PCR扩增的目的基因接触。杂交后，除去未结合的DNA并使用任何合适的方法(例如，通过整合的荧光基团的荧光去猝灭(de-quenching))来检测杂交。.在其他实施方案中，使用"珠阵列(beadarray)"来检测多态性(Illumina，SanDiego,CA;参见例如，PCT公开号WO99/67641和WO00/39587，其各自在此引用作为参考)。Illumina使用将光纤束和自组装成阵列的小珠相组合的珠阵列技术。依赖于束的直径，每个光纤束包含数千至数百万根的单根光纤。用对于给定的SNP或突变的检测来说特异的寡核苷酸包被小珠。将成批的小珠相组合以形成对于该阵列来说特异的库。为了施行测定法，将珠阵列与制备的受试者样品(例如，DNA)接触。使用任何合适的方法来检测杂交。c.杂交的酶促检测在本发明的一些实施方案中，通过特定结构的酶促切割来检测杂交(INVADER测定法，ThirdWaveTechnologies;参见例如，美国专利5，846，717、6,090,543、6,001,567、5，985，557和5，994，069;其各自在此引用作为参考)。INVADER测定法通过使用结构特异性酶以切割由重叠的寡核苷酸探针的杂交而形成的复合物，来检测特定的DNA和RM序列。提高的温度和其中一种探针的过量使得对于每个存在的靶序列多个探针能够被切割而无需温度循环。然后，这些经切割的探针指导第二个经标记的探针的切割。第二个探针寡核苷酸可以在5'末端用荧光染料标记，所述荧光染料是被第二染料或其他猝灭部分猝灭的。切割后，可使用标准的荧光板读取器或设置用于在反应过程中收集荧光数据的仪器(即，"实时"荧光检测仪，例如ABI7700序歹ij检测系统，AppliedBiosystems，FosterCity,CA)来检须'J用去猝灭的染料标记的产物。INVADER测定法检测未扩增的基因组DNA中的特定突变和SNP。在用于检测基因组DNA中的SNP的INVADER测定法的实施方案中，两个寡核苷酸(对于SNP/突变或野生型序列来说特异的第一探针，和INVADER寡核苷酸)一前一后地与基因组DNA杂交从而形成重叠结构。结构特异性核酸酶识别该重叠结构并切割第一探针。在第二反应中，经切割的第一探针与荧光标记的第二探针结合，从而产生另一个被该酶切割的重叠结构。第一和第二反应可在同一个容器中同时进行。如上所述，通过使用荧光检测器来检测第二探针的切割。可将受试样品的信号与已知的正和负对照比较。在一些实施方案中，使用TaqMan测定法(PEBiosystems,FosterCity,CA;参见例如，美国专利5，962，233和5，538，848，其各自在此引用作为参考)来检测结合的探针的杂交.在PCR反应期间施行该测定法。TaqMan测定法利用DNA聚合酶例如AMPLITAQDNA聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性。PCR反应中包含对于给定的等位基因或突变来i兌特异的探针。所述探针由具有5'-报告染料(例如，荧光染料)和3'-猝灭染料的寡核苷酸构成。在PCR期间，如果探针结合至其靶，那么AMPLITAQ聚合酶的5'-3'核溶解活性在报告染料和猝灭染料之间切割探针。报告染料与摔灭染料的分离导致荧光的增加。信号随着每一轮PCR而积累，并且可用荧光计进行监控。在其他实施方案中，使用SNP-IT引物延伸测定法(OrchidBiosciences,Princeton,NJ;参见例3口，美国专利5,952,174和5，919,626，其各自在此引用作为参考)来检测多态性。在该测定法中，通过使用特别合成的DNA引物和DNA聚合酶选择性地将DNA链在怀疑为SNP的位置上延伸一个碱基来鉴定SNP。扩增和变性在目的区域内的DNA。然后使用称为微观流体装置的小型化系统进行聚合酶反应。通过向怀疑处于SNP或突变位置上的核苷酸添加标记来完成检测。可通过任何合适的方法(例如，如果核苷酸包含生物素标记，通过荧光标记的、对于生物素特异的抗体来进行检测)来检测标记整合入DNA中。III.序列输入和用户界面可输入来自许多来源的序列以进行分析。在许多实施方案中，将序列信息输入计算机。所述计算机不必是和进行计算机分析的计算机系统相同的计算机系统。在一些优选的实施方案中，可将候选耙序列输入连接至通讯网络(例如，局域网、因特网或内联网)的计算机中。在这些实施方案中，世界各地能够接入通讯网络的用户可在其自已所在的地方输入候选序列。在一些实施方案中，在通讯网络上为用户提供用户界面(例如，基于环球网的用户界面)，所述界面包含用于计算机分析所需要的信息(例如，候选靶序列的序列)的输入字段。使用基于网络的用户界面具有几个优点。例如，通过提供输入向导，用户界面可确保用户以正确的格式输入需要量的信息，在一些实施方案中，用户界面要求靶序列的序列信息具有最小长度(例如，20或更多、50或更多、IOO或更多个核苷酸)并且以单一格式(例如，FASTA)存在。在其他实施方案中，信息可以以任何格式输入，本发明的系统和方法将输入的信息编辑或改变成适合用于分析的格式。例如，如果输入的靶序列太短，那么本发明的系统和方法就该短序列搜索公共数据库，并且如果鉴定了唯一的序列，则通过在输入的靶序列的一个末端或两将末端上添加核苷酸来将该短序列转化成合适长度的序列。同样地，如果以不希望的格式输入序列信息或所述序列信息包含无关的非序列字符，那么可在进一步进行计算机分析之前将序列改变成标准格式(例如，FASTA)。用户界面还可收集关于用户的信息，包括但不限于用户的名字和地址。在一些实施方案中，靶序列输入与用户识别码相关联。在一些实施方案中，直接从测定法设计软件(例如INVADERCREATOR软件)输入序列。在优选的实施方案中，给予每个序列一个ID号码。将ID号码连接至被分析的靶序列以避免重复分析。例如，如果计算机分析确定对应于输入序列的靶序列已经被分析，则会告知用户，并提供绕过计算机分析和只接受前面获得的结果的选项。网络-定购系统和方法希望定购检测测定法、设计检测测定法或有权使用本发明的数据库或其他信息的用户可使用电子通讯系统(例如，因特网)。在一些实施方案中，本发明的定购和信息系统连接至公共网络以使任何用户能够访问这些信息。在一些实施方案中，提供了私人电子通讯网络。例如，当顾客或用户是老顾客(例如，批发商或大型诊断实验室)时，可在顾客的计算机系统和本发明的系统的计算机系统之间提供全部时间专用的私人连接。可安排所述系统以使人交互作用减小至最低限度。例如，在一些实施方案中，使用库存控制软件监控顾客所拥有的检测测定法的数量和类型.以确定的时间间隔发送查询以确定顾客是否具有合适数目和类型的检测测定法，并且如果检测到缺货，则发送指令以进行设计、生产和/或递送另外的测定法给顾客。在一些实施方案中，系统也监控销售者的库存水平，并在优选的实施方案中，将其与生产系统整合以管理生产能力和时间安排。在一些实施方案中，提供用户友好的界面以有利于检测测定法的选择和定购。因为存在数十万可获得的检测测定法和/或用户可能希望询问的多态性，因此用户友好的界面允许通过选项的复合设置来进行导航。例如，在一些实施方案中，使用一系列堆叠的数据库将用户导向想要的产品。在一些实施方案中，第一层提供生物的所有染色体的展示。用户选择目的染色体。染色体的选择提供出更详细的染色体的图镨，所述图镨显示出染色体上的带区。想要的条带的选择导致显示基因位置的图语。一个或多个另外的详细的层提供了多态性的碱基位置、基因名称、基因组数据库标识标签(identificationtag)、注释、具有可购买的先存在的已开发的检测测定法的染色体区域、其中没有先存在的已开发的测定法(但其可进行设计和生产)的区域，等等。选择区域、多态性、或检测测定法将用户带到定购界面，在该界面信息被收集以开始检测测定法的设计和/或预订。在一些实施方案中，提供了搜索引擎，其中输入基因名称、序列范围、多态性或其他查询，从而更直接地将用户导向合适的信息层。在一些实施方案中，定购、设计和生产系统与财务系统相整合，其中检测测定法的定价由一个或多个因素决定是否需要设计，基于检测测定法中的組分的货物的成本，对于某些客户的专门折扣，批量定购的折扣，再次定购的折扣，当产品涉及知识产权或对第三方的合同付款义务时的价格增加，和基于使用的价格选择。例如，当检测测定法用于或被证实用于临床诊断或保证临床诊断而不是研究应用时，定价增加。在一些实施方案中，临床产品的定价增加自动地发生。例如，在一些实施方案中，本发明的系统与FDA、公共出版物或其他数据库连接以确定产品是否已经被验证可用于临床诊断或ASR用途。实施例提供下列实施例以证明和进一步举例说明本发明的某些优选的实施方案和方面，但其不被解释为限制了本发明地范围。在下面的实验公开内容中，使用下列缩写N(正常)；M(摩尔浓度)；mM(亳摩尔浓度)；uM(微摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；umol(微摩尔)；該ol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；yg(微克)；ng(纳克)；1或L(升)；ml(毫升)；U1(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；pm(微米)；nm(纳米)；DS(多充酸葡聚糖)；C(摄氏度)；和Sigma(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)。实施例1设计对于INVADER测定法的10重(人工)测试下面的实验例子描述了用于多重扩增反应的扩增引物的人工设计，和随后通过INVADER测定法进行的扩增子的检测。从一组预先确认的包含SNP的序列(可在TWT内部寡核苷酸定购条目数据库中获得)中选择10个靶序列。每个靶包含单核苷酸多态性(SNP)，在以前针对该单核苷酸多态性设计了INVADER测定法。通过INVADERCREATOR软件(ThirdWaveTechnologies,Inc.Madison,WI)设计INVADER测定法寡核苷酸，从而该实施例中的足迹区被定义为INVADER"足迹"，或被INVADER和探针寡核苷酸覆盖、对于检测目的碱基(在该情况下为单核苷酸多态性)来说具有最佳定位的碱基。对扩增引物设计分析，使SNP碱基大致位于序列的中心。根据探针解链温度Tn的范围为50-601C,确定最大和是小探针长度(缺省值分别为30个核苷酸和12个核苷酸)的标准.在该实施例中，为了选择在预先选择的反应温度下表现最佳的探针序列，^使用用于DNA双链体形成的最临近模型和公开的参数(Allawi和SantaLucia,》/oc/e迈""/，36:10581[1997]，此处引用作为参考)来计算寡核苷酸的解链温度CL)。因为测定法的盐浓度通常与其中获得最邻近参数的溶液条件(lMNaCl，和无二价金属)不同，并且因为酶的存在和浓度影响最佳反应温度，所以应当对计算的L进行调整以确定进行反应所处的最佳温度。补偿这些因素的一个方法是在解链温度计算值范围内改变提供的盐浓度的值。该调整称为'盐效校正，。术语"盐效校正，，是指为了反映影响所述双链体的非盐参数或条件对于核酸双链体的L计算值的影响，在提供的盐浓度的值上产生的变化。提供的链浓度的值的变化也会影响这些计算的结果。通过使用280nMNaCl的值(SantaLucia,^〃〃SJ，95:1460[1998]，此处引用作为参考)以及大约10pM探针和1fM靶的链浓度，已对于用于计算探针-靶解链温度的算法进行调整以适合用于预测最佳引物涉及序列。然后，扫描与足迹区相邻的序列(上游和下游)，并将第一个A或C选择为设计起始点，这样将引物描述为5'-N[x]-N[x-l]--N[4]-N[3卜N[2〗-N[1〗-3'，其中N[l]应当为A或C。通过使用下列规则避免引物的互补性给定的寡核苷酸引物的N[2]-N[1]不应当与任何其他寡核苷酸的N[2]-N[1]互补，和N[3]-N[2]-N[1]不应当与任何其他寡核普酸的N[3]-N[2]-N[l]互补。如果这些标准在给定的N[l]处得不到满足，那么正向引物的5'方向中的下一个碱基或反向引物的3'方向中的下一个碱基将被当作N[l]位点进行评价。在人工分析的情况下，乾向A/C富集的区域以使3'末端的互补性最小化。在该实施例中，在多重扩增反应后进行INVADER测定法。因此，也整合了第二INVADER反应寡核苷酸(FRET寡核苷酸序列)那部分作为引物设计的标准；扩增引物序列应当与FRET寡核苷酸的特定区域具有低于80%的同源性。按照标准的寡核苷酸化学来合成所有引物，进行脱盐(按照标准的方法)，和通过A260处的吸光率进行定量并稀释成50uM的浓缩母液。然后使用等摩尔量的引物(O.OlwM/引物)在下列条件下采用10重PCR进行多重PCR:50ul反应体系中，100mMKCl、3mMMgCl2、10mMTrispH8.0、200uMdNTPs、2.5UTaqDNA聚合酶和10ng人基因组DM(hgDNA)模板。温育反应体系(941C/30秒，50n/44秒)，进行30个循环。温育后，用水将多重PCR反应体系作1:IO稀释，并使之接受使用INVADERAssayFRET检测平板(96孔genomicbiplex)、lOOng裂解酶VIII的INVADER分析，如下将INVADER测定法装配为15y1的反应体系In1PCR反应体系的1:10稀释物、3u1PPI混合物、5yl22.5mMMgCl2、6uldH20，用15ulCHILLOUT液体蜡覆盖。在INVADERbiplex中通过在95X:下温育5分钟来变性样品，随后在63t:下温育，并在不同时间点上在Cytofluor4000上测量荧光。通过使用下列标准精确地进行基因分型判读(cal1)(FOZ—FAM+FOZ—RED-2〉0.6)，在63C下温育10分钟后10个INVADER测定法判读中只有2个可以进行，在63L下再温育50分钟(60分钟)后IO个判读中只有5个可以进行。在60分钟的时间点上，可检测的FOZ值之间的变化超过最强信号(41646，FAM-F0Z+RED-F0Z-2=54.2，其也远在读取器的动态范围之外)和最弱信号(67356，FAM—F0Z+RED-F0Z-2-0.2)之间的IOO倍。通过4吏用直接针对100ng人基因组DNA的相同INVADER测定法(其中可获得等摩尔量的每个靼)，所有读数可在读取器的动态范围内产生，并且FOZ值的变化为该测定法的最强(53530，FAM-F0Z+RED—F0Z-2=3.1)和最弱(53530，FAM-F0Z+RED-F0Z-2-0.43)之间的大约7倍。这暗示，在相同的多重PCR反应中观察到的不同扩增子之间的FOZ值的显著差异是偏倚扩增的作用结果，而不是归因于INVADER测定法的可变性的作用结果。在这些条件下，由不同INVADER测定法产生的FOZ值相互之间可直接比较，并且可以可靠地用作扩增效率的指标。使用FOZ值对给定扩增子的扩增系数进行评估，为了估量给定的扩增子的扩增系数(F)，可使用INVADER测定法的FOZ值来估量扩增子丰度。可直接将在给定时间(F0Zm)内具有未知浓度的给定的扩增子的FOZ与在确定的时间点(凡《"，240分钟)上的已知量的靶(例如，100ng基因组DNA=30，000个拷贝的单基因)的F0Z进行比较，并将其用于计算未知扩增子的拷贝数。在公式1中，尸《K表示在INVADER测定法中温育给定量的时间(迈)的未知浓度的把的RED-FOZ和FAM-FOZ之和。凡《"。表示在第240分钟时使用已知拷贝数的耙(例如100ng的hgDNAs30，000个拷贝)，通过经验确定的RED_F0Z(使用INVADER测定法41646)的值。F-(CPOZ"'-1"500/CPOZ柳—l))*(240/w)A2(公式la)尽管公式la用于确定引物浓度和扩增系数^之间的线性关系，但公式la，用于计算10重PCR的扩增系数F(两者都使用等摩尔量的引物和优化的引物浓度)，其中"的值表示PCR反应体系的稀释系数。在以50y1多重PCR反应体系的1:3稀释的情况下，D-0.3333。F=((FOZ—2)*500/(FC>Z24。—1)*")*(240//")A2(公式la，)尽管公式la和la，将用于10重的多重PCR的描述，但该公式的更恰当的适用是用于在107重PCR中优化引物浓度。在该情况下，尸OZ"。-使用hgDNA作为靶时在整个INVADERMAP平板上的FAM—FOZ24。+RED—F0Z^的平均值(-3.42)，并且稀释系数D被设置为0.125。F=((尸OZ",-2)*500/(尸OZ240-2)*D)*(240/m)A2(公式丄b)应当指出，为了更精确地估量扩增系数F，FOZ值应当在于其上进行读数的仪器的动态范围之内。在用于本研究的Cytofluor4000的情况下，动态范围在大约1.5和大约12的FOZ之间。第3部分.扩增系数和引物浓度之间的线性关系为了确定引物浓度和扩增系数(F)之间的相互关系，分别在0.01jliM、0.012pM、0.014jjM、0.020|aM的浓度下使用引物1117-70-17和1117-70-18进行4个不同的单重PCR反应。在下列条件下进行4个独立的PCR反应lOOmMKC1、3mMMgCh、10mMTrispH8.0、200pMdNTPs，使用10ng的hgDNA作为模板。在(941C/30秒,50^/20秒)下进行温育，进行30个循环。在PCR后，用水以1:10稀释反应体系，并使用INVADERAssayFRET检测平板(96孔genomicbiplex)、lOOng裂解酶VIII在标准条件下进行分析。如下建立每个15ul反应体系lu11:IO稀释的PCR反应体系、3u1PPI混合物SNP#47932、5u122.5mMMgCl2、6u1水、15u1CHILLOUT液体蜡。将整个平板在95X:下温育5分钟，然后在63C下温育60分钟，在该时间点上，在Cytofluor4000荧光平板读取器上进行单点读数。对于4种不同引物浓度(O.OliiM、0.012uM、0.014uM、0.020uM)中的每种浓度，使用公式la来计算扩增系数尸，其中/^厶=在60分钟时的FOZ—FAM和FOZ-RED之和，,60，和月Z"产l.7。在绘制每个反应的引物浓度对扩增系数的对数Log(F)的图中，发现强的线性关系。通过使用这些数据点，将描述了扩增系数和引物浓度之间的线性关系的式描述于公式2中Y=1.684X+2.6837(公式2a)通过使用公式2，可使用已知的引物浓度(X)以可预测的方式操控给定的扩增子的扩增系数Log(F)-Y。以相反的方式，可以将在多重PCR中在等摩尔引物浓度的条件下观察到的扩增偏倚测量为基于扩增系数f的"表观"引物浓度(X)。在多重PCR中，可将在不同扩增子中的"表观"引物浓度的值用于估量对于使不同基因座的扩增一致所需的各扩增子的引物的量X=(Y-2.6837)/1.68(公式2b)第4部分.来自平衡的多重混合物的表观引物浓度的计算如前面部分所描述的，引物浓度可直接影响给定的扩增子的扩增系数。在等摩尔量的引物的条件下，通过使用公式2,FO&读数可用于计算各扩增子的"表观"引物浓度.用给定的扩增系数的log(F)取代公式2中的Y并求出X，产生基于多重反应中给定扩增子的相对丰度的"表观"引物浓度。使用公式2来计算多重反应中的所有引物(以等摩尔浓度提供的)的"表观"引物浓度，提供了使引物组相互之间标准化的手段。为了推算出应当加入至"优化的"多重引物混合物W中的每种引物的相对量，应当将每个"表观"引物浓度分成最大表观引物浓度(Xnax)，从而将最强的扩增子设置为1的值，其余扩增子设置为等于或大于1的值。R[nKax/X[n](公式3)通过使用R[n]的值作为相对引物浓度的任意值，将R[n]的值乘以恒定的引物浓度从而提供出在给定的多重反应中的各引物的工作浓度。在所显示的例子中，对应于SNP测定法41646的扩增子具有等于1的R[n]值。所有的R[n]值都乘以0.01nM(等摩尔多重PCR反应中的原始起始引物浓度)，这样最低引物浓度为被设置为1的41646的R[n]或0.OIjliM。其余的引物组也按比例增加。下面描述具有"优化的"引物混合物的多重PCR的结果。第5部分.通过在多重PCR中使用优化的引物浓度，大大减少了在10个INVADER测定中的F0Z的变化使用基于体积的不同量的引物(X[max]是SNP41646，设定lx=0.OluM/引物)，使用IO重PCR来进行多重PCR。在与用于等摩尔引物混合物的条件相同的条件下进行多重PCR:50p1反应体系中，100mMKC1、3mMMgCh、10mMTrispH8.0、200pMd證s、2.5Utaq和10nghgDNA模板。将反应体系在(941C/30秒，501C/44秒)的条件下温育，进行30个循环。温育后，用水将多重PCR反应体系作1:IO稀释，并使之接受INVADER分析。通过使用INVADERAssayFRET检测平板(96孔genomicbiplex，lOOng裂解酶VIII)，如下将反应体系装配为15ii1的反应体系In1PCR反应体系的1:IO稀释物、3ul合适的PPI混合物、5u122.5mMMgCh、6n1dH20。向各孔中加入额外的15u1CHILLOUT,然后在95C下温育5分钟.将平板在63^C下温育，并在10分钟时在Cytofluor4000上测量荧光，通过使用下列标准精确地进行基因分型判读(F0Z-FAM+F0Z-RED-2>0.6)，在63匸下温育10分钟后，10个INVADER判读中的所有10个(100%)都可以进行。此外，FAM+RED-2的值(总的信号产生的指标，直接与扩增系数相关(参见公式2))在最低信号(67325，FAM+RED-2-0.7)和最高信号(47892，FAM+RED-2=4.3)之间的变化低于7倍。实施例2使用应用软件进行的101重PCR的i殳计通过4吏用TWTOligoOrderEntryDatabase,获得长度小于200个核苷酸的144个序列，它们具有SNP，所述SNP通过使用括号标示各序列的SNP位置来注释(例如，NNNNNNN[N(wt)/N(t)]NNNNNNNN)。为了扩展位于目的SNP的侧翼的序列数据，使用BLAST分析将序列扩展至大约lkB的长度(在SNP的每一侧侧翼连接有500nt)。在144个起始序列中，16个不能通过BLAST进行扩展，产生扩展至大约lkB长度的128个序列的最终组。以Excel格式将这些经扩展的序列与下列各序列的信息一起提供给用户(1)TWT编号、(2)短名称标识符和(3)序列。将Excel文件转换成逗号分隔格式，并用作PrimerDesignerINVADERCREATORvl.3.3.软件(该版本的程序不筛选引物的FRET反应性，也不允许用户指定引物的最大长度)的输入文件。除了被设置为60t:的Tnw外，使用缺省条件(例如12的最小引物大小，30的最大引物大小)来运行INVADERCREATORPrimerDesignervl.3.3.。输出文件包含128个引物组(256个引物)，其中4组(SNP#47854、47889、54874、67396)由于引物序列的长度过长而被放弃，剩下的124个引物组(248个引物)可用于进行合成，使用标准方法以200nmol的规模合成其余的引物，并通过脱盐进行纯化。在合成失敗后，107个引物组可用于装配等摩尔的107重引物混合物(214个引物)。在可用于扩增的107个引物组中，只有101个存在于用于评估扩增系数的INVADERMAP平板上。在下列条件下，使用等摩尔量的引物(0.025jliM/引物)，使用101重PCR进行多重PCR:50ul反应体系中，100mMKCl、3mMMgCl2、lOmMTrispH8.0、200pMdNTPs和10ng的人基因组DNA(hgDNA)模板。在95C下变性IO分钟后，加入2.5个单位的Taq并将反应体系在(94X:/30秒，50'C/44秒)下进行温育，进行50个循环。温育后，用水将多重PCR反应体系作l:24稀释，并使之接受使用INVADERMAP检测平台的INVADER测定法分析。如下以6pl反应体系进行各INVADERMAP测定3ii1PCR反应体系的1:24稀释物(总稀释度1:8，相当于/>=0.125)、3y115mMMgCl2，用6ja1CHILLOUT覆盖。通过在95X:下温育5分钟，将样品在INVADERMAP平板中进行变性，然后在631C下温育，并在160分钟内在不同的时间点上在Cytofluor4000(384孔读取器)上测量荧光。在10、20、40、80、160分钟计算的FOZ值的分析显示，可以对通过INVADERMAP平台可检测的101个扩增子中的94个作出正确的判读(与相同DNA样品的基因组判读相比较)。这提供了证据证明，INVADERCREATORPrimerDesigner软件可产生在高度多重PCR中起作用的引物组。在使用通过整个160分钟时程获得的FOZ值中，计算101个扩增子中的每个扩增子的扩增系数F和R[n]。将R[nmax]设定在1.6，这虽然对不能在160分钟提供足够的FO乙信号的扩增子进行了低末端校正，但仍给R[n]赋予了12的任意值。对于其FOl值在第IO分钟读出的扩增子的高末端校正，任意地赋予1的R[n]值。使用在10重例子中概述的基本原理和公式lb来计算101重的优化的引物浓度，其中1的R[n]对应于0.025uM引物(关于各种引物的浓度，参见图15)。在下列条件下进行多重PCR:50p1反应体系中，100mMKCl、3mMMgCl2、10mMTrispH8.0、200uMdNTPs和lOng人基因组DNA(hgDNA)模板。在95TC下变性IO分钟后，加入2.5个单位的Taq并将反应体系在(94iC/30秒，501C/44秒)下进行温育，进行50个循环.温育后，用水将多重PCR反应体系作l:24稀释，并使之接受使用INVADERMAP检测平台的INVADER分析。如下以6u1反应体系进行各INVADERMAP测定3ulPCR反应体系的1:24稀释物(总稀释度1:8，相当于/>=0.125)、3ul15mMMgCl2，用6m1CHILL0UT覆盖。通过在95n下温育5分钟，将样品在INVADERMAP平板中进行变性，然后在63"C下温育，并在160分钟内在不同的时间点上在Cytofluor4000(384孔读取器)上测量荧光。在IO、20和40分钟进行FOZ值的分析，并将其与直接针对基因组DNA所作的判读进行比较。将用具有等摩尔引物浓度的101重PCR在IO分钟所进行的判读与用在优化的引物浓度下施行的101重PCR在10分钟所进行的判读进行比较。在等摩尔引物浓度下，多重PCR在IO分钟的时间点上只产生50个正确的判读，而在优化的引物浓度下，多重PCR产生71个正确的判读，导致获得21个(42%)新的判读。尽管不能在IO分钟时间点上产生所有101个判读，但可在40分钟时间点上产生94个判读，这表明大部分扩增子的扩增效率得到提高。和只需要单轮优化的IO重优化不同，对更复杂的多重反应可能需要多轮优化以平衡所有基因座的扩增。实施例3INVADER测定法用于确定PCR的扩增系数的用途可使用INVADER测定法来监控PCR反应期间扩增的进程，即确定反映反应中特定扩增子的扩增效率的扩增系数F。特别地，通过参照从经定量的参照DNA分子产生的标准曲线，可将INVADER测定法用于测定在PCR反应的任何时间点上存在的分子的数目。将扩增系数F测量为扩增后PCR产物浓度对起始靶浓度的比率。该实施例证明了改变引物浓度对测得的扩增系数的影响。进行循环次数可变的(以5为增量，即5、10、15、20、25、30次循环)PCR反应，这样可通过使用INVADER测定法测量积累的产物来估计反应的进程。对反应体系进行连续稀释以确保靶的量不使INVADER测定法饱和，即，这样使得可在测定法的线性范围内进行测量。使用包含已知量的扩增子的连续稀释物产生INVADER测定法标准曲线。该标准曲线用于推断出，在指定数目的循环后，在PCR反应中扩增的DM片段的数目。将在给定的PCR循环次数后的分子数目对扩增前存在的分子数目的比率用于推导出每个PCR反应的扩增系数F。PCR反应使用等摩尔量的引物(例如，0.02uM或0.lyM引物，终浓度)进行PCR反应。对于各受试扩增的水平即5、10、15、20、25和30个PCR循环，以三次重复进行每种引物浓度下的反应。制备一份母混合物(mastermix)，其足以进行6个标准PCR反应(每个三次重复X2种引物浓度)加2个对照X6个测试(5、10、15、20、25或30个PCR循环)，加上足以进行额外反应而允许超额。PCR反应产物的连续稀释为了确保作为耙加入至INVADER测定法反应中的PCR产物的量不超过PERSEPTIVEBIOSYSTEMSCYTOFLUOR4000上的实时测定的动态范围，在加入至INVADER测定法之前稀释所述PCR反应产物。对各反应进行起始20倍的稀释，然后进行随后的5倍的连续稀释。为建立标准，使用标准的方法从非变性聚丙烯酰胺凝胶分离扩增产物并使用PICOGREEN测定法进行定量，所述扩增产物是使用用于不同循环次数的测试中的相同引物产生的。建立200pM的工作母液，在含有30ng/u1的tRNA的dH20中产生这些浓度标准的连续稀释，从而产生具有O.5、1、2.5、6.25、15.62、39和100fM的终扩增子浓度的系列。INVADER测定法反应以三次重复制备每个PCR反应体系的合适稀释物和无靶对照，并在标准的单次INVADER测定法反应中进行测试。对所有INVADER测定反应制备一份母混合物.总共有6个PCR循环条件X24个单个测试测定法[(三次重复稀释度的1个测试X2种引物条件X3次PCR重复)=18+6个无乾对照],此外，在标准的系列中存在经定量的扩增子标准的7个稀释度和1个无靶对照。在两块板的每个上重复分析标准系列以进行额外的32个INVADER测定。INVADER测定的总数为6X24+32-176。母混合物包含用于32个反应的储备量。INVADER测定法母混合物包含下列标准组分用于192+16个孔的FRET緩冲液/裂解酶XI/Mg/PPI混合物。PPI混合物中包含下列寡核普酸。用于测定2的0.25uMINVADER(GAAGCGGCGCCGGTTACCACCA)用于测定2的2.5yMA探针(CGCGCCGAGGTGGTTGAGCAATTCCAA)用于测定2的2.5yMG探针(ATGACGTGGCAGACCGGTTGAGCAATTCCA)。所有小孔用15nl的矿物油覆盖，在951C下温育5分钟，然后依赖于产生的信号水平以不同的间隔例如20、40、80或160分钟在63t;下进行读数。在CytoFluorSeries4000荧光多孔平板读取其上读取反应平板。所用的设置为对于F染料检测，485/20nm激发/带宽和530/25nm发射/带宽，和对于R染料检测，560/20nm激发/带宽和620/40nm发射/带宽。设置对于每种染料的仪器增益(instrumentgain)以使无靶空白对照产生100至200之间的绝对荧光单位(AbsoluteFluorescenceUnits)(AFUs)。结果当在扩增系数的以IO为底的对数(y轴)作为循环次数(x轴)的函数的曲线图中图解三次重复INVADER测定的结果时，通过对标准曲线的外推而从INVADER测定估算PCR产物的浓度。没有对来自重复测定的数据进行平均，而是在图中以多个重叠的点的方式呈现所述数据.这些结果表明PCR反应在受试循环范围内是指数性的。不同引物浓度的使用导致不同的斜率，从而从用较高引物浓度(0.luM)进行的PCR反应的INVADER测定分析产生的斜率比用较低浓度(0.02uM)产生的斜率更陡。此外，使用0.lwM获得的斜率接近预期为完全加倍的斜率(0.301)。来自在每种引物浓度下的PCR反应的扩增系数获自下列斜率对于0.1yM引物，斜率-0.286;扩增系数1.93对于O.02uM引物，斜率-O.218;扩增系数1.65。直线看上去并不延伸至原点而是在0和5个循环之间与X轴相截，可能反映了在估算人基因组DNA的起始浓度方面的误差。因此，这些数据显示，引物浓度在PCR反应期间影响扩增的程度。这些数据还证明，INVADER测定法是在整个PCR反应中监控扩增的有效工具。实施例4扩增系数对引物浓度的依赖性该实施例证明了扩增系数F和引物浓度c之间的关联性。在本实验中，从在单重PCR反应(每个SNP以4种不同的引物浓度)中扩增的6个SNP中的每一个确定2个等位基因的F,因此6个引物对X2个基因组样品X4种引物浓度=48个PCR反应。虽然在实施例3中，以两种引物浓度，在单个扩增区域上测试了PCR循环次数的效果，但在本实施例中，所有受试PCR反应都进行20个循环，但在4种不同浓度水平上研究改变引物浓度的效果0.OluM、0.025yM、0.05uM、0.1pM。此外，本实验检查不同基因组区域的扩增的差异，从而调查(a)不同的基因组区域是否被扩增至不同的程度(即PCR偏倚)和(b)不同基因组区域的扩增是如何依赖于引物浓度的。如实施例3中所示，通过使用纯化的、经定量的参照扩增子制剂的稀释系列产生各基因座的标准曲线来测量F。在该情况下，产生12种不同的参照扩增子一种对应于每个由引物对扩增的在6个基因组区域中包含的SNP的等位基因.在INVADER测定法中测试每种参照扩增子浓度，并产生荧光计数对扩增子浓度的标准曲线。还对基因组DNA样品进行PCR反应，稀释产物，然后在INVADER测定法中进行测试，以依照分子的数目通过与标准曲线比较来确定扩增的程度。a.使用经定量的参照扩增子来产生标准曲线为了鉴定在总共6个不同基因座上对于野生型或变体等位基因是纯合的样品，在标准的双重INVADER测定法中筛选从全血中分离的总共8个基因组DNA样品以确定它们在24个SNP上的基因型。在这些基因座被鉴定后，在分开的PCR反应中分析野生型和变体基因组DNA样品，所述PCR反应使用位于包含每个SNP的基因组区域的侧翼的引物。在每个SNP处，一个等位基因对FAM染料作出报告，一个对RED作出报告。然后在标准的单个、单重PCR反应中扩增合适的基因组DNA制剂以产生用作如实施例3中描述的PCR参照标准的扩增片段。在进行PCR后，使用标准的方法对扩增的DNA进行凝胶分离，并事先使用PICOGREEN测定法进行定量。如下产生这些浓度标准的连续稀释稀释各纯化的扩增子以产生浓度为200pM的工作母液。然后，如下对于这些母液进行连续稀释。在含有30ng/u1的tRNA的dH20中配制浓度为1.25pM的各扩增子的工作母液。在96孔微量滴定板中稀释该工作母液，然后连续稀释以产生下列在INVADER测定法中的终浓度1、2.5、6.25、15.6、39、100和250fM。一块平板准备用于待在使用对FAM染料作出报告的探针寡核苷酸的INVADER测定法中进行检测的扩增子，和一块平板准备用于待使用对RED染料作出报告的探针寡核普酸进行测试的扩增子。分析所有扩增子稀释物，进行两次重复。在该方案中，将lOOu1的等分试样转移至96孔MJResearch平板中，并在加入至INVADER测定法之前在951C下变性5分钟.b.在不同引物浓度下的基因组样品的PCR扩增以4种不同的引物浓度建立PCR反应，以用于在2个等位基因中每个等位基因上的前面实施例中描述的6个基因组区域的单个扩增，总共48个PCR反应。所有PCR进行20个循环。测试下列引物浓度0.OluM、0.025uM、0.05uM和0.luM。按照标准方法(除了改变的引物浓度外)制备用于所有48个反应的母混合物，还加上用于额外23个反应的超额部分(准备16个反应但不使用，和准备7个额外反应的超额部分)。c.PCR反应体系的稀释在由INVADER测定法进行分析之前，必需如实施例1和2中所描述的，稀释PCR反应的产物。对于每个SNP,使用一个96孔平板对48个PCR反应中的每一个进行连续稀释。平板的左半部分包含待用对FAM作出报告的探针寡核苷酸进行测试的SNP;右半部分，则使用对RED作出报告的探针寡核苷酸。初始稀释度为1:20;随后的稀释度为1:5至1:62，500。d.PCR稀释物和参照扩增子的INVADER测定法分析在标准的双重INVADER测定法中，对每个PCR反应的产物的所有稀释度以及每个经定量的参照扩增子的指定稀释度(以产生每个扩增子的标准曲线)进行INVADER分析。用15li1的矿物油覆盖所有小孔。将样品加热至95"C进行5分钟以进行变性，然后在64X:下温育。在40和80分钟在CytoFluor4000荧光平板读取器(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)中进行荧光测量。所用的设置为对于F染料检测，485/20nm激发/带宽和530/25nm发射/带宽，和对于R染料检测，560/20nm激发/带宽和620/40nm发射/带宽。设定对于每种染料的仪器增益以使无靶空白对照产生在100至200之间的绝对荧光单位(AFUs).原始数据是由用于测量测定法性能(实时或终点模式)的设备/仪器产生的数据。这些结果表明，/"F对c的依赖性证明了在相同反应条件下12个PCR的扩增速率不同，尽管在每一对代表相同SNP的靶内差异要小得多。扩增系数在低引物浓度时强烈地依赖于c，在较高的引物浓度时趋向于平稳。该现象可根据引物退火的动力学来解释。在高引物浓度时，快速退火动力学确保引物结合至所有靶并且获得最大扩增速率，相反地，在低引物浓度时，引物退火动力学变成了减少尸的限速步骤。该分析暗示，在ln。-F")对c的坐标中将扩增系数作为引物浓度的函数进行作图应当产生具有斜率-i丄的直线。在ln。-F")对c的坐标中数据的重新作图证明了预期的低引物浓度(低扩增系数)的线性依赖性，所述线性依赖性在0.lnM引物浓度(F为105或更大)处由于低于预期的扩增系数而偏离了线性。可使用下列公式来计算每个PCR的1丄值。实施例5192重PCR反应的INVADER测定法分析本实施例描述了使用INVADER测定法来检测设计用于扩增人基因组中192个不同基因座的高度多重化的PCR反应的产物。基因组DNA的提取从5ml全血中分离基因组DM,并使用由GentraSystems,Inc.(Minneapolis,MN)生产的Autopure进行纯化。将纯化的DNA置于500u1的dH20中。引物设计使用PrimerDesigner(版本1.3.4)来设计192个基因座的正向和反向引物组(参见上面的引物设计部分，包括图8)。将用于INVADER设计的靶序列(相关SNP位点的侧翼连接有不超过500个碱基)转变成逗号分隔的文本文件，以用作PrimerDesigner的输入文件。除了设定在60t:的oligo"L外，使用缺省参数运行PrimerDesigner。引物合成在使用标准方法在Polyplex(GeneMachines，SanCarlos,CA)中合成寡核苷酸引物。规模为0.2umole，只在NAP-10上脱盐(不纯化)，并且不干燥。PCR反应产生两个母混合物。母混合物1包含用于扩增基因座1-96的引物；母混合物2包含用于扩增基因座97-192的引物。按照标准的方法制备混合物，且所述混合物包含标准组分。所有引物以0.025yM的终浓度存在，具有lOOmMKC1和3mMMgCl2。在MJPTC-100热循环仪(MJResearch,Waltham，MA)中PCR循环条件如下951C下进行15分钟；941C下进行30秒，然后在551C下进行44秒，50个循环。循环后，合并所有4个PCR反应体系，然后使用CYBI-well2000自动吸移工作站(automatedpipettingstation)(CyBioAG，Jena，Germany)将3u1的等分试样分配入384深孔平板中。该仪器使得能够单独地试剂加入至384孔微量板的每个孔中。将要被加入的试剂自身排列在384半深孔板中。INVADER测定法反应使用CYBI-well2000进行INVADER测定。向合适的小孔中加入3u1的基因组DNA靶的等分试样。无靶对照由3ulTe(10mMTris，pH8.0，0.lmMEDTA)组成。用于INVADER测定法的试剂是标准的PPI混合物、緩冲液、FRET寡核苷酸和裂解酶VIII,并通过CYBI-well2000将其单独地加入至每个孔。在试剂加入后，用6ul矿物油覆盖各孔。在MJPTC-200DNAENGINE热循环仪(MJResearch)中将平板加热至95"C进行5分钟，然后冷却至631C的温育温度。在20分钟和40分钟后使用Safire微量板读取器(Tecan，Zurich,Switzerland),4吏用下列i史置读取荧光对于F染料检测，495/5nm激发/带宽和520/5nm发射/带宽；和对于R染料，600/5nm发射/带宽，575/5nm激发/带宽，Z位置，5600ns;闪光次数，10;滞后时间，0;积分时间(integrationtime),40usec。将对于F染料的增益设置在90nm，对于R染料设置在120nm。原始数据是由用于测量测定法性能(实时或终点模式)的设备/仪器产生的数据。在192个反应中，在20分钟后可对157个作出基因型判读，在40分钟后对158个或总共82%的反应作出基因型判读。对于所述测定中的88个测定，可从下列来源获得用于比较的基因分型结果先前使用单重PCR,随后通过INVADER分析而获得的数据，或者直接从基因组DNA的分析获得的INVADER结果。对于69个结果，没有获得确证性的基因型结果。本实施例显示，在单个多重化的PCR反应中可能扩增超过150个基因座。本实施例还显示，当用作INVADER测定法中的靶时，在这样的多重化的PCR反应中产生的每种扩增片段的量足以产生可辨别的基因型判读。此外，在该多重PCR测定法中产生的许多扩增子在INVADER测定法中产生高信号(测量为FOZ),而一些产生低信号以致于不能进行基因型判读。其他扩增子以这样低的水平存在或根本不存在，以致于它们不能在INVADER测定法中产生任何信号。实施例6优化引物浓度以提高高度多重化的PCR反应的性能多重PCR中的单独的反应之间的竟争可加重扩增偏倚性，并可引起扩增系数的总体减少(与单重PCR相比)。扩增系数对引物浓度的依赖性可用于减轻PCR偏倚性。从在前面实施例的192重PCR中扩增的不同基因座产生的信号的可变水平，结合来自实施例3的结果(所述结果显示引物浓度对扩增系数的影响)，进一步表明可能可通过调节引物浓度来提高产生足够用于INVADER测定法的靶的PCR反应的百分比。例如，在实施例5中分析的一个特定样品在INVADER测定法中温育40分钟后产生29.54FAM和66.98RED的F0Z结果，而另一个样品在40分钟后分别产生1.09和1.22的F0Z结果，这支持了存在不足以产生基因型判读的信号的判断。引物浓度的调节(在第一个样品的情况下是下调而在第二个样品的情况下是上调)应当使得能够将这两个样品的扩增系数向相同的值接近。可以想象这种调节可以是重复的过程，需要超过一次改变来使扩增系数充分地相互接近，从而使在多重PCR反应中的大多数或所有基因座以大致相同的效率被扩增。实施例7多重实例原则上，可以以多重形式进行PCR扩增，在所述多重形式中在同一个管中扩增多个基因座。然而，实践中，该方法可以由于PCR偏倚性的原因而导致单种经扩增的产物的高度可变的产量。本实例描述了使扩增偏倚性最小化的多重反应条件的优化。扩增偏倚性是由单独的反应之间的可变的扩增速率引起的，所述可变的扩增速率导致在大量循环后PCR产物产量的显著差异。在本实施例中，在反应的全程范围内分析PCR耙扩增，并使用定量INVADER测定法来调查影响PCR产量的参数。根据本工作，开发了阐明扩增偏倚性的根本性机制的模型，所述模型描述了靶扩增系数对引物浓度和引物退火时间的依赖性。通过使用6重PCR作为模型系统来测试使偏倚性最小化的不同条件，鉴定了两种方法，第一种方法依赖于调节引物浓度以平衡不同基因座的扩增系数。在第二种方法中，对于所有单独的反应，引物浓度保持相同，但优化引物退火时间和扩增循环的数目以使扩增偏倚性减少至最低。优化的PCR条件用于进行8个基因组DNA样品的192重PCR扩增，和用于使用INVADER测定法的基因分型。材料和方法材料。除非另外指出，化学药品和緩冲液来自FisherScientific,如所描述的(5)纯化结构特异性5'核酸酶Cleavase1(ThirdWaveTechnologies)。在50%甘油、20mMTrisHCl(pH8)、50mMKCl、0,5%Tween20、0.5%NonidetP40、100pg/mlBSA中透析和J^存所述酶。除非另外指出，A、G、C和T是指脱氧核糖核苷酸。基因组DNA的制备。使用AutoPureLS仪器(GentraSystems,Minneapolis,MN)从10ml白细胞中制备8个基因组DNA样品Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G7和G8。在含有10mMTrisHClpH8.0、0.lmMEDTA的Te緩冲液中将纯化的DM稀释至13.3ng/u1。寡核苷酸合成。使用PerSeptiveBiosystems仪器和标准的亚磷酰胺化学试剂(包括A、G、C、T、6-羧基荧光素染料(FAM)(GlenResearch)、RedmondRED染料(RED)(EpochBiosciences,Redmond,WA)和EclipseDarkQuencher(Z)(EpochBiosciences))来合成在使用单重和6重PCR反应体系的INVADER测定法中所使用的寡核普酸。使用ResourceQ柱(Amersham-PharmaciaBiotech,Newark,NJ)通过离子交换HPLC来纯化第一探针和FRET盒，通过在NAP-IO柱(Amersham17-0854-02)上脱盐来纯化侵入性探针。由BiosearchTechnologies使用C16CPG柱(BiosearchTechnologies,Novato，CA，BG1-SD14-1)来合成用于192重PCR测定法的第一探针，并使用SuperPurePlusPurification柱(Biosearch,SP-2000-96)进行纯化。合成用于192重测定法的侵入性探针，并由BiosearchTechnologies使用trity卜on5'捕获纯化来进行纯化。由IntegratedDNATechnologies,Chicago,IL合成PCR引物，分别使用A、C、G和T在260nm的吸光率(A26。)以及消光系数15,400、7,400、11,500和8，700A260M^来确定寡核苷酸浓度。用于多重PCR的引物设计。以开发了计算机程序，PrimerDesigner软件(ThirdWaveTechnologies;Madison,WI，参见图8和上面的引物设计部分的讨论)，来帮助设计用于多重PCR的引物和减少引物二聚体形成的概率。与上述和图8中的引物设计讨论相结合地，使用下列参数用PrimerDesigner软件设计用于多重形式的PCR引物。对于待扩增的每个基因座，SNP的每一侧包含500个核苷酸，从而每基因座总共1001个碱基。对于每个基因座，确定侵入性和第一探针的结合所需的60-80个核苷酸的序列，并通过从该区域向外"步行(walking)"来鉴定候选正向和反向PCR引物。基于下列标准选择候选引物(1)引物必须在3'末端具有A或C以避免引物二聚体的形成；(2)引物的L是601C(11，12);(3)引物长度应该在12和30个核苷酸之间；(4)任何引物的2个和3个3'末端碱基不应当与多重PCR混合物的任何其他引物的2个和3个3'末端碱基互补；(5)应当没有引物与任一INVADER第一探针的经切割的5，臂序列具有超过80%的序列相似性。通过设计用于随机选择的基因座的前两个引物来起始该算法，并通过重复地将更多的引物加入库中而继续进行该算法。如果对于其中一个基因座不能设计出引物，那么使用新的随机选择的基因座重新开始该算法。INVADER测定法设计。用在其他地方描述的INVADERCreator算法(Lyaniichev,V.和Neri，B.(2003)INVADERassayforSNPgenotyping.MethodsMolBiol,212，229-40，此处引用作为参考)来设计用于INVADER测定法的第一和侵入性探针。用于INVADER测定法1-6的探针序列分别对应于PCR1-6。使用相同的算法设计对于192重PCR实验的192个INVADER测定的序列。使用INVADER测定法的PCR的定量分析。在50u1GeneAmpPCR緩沖液(PEBiosystems，FosterCity,CA)中进行单重或6重形式的PCR1-6，所述緩冲液包含本文中指明的浓度的引物、0.2mMdNTPs、lu1(5U/u1)AmplitaqDNA聚合酶(PEBiosystems,N808-0171)、1u1(1.1ug/u1)TaqStart抗体(Clontech，目录号5400-2，PaloAlto，CA)以及50ng人基因组DNA或3.8ulTe緩沖液(对于无把对照)。为了防止蒸发，各孔用15u1的清澈的Chill-out(MJResearch,目录号CH0-1411LasVegas,NV)覆盖，并用密封箔(foilseal)(BeckmanCoulter,目录号BK538619，Fullerton，CA)覆盖平板。文中指明了循环次数和每个循环的时间-温度特性曲线。每个PCR包括在95t:下进行15分钟的起始样品变性步骤和在下进行IO分钟的最终温育步骤。以三次重复在96孔平板中进行各反应。在包含30ug/mltRM(BoehringerMannheim,目录号BK538619，Indianapolis,IN)的Te緩冲液中连续稀释PCR产物，在第一步中稀释20倍，然后随后作5倍稀释，从而使产物浓度在INVADER测定法的动态范围之内。在96孔平板中，在15uL含有0.05wM侵入性寡核苷酸、0.5uM各第一探针、0.33uM各FRET盒、5.3ng/uL裂解酶XI、12mMMOPS(pH7.5)、15.3mMMgCl2、2.5%PEG8000、0.02%NP40、0.02%Tween20的溶液(用15ixl矿物油(Sigma)覆盖)中进行使用稀释的PCR产物的INVADER反应。所述PCR产物构成15ixL反应体系中的7.5uL。对于无靶对照，使用7.5uLTe緩沖液代替PCR产物。将反应体系在95匸下温育5分钟以使靶变性，然后在63t:下温育20分钟至3小时的时间。通过将平板冷却至室温来终止反应，用Cytofluor4000荧光平板读取器(PEBiosystems)来检测荧光信号，所述荧光平板读取器使用485/20nm激发和530/25nm发射滤光片(对于FAM染料)和560/20nm激发和620/40发射滤光片(对于RED染料)。使用三次重复的相应的INVADER测定法来分析每个PCR重复，因此对于每个PCR反应，收集9个数据点。为了确定PCR产物的浓度，使用相应的PCR产物的标准浓度获得用于INVADER测定1-6中每个测定的标准曲线。通过DNA样品G1、G2、G6或G8的PCR扩增来制备用于测定1-6的PCR标准。通过乙醇沉淀来浓缩扩增的产物，使用在8%聚丙烯酰胺非变性凝胶中的电泳来进行纯化，并使用PicogreendsDNA定量试剂盒(MolecularProbes,Eugene,0R，目录号P7589)来进行定量。在与分析的PCR产物相同的微量滴定板中，以二次重复用0至100fM的PCR标准进行用于标准曲线的INVADER反应。通过线性回归根据荧光信号来确定所分析的PCR产物的浓度，所述线性回归使用标准曲线的三个最接近PCR样品的荧光信号值的数据点。根据三次重复的INVADER测定测量结果来估量每个PCR重复的PCR产物浓度和方差(variance)。通过使用由三次重复INVADER测定法分析的方差进行加权的每个重复的平均值来估量三次重复PCR的PCR产物浓度。使用相同的标准曲线通过三次重复的INVADER测定来确定用于PCR的基因组DNA样品的起始浓度。将扩增系数F确定为估量的PCR产物浓度乘以稀释系数并除以用于PCR的基因组DNA浓度。在对于17个循环的PCR1-6所描述的条件下，用DNA样品G1-G8以单次重复进行192重PCR，各引物浓度为0.2pM，引物退火时间1.5分钟，引物延伸时间2.5分钟，以及在951C下进行2.5分钟的起始样品变性步骤。对于无把对照的192重PCR，使用Te緩冲液代替基因组DNA。在包含30yg/mltRNA(BoehringerMannheim,109525)的Te緩沖液中将192重PCR反应体系稀释30倍，并在加入至INVADER反应中之前在951C下加热5分钟。如对于测定1-6所描述的一样进行INVADER反应，除了侵入性探针为0.07uM，且各引物探针为0.7uM外。在15、30和60分钟或者如本文中对于基因組PCR样品和非靶PCR对照所指明的那样收集FAM和RED荧光信号。通过从192个INVADER测定的每个测定的样品信号中减去非靶信号来确定净荧光信号。将下列算法用于通过基因分型软件进行的分析。U)对于每个INVADER测定，通过将样品信号除以非靶对照信号来确定FAM(FOZF)和RED(FOZR)信号的零上倍数(fold-over-zero)。(2)对于每个INVADER测定，将比率值H确定为(F0ZF-1)/(F0ZR-1)。(3)如果0.25<H<4且FOZF和FOZR都>1.3，将样品定义为杂合的(HET);如果H>4且F0ZF>1.6，将样品定义为FAM纯合的；和如果H<0.25且F0ZR>1.6，将样品定义为RED纯合的。(4)在所有其他情况下样品被称为"不确定的(equivocal)"。为了调查影响PCR的参数，开发了使用定量INVADER测定法在反应的全程范围内确定靶扩增系数尸的方法。所述尸系数定义为扩增的产物的浓度和起始基因组DM的浓度的比率，两者都使用用已知量的PCR产物获得的标准曲线，用INVADER测定法进行测量，如"材料和方法"中所描述的。首先，将,作为PCR循环次数/的函数进行分析。使用DNAG2以0.lyM的引物浓度c进行单重PCR5,且在5、10、15、20、25、30和35的n后确定,(图2)。如图2所示，PCR5揭示了/gF对前25个循环的n的线性依赖性，斜率为0.296±0.0016，这证明靶扩增在7个数量级的范围内是指数性的。根据线性依赖性的斜率而确定的每PCR循环的平均扩增系数等于1.98±0.007,这表明在每次循环后靶的量几乎加倍。图2中的插图显示了，在相同的条件下(除了将更大量的DMG2用作靶)，对于PCR5的第1、2、3和5次循环，/g尸对/7的依赖性。该依赖性也可通过/gF对/2的斜率为0.283的线性函数而接近。在25个循环后，PCR5在,为2xl()8处达到平台期，该P值对应于根据0.28fM的起始基因组DNA浓度而确定的0.06uM的靶浓度。可通过以0.1nM的浓度用于PCR的引物的耗尽或通过PCR净皮其自身产物抑制来解释该平台期。类似于PCR5，PCR2的定量分析显示出，对于前25个循环，/g尸对/7的线性依赖性，斜率为0.295±0.004，平台在F为3xl08(数据未显示)处。这些结果将INVADER测定法确立为用于PCR靶扩增分析的定量方法，并且证明PCR在7个数量级的范围内是指数性地进行的或者说指数性地进行至少25个循环。为了研究作为调节F从而减少扩增偏倚性的手段的c对F的影响(Henegariu，0.等人，Biotechniques，23，504-11，1997)，^f吏用定量INVADER测定法来检查单重PCR1-6。每个PCR进行20个循环，c为0.01、0.025、0.04、0.05或0.luM。图3A中显示了对于PCR1、2、4和5，作为c的函数的F的对数。图3A显示了对于PCR1()、PCR2(O)、PCR4(■)和PCR5(□)，引物浓度c对^F的影响。在50mL体积(c为0.01、0.025、0.04、0.05或0.1mM，以及对于PCR1、4和5，50ng基因组DNAG2，或对于PCR2,50ng基因组DNAG6)中进行PCR扩增。每个PCR进行20个循环，每个循环使用在95n下进行30秒的模板变性步骤、在55"C下进行44秒的引物退火步骤和在72"C下进行60秒的引物延伸步骤。c为0.01mM的PCR1的lgF值太低以至不能获得可靠的测量。通过下列方法来估算标准误差以三次重复进行PCR，和也以三次重复使用相应的定量INVADER测定法来分析每个重复。PCR3和6的实施分别与PCR5和2相似，但为简洁起见未予显示。在相同的反应条件下进行的PCR之间F具有显著的差异。该差异在低c下最明显；然而在其中^尸接近理论最大值^广/V或6.O的较高的c下，其变得较不明显。如在前面部分中所显示的，PCR在20个循环时可被认为是指数性的反应，并且,可用于将在单一PCR循环中的靶扩增系数z确定为F+。如前面所述，可由模型来描述所观察到的c对F的影响，所述模型假定引物退火在较低的c时是PCR的限速步骤。在该模型中，引物户与把7"的结合由具有结合速率常数A的二级反应描述尸+r&〉尸r(i)如果假定引物对于靶过量，并且退火发生在低于引物解链的温度下，从而逆反应可被忽略，那么对于反应(1)的解(solution)是一"(2)其中/77是经引发的(primed)靶的浓度，几是在先前的PCR循环后的靶浓度，和t是引物退火温度。如果假定两个PCR引物都具有相同的A,且退火时间t长到足以完成每个经引发的靶分子的复制，那么z可被确定为r0+/p"。-"并且在/7次循环后,由下式给出<formula>formulaseeoriginaldocumentpage96</formula>(4)根据公式4，F^)应当是c的线性函数，斜率等于-f丄。使用/"(2-FO对c的坐标对于图3A中所示的数据的转化证明，每个PCR的预期的线性依赖性(图3B),为模型提供了强有力的支持。在图3B中，直线显示对于每个PCR的最小二乘拟合。因为高的标准误差，所以不使用PCR2和5在c为0.1raM处的数据点。—F")对c的斜率可用于确定引物退火步骤的表观结合速率常数g^，其主要由具有最低A的引物定义。使用44秒的^从图3B确定的PCR1、2、4和5的《^值分别是0.34x106、0.73xl06、0.45x106和1.2x106s-官1。这些值与在相似的緩沖液条件下对于短寡核苷酸获得的1.5x106s—V和2.6x106s—官!的A值接近。最慢(PCR1)和最快(PCR5)PCR的A之间存在至少3倍的差异，这表明引物退火动力学可明显地促成扩增偏倚性。PCR扩增的定量分析的结果提示了在多重PCR中用于平衡的靶扩增的两种方法(1)使用/g尸对c的依赖性调整每个单独反应的c，和(2)根据公式4，增加c和L以在固定的c下使所有靶达到最大扩增。根据图3A中所示的数据确定经调整的引物浓度其提供PCRl-6的各PCR的104的预期F值(表1)。表1.在经调整的引物浓度的条件下，多重PCR1、2、3、4、5和6的扩增系数的对数/g尺<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>使用50ng的基因组DNAG2或G6，以50yL的体积进行20个循环的多重PCR1、2、3、4、5和6，其中每个循环使用在95'C下进行30秒的变性步骤、在55。C下进行44秒的引物退火步骤和在72'C下进行60秒的引物延伸步骤。b根据图2确定PCR1、2、3、4、5和6中每个PCR的q,以提供4的预期c使用定量INVADER测定法的FAM信号和用基因组DNAG2和G6进行的6重PCR分别确定PCR1、3、4、5和PCR2、6的&尸的和/g尸。.肌。根据三次重复的PCR反应确定标准误差，每个PCR反应也以三次重复用相应的INVADER测定法进行分析，使用DNAG2或G6作为靶，在与图3中的条件相同的条件下，对于每个PCR，用经调整的浓度c的或0.025uM的固定c,.。"进行6重PCRl-6。如表1中所示，在C,条件下，所有6个靶被扩增大约104倍，平均/^"为4.15±0.17，最快(PCR3)和最慢(PCR1)之间的^的差异为2.75倍。在c。。"的条件下，多重PCR中扩增的总产物的量与使用c^的PCR(平均/g尸为3.89±0.91)相似，然而如在最快和最慢PCR(分别为3和1)之间的F的26.3倍的差异所说明的，存在显著的扩增偏倚性。还在6重形式的条件下，使用c一和c以单重形式进行PCR1-6，并且证明F值与表1中所示的相应的^值非常相似。该结果表明，在6重形式中单独的PCR之间没有显著的干扰。通过调整c来平衡PCR是使扩增偏倚性最小化的强有力的方法；然而其使用对于各PCR来说已知的尸对c的依赖性或引物浓度的重复优化。可选择的方法是使用固定的C值，但在使偏倚性降至最低的条件下进行PCR。实验数据(图3)和理论分析(公式3)都暗示，随着cL项的值增加z应当渐近地逼近2。因此，使用0.luM(在图3中显示的条件下使用的最大浓度)或0.2uM的固定的c以及90秒而不是44秒的引物退火步骤来进行多重PCR。使用DNAGl、G2、G6或G8作为靶，将6重PCR1-6进行17个循环以提供5.1的理论上最大的/^尸值。通过使用FAM和RED信号(关于基因组DNA的基因型，参见表S3)，采用INVADER测定1-6进行F的定量分析，/gF的值显示于表2中。表2.在固定的引物浓度的条件下，多重PCR1、2、3、4、5和6的扩增系数的对数/g尺<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>a使用50ng基因组DNAGl、G2、G6或G8，采用0.1或0.2uM的c,以50u1的体积进行17个循环的多重PCR1、2、3、4、5和6,其中每个循环使用在95X:下进行30秒的变性步骤、在551C下进行90秒的引物退火步骤和在721C下进行150秒的引物延伸步骤。根据三次重复的PCR反应确定标准误差，每个PCR反应也以三次重复用相应的INVADER测定法进行分析。bINVADER测定法的报告荧光染料。对于0.1和0.2uMPCR条件，使用FAM和RED信号获得的平均^尸值之间的差异在统计学上都是不显著的(t-检验p值分别为0.88和0.77)，这表明,的分析是不依赖于INVADER测定法类型的。PCR1-6在c为0.2yM时的平均/g尸值分别是4.55±0.10、5.03±0.11、4.96±0.11、UO士O.IO、5.42土0.18和5.15士0.11，或非常接近预期值5.1。不清楚为什么PCR5的5.42的^F值在统计学上高于预期值，尽管和其他测定相比，INVADER测定5对于所有基因组DNA才羊品均表现出相对较低的性能，所述其他测定可导致人为更高的PCR产物和基因组DNA浓度的比率以及过高估计的/#尸值。对于PCR1、2、4和6，在c为0.2和0.1uM时获得的平均/g尸值之间的差异分别为0.32、0.13、0.18和0.17。所述差异在统计学上是显著的，相应的t-检验/值为<0.0001、0.04、0.01和0.02。对于最快的PCR(3和5),0.2和0.1pM平均/^F值之间的差异分别为0.07和0.08，t-检验p值为0.37和0.47，呈现出无统计学上的显著性。该分析表明，ct项的增加提高了较慢的PCR的性能，但对在多重反应中的已明显接近扩增平台期的快速PCR的性能没有影响。本实施例的下一部分是用于和INVADER测定法一起进行SNP基因分型的192重PCR的开发，所述192重PCR基本上使由(Ohnishi等人，/〃咖Ce/2W，46，471-7，2001)获得的100的多重系数加倍。代表染色体5、11、14、15、16、17和19的192个SNP是随机选择的，并就各SNP设计INVADER测定。在选择过程中，对重复区域内的SNP不进行区别。因此，192个SNP中的一些可能在多个基因座上被扩增。因为简单性和短的开发时间的原因，所以以固定的引物浓度使用被发展用于平衡的扩增的PCR条件，通过使196重PCR进行17个循环(0.2uM的固定的c、1.5分钟的引物退火时间、2.5分钟的引物延伸时间)来扩增基因组DM样品G1-G8,然后用"材料和方法"中描述的192个双重INVADER测定法进行分析。通过从样品信号中减去无把对照信号获得RED和FAM净信号。根据净信号鉴定基因型的一个方法是将通用判读标准用于"材料和方法"中描述的每个测定法。这些标准假定纯合样品只具有来自等位基因之一的信号而没有或具有非常低的来自另一个等位基因的交叉反应性信号，而杂合样品产生对于两个等位基因来说大致相等的信号。该严格标准通常可在另外功能性INVADER测定中导致不确定的判读。作为选择，对于各INVADER测定，将所有8个DNA样品的FAM和RED净信号绘制成散布图，并通过视觉鉴定对应于纯合和杂合样品的集群(cluster)，从而来判读基因型。如果包含太少的样品则不能进行散布图分析；该分析还包含主观性的因素，因为该类型的视觉分析依赖于操作者的判断。在该工作中，确定8个样品足以对192个INVADER测定的大多数进行视觉判读。成功的和失败的散布图分析的实例显示于图4中。图4显示了8个基因组DNA样品的净FAM和REDINVADER测定信号的散布图。对于用196重PCR扩增的DNA样品Gl、G2、G3、G4、G5、G6、G7和G8，将INVADER测定法净FAM和RED信号作图。A-C为成功的基因分型，其中测定7、9和25将所有样品分配到鉴定为FAM纯合(O)、RED纯合(□)或杂合(x)的不同集群中。D-F为失败的基因分型。在测定6(D)中，最靠近坐标原点的样品不能被分配至任何集群中；在测定47(E)中，样品形成3个不同的集群，但对于任何样品都无FAM信号；在测定54(F)中，在具有高FAM信号交叉反应性的RED纯合子和具有偏斜的(skewed)RED/FAM比率的杂合子之间不能区分样品。RFU-相对荧光单位。将保守的标准用于视觉分析，如果样品中只是有一个样品不能分配至集群，则排除整组样品。同样，假定存在INVADER测定法的高交叉反应性，或最可能地，存在由PCR对多个同源基因座的扩增的高交叉反应性，则认为在两个通道上具有强信号的组没有给出准确的基因型.通过使用这些标准，192个测定中的161个或84%的测定得到判读。使用"材料和方法"中描述的基因分型软件获得的判读与这些判读的82.5%相一致。研究31个失败的INVADER测定以确定所述失败是否是由于低的PCR扩增系数、差的INVADER测定法性能或PCR对于高度同源序列的扩增而造成的。使用BLAST来分析PCR靶序列以确定任一个单独的PCR是否扩增超过一个基因座。31个测定中的8个测定明显是失败的，因为对于它们中的每一个，多个基因座可能被PCR扩增且所述基因座中的每一个可被INVADER测定法检测。其余的23个测定被认为失败是因为下列原因中的一个原因或其组合差的PCR扩增、寡核苷酸设计和的重复序列。通过排除由于基因组中的重复序列而失败的8个测定，将采用INVADER测定法进行基因分型的192重PCR的效率估算为161/184或87.5%。为了估量192重PCR中的扩增偏倚性，如图5中所示，对于在8个DM样品上进行的161个成功的INVADER测定，将每个等位基因的经标准化的RED净荧光信号对PCR靶长度进行作图。图5显示了对于161个成功的INVADER测定，每个等位基因的经标准化的净RED荧光信号，其作为PCR靶长度的函数。进行INVADER反应60分钟，其中8个DNA样品各用196重PCR进行扩增。线显示出作为PCR靶长度的函数的净信号的线性回归。在净信号中存在显著的可变性，包括PCR扩增和INVADER测定法性能中的可变性。对于FAM净信号获得类似的结果。净信号和靶长度之间的弱相关性表明，长于700bp的PCR靶具有低的允许成功基因分型的概率。令人惊奇地，尽管净信号中存在高可变性，但在信号分布的高和低末端都成功地进行了基因分型。为了研究观察到的INVADER测定法基因分型的坚实可靠性，在15、30和60分钟后测量相同的192个INVADER反应的净信号。因为INVADER测定中的信号扩增与时间成二次方关系(1)，因而30和60分钟时间点将分别等同于以高4倍和16倍的耙水平进行15分钟反应，从而模拟了PCR扩增的低、中和高水平。作为例子，在第15、30和60分钟时间点获得的INVADER测定110的散布图显示于图6中。图6显示了8个DNA样品的净FAM和RED信号的散布图。使用经196重PCR扩增的DNA来进行INVADER测定110，且在15分钟(A)、30分钟(B)和60分钟(C)后测量信号。通过散布图分析将样品鉴定为FAM纯合(O)、RED纯合(口)或杂合(x)。RFU-相对荧光单位。所述散布图证明，通过集群分析进行的INVADER基因分型不受强净信号的影响，并且甚至对于60分钟的反应也可进行解释，其中FAM和RED净信号都达到饱和。作为该效应的结果，使用更长的INVADER反应可进行更多的判读，因为对于慢速PCR可产生更多信号，从而提高了基因型的鉴定，但同时快速PCR的较高信号不影响样品的群集(clusering)。实施例8单个反应容器中的PCR扩增和INVADER测定法分析本实施例描述了在单个反应容器中使用PCR来扩增少量靶，然后进行INVADER测定法分析的方法。特别地，本实施例描述了进行这两个反应而无需在单一反应建立后进行操作或试剂添加。除非另外指出，用所指定的用于测定法的试剂进行下列实施例以检测DLEU基因(染色体13)和a-肌动蛋白基因(染色体l)中的序列10mMMOPS緩沖液，ph7.57.5mMMgChdNTPs，各25uM基因组DNA10ngPCR引物各200nM第一探针0.5uMINVADERoligos0.05uMFRET探针0.05uM裂解酶(VIII或X)100ngStoffel或天然TaqDNA聚合酶lu用于DLEU的PCR引物正向引物1716-14-1(SEQIDNO:1):5，-CCCGACATTTTTACGCATGCGCAAACTCCAACC-3，，Tm=73.8。C反向引物1716-14-2(SEQBDNO:2):5，-TACACGCACGCGCAAGAAGCAAGAGGACT-3，，Tm=74.1。C用于a-肌动蛋白的PCR引物正向引物1716-14-3(SEQIDNO:3):5,-CTGGGTTTCCAACAGGCGAAAAGGCCCT-3，，Tm=73,4。C反应引物1716-14-4(SEQIDNO:4):5，-GCGTGAGGGTGGAAGGAGATGCCCATGG-3，，Tm=74.70C探针，INVADERoligos，FRET盒(加下划线的碱基表示翼片序列；粗体的碱基表示在INVADER测定中的位置1)a-肌动蛋白探针1734-57ACGGACGCGGAGAGGAACCCTGTGACAT-W(SEQIDN0:5)a-肌动蛋白INVADERoligo1734-57CCATCCAGGGAAGAGTGGCCTGTTT(SEQIDNO:6)DLEU探针CGCGCCGAGGTTCTGCGCATrTTrTC4iey(SEQIDNO:7)DLEUINVADERoligoAGGGAGAGCCGTGCACCACGATGAC(SEQIDNO:8)DLEU濯FRET23-428F咖-TCT-Z28-AGCCGGTTTTCCGGCTGAGACCTCGGCGCG-liex(SEQIDNO:9)a-肌动蛋REDFRETRed-TCT-Z28-TCGGCCTTTTGGCCGAGAGACTCCGCGTCCGT-hex(SEQIDNO:10)A.组合式PCR-INVADER反应的设置在一些情况下，可能想要暂时地分开PCR和INVADER反应，例如通过在不利于INVADER反应的条件下进行PCR反应，然后改变反应条件以允许INVADER反应发生。产生差异反应条件的一个这样的方法是通过使用针对用于反应的酶的抗体，例如LightCyclerTaqBlock抗体(RocheAppliedSciences)。另一个这样的方法是通过温度。在本实施例中，设计PCR引物使退火温度》70X:，而用于INVADER测定的探针寡核苷酸经设计具有大约63t:的T，这样探针将不能在PCR循环的退火、延伸或变性期间与靶分子反应。此外，确定当TaqDNA聚合酶的Stoffel片段和天然TaqDM聚合酶都可通过长时间暴露于提高的温度(在该情况下，在99t:下进行10分钟)而失活时，一些裂解酶在这样的处理后仍保持活性。特别地，裂解酶VIII看上去对这样的加热具有高度稳定性，并用于随后的实验中。通过使用上述组分并用矿物油覆盖来进行反应，其中所有试剂合并在10u1的终体积中。使PCR进行11-20个循环(95C进行30秒；72X:进行30秒至2分钟)。在这些循环反应后，将混合物加热至99匸进行10分钟以使TaqDNA聚合酶失活。然后，在63C下温育反应混合物30分钟至3小时以使INVADER反应发生。B.评估INVADER测定法信号产生的抑制最初的结果表明，看上去存在限制INVADER测定法的信号产生的抑制。进行下列实验以评估各种反应组分对该抑制的可能贡献。装配部分反应体系以检查各种反应组分的作用。特别地，从起始反应体系设置中省去各种INVADER反应组分，然后将其在DNA聚合酶的热失活后加入反应体系中。在下列的表中，"+"表示起始反应体系设置中包含的组分，"-"表示为了允许INVADER反应发生，在TaqDNA聚合酶的热变性后加入的组分。123456789101112Mops100mMMgCl2證P1.25mMea引物1716-14-1/25yMea引物1716-14—3/45uMeaStoffel10u/y1gDNA03-422100ng/u1Dleu/a-肌动蛋白PPI-FRET5X(-DleuInv)InvaderDleu2.5uM裂解酶VIII100ng/u1体积10u1lu1lu10.2u10.4y10.4y10.1u1ly13u10.6uMlu1++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++一一一一++++++++++++一+—一+一一_++—一+一+-一+一(95X:30"-〉72'C30")20->98°C在PCR后，加入在5ul10mMMops7.5mMMgCl2中的缺少的组分(-)，并以95*C3'->63X:3小时运行益485/20530/2545560/20620/40147880115815196712508861536868551977123318102039512186070787087985750第2和5列(其中在PCR反应期间包含FRET混合物)中的结果与第1、3-4和6列(其中直至PCVR反应停止后才加入FRET探针)中的结果的比较表明，在INVADER测定中产生的信号因PPI-FRET混合物的存在而被抑制，随后的实验(见下)(其中在PCR反应期间不包含PPI-FRET混合物的每种组分)确认FRET探针是抑制性的。EE增！2IB増Mops100mMMgCl2dNTP1.25mMea引物1716-14-1/25nMea引物1716-14-3/45uMeaStoffel10u/u1gDM03-422100ng/u1Dleu探针15uMa-肌动蛋白探针15uMDleuinvader2.5yMa-肌动蛋白invader2.5nMDleuFRET23-4287.5yMa-肌动蛋白FRET23-7557.5uM体积10u1Ul++++++++llil++++++++0.2iU++++++++0.4ul++++++++0.4ul++++++++0.lul++++++++lyl++++++++0.5ul一+一一一一一+0.5ul一一+—一—一+0.5ul——_+———+0.5nl—_——+——+0.5ul一一一_一+一+0.5ul一一一一一一++(951C30"->72匸30")20->98t:5'在PCR后，加入在5u1lOmMMops7.5mMMgCl2中的缺少的组分(-)，并以95X:3'->63*C3小时运行益:益:485/20530/25560/20620/404550108178218001692172010094892363331330533243295022841706556本表中3个最右边的列的检查表明，对于其中任一种或两种FRET探针从反应起始时就存在("+")的反应，相对于其中不包括它的反应，INVADER测定法信号的产生减少。其中Taq聚合酶的量增加的额外的实验证明，StoffelDM聚合酶增加2倍导致在INVADER测定中信号产生增加。基于这些实验，确定增加在PCR反应期间的延伸时间以及优化TaqDNA聚合酶浓度减少了该抑制的影响。&&增￡lw增C.组合式PCR和INVADER测定法反应条件的优化进行实验以优化在组合式测定法中的各种反应组分的量和各步骤的时间。MgCL的浓度在1.7mM至7.5mM的范围内变化；dNTP的浓度经测试在25-75mM的范围内；引物的浓度在0.2uM至0.4uM的范围内变化。使用天然的Taq聚合酶获得的示例性数据显示在下面，并且表明FAM信号的产生依赖于DLEUINVADERoligo的存在，和表明在进行17个PCR循环，接着在99'C下进行IO分钟以使天然TaqDM聚合酶变性，然后在61°C下进行INVADER反应30分钟之后，两个INVADER反应都产生信号。Mops100mM1.5ii1MgCl225迈M1.5n1Dleu/a-肌动蛋白PPI-FRET5X(-DleuInv)3ulDleuinvader2.5线0.05pM终0.3iil裂解酶VIII100ng/u1lu1TaqPol(天然的)5u/u10.2u1引物1716-14-1/25nMea，0.4uM终1.2nl引物1716—14-3/45uMea,0.4uM终1.2u1dNTP1.25mMea,25tiM终0.3u1gDM03-42210ng/u11M-体积15u1(95C30"-〉72X:2')17-〉99X:10-〉61X:30'+++++++++++++++D.组合式PCR-INVADER测定法的剂量响应485/20110174411587530/2045560/2012326422700112620/4050Xm益k,m益ee増ee增进行实验以监控在采用一系列起始基因組DM靶浓度的组合式PCR-INVADER测定法中的信号产生。如下建立反应体系1234Mops100mM1.5p1MgCl275raM0.75u1Dleu/a-肌动蛋白PPI-FRET55C3ul裂解酶VIII100ng/u11u1TaqPol(天然的)5u/u10.1u1引物1716—14-1/25yMea，0.2uM终0,6M引物1716-14一3/45yMea，0.2uM终0.6u1dNTP1.25mMea，25uM终0.3u1g,5ng02948A体积15u1(95。C30"-〉72X:)12—>99T10'-〉60X:++++++++++++++2++++++++++++++++++++++++++++++++++510.750.50,30.160'使INVADER反应进行120分钟，且在60分钟或120分钟后读取结果。来自120分钟的结果显示于图7中。这些结果表明，在一系列DM浓度的范围内组合式PCR-INVADER反应是线性的，且灵敏度足以检测少至1.5ng的人基因組DNA。E.与biplexINVADER测定法检测相组合的多重PCR进行额外的实验以分析与INVADER测定法相组合的多重PCR反应。如下所述建立20重PCR反应体系。PCRCF混合物包含浓度为luM的下表中的每种引物。从下表中如下从Coriell获得基因组DNA样品。体积(u1)IOX体积MgCl2(50mM)2,2522.5裂解酶VIII100ng/n11.0010.0天然的Taqpol(5单位/ul)0.101.0dNTP混合物1.25mM0.303.0PCR引物混合物(1869-80)(每种lnM)3.0030.0gDNADM10ng"L1.0010.0H204.3543.5合计12.00120.00如下对Coriell样品进行编号(例如"C"n)Coriell#基因型1NA112771507delHET2NA11280711+1G>T/621+1G>THET3NA01531delF508■4NA04539delF508匪5NA07381delF508/3849+10kbHET6NA074413120+1G>A/621+1G>THET7NA07469delF508/R553X8NA11283A455E/delF508HET9NA11284R560T/delF508HET10NA11286delF508/G551DHET11NA11290A455E/621+1G>THET12NA07552delF508/R553X13NA08342delF508/G551DHET14NA112753659delC/delF508HET15NA12785G551D/R347PHET16NA11472G1349D/N1303KHET17NA11496G542X隱18NA11497G542XHET19NA11723W1282XHET20NA11761G551D/R553XHET21NA11282G85E/621+1G>THET22NA12960R334W/未知突变HET23NA13032I506V24NA13033F508C25NA13423G85E/D1152HHET26NA118592789+5G〉A匪27NA118603849+10kb醒28NA124441717-1G〉AHET29NA12585R1162XHET30NA13591delF508/R117HHET31NA08338G551D32NA11281621+lG>T/delF50834M12961V520F35NA11278Q493X/delF50836M11285Y1092X(OA)/delF50838NA00946AN139NA00130AN2。PCR引物选自下列。cftrexon3cftrexon斗cftrexon5cftrexon7cftrexon9cftrexon9-1cftrexon9-2cftrexon10cftrexon11cftrexon12cftrexon13cftrexon1犯cftrexon16cftrexon17Acftrexon17Bcftrexon18cftrexon19cftrexon19-1cftrexon19-2cftrexon20cftrexon21cftr3849+1Okbcftrexon17A-2tggtcccactmtattcttttgcagaaagtcaccaaagcagtacagccgctgtcmgccgtgttctagataaacggmggcagcctatgtgagacatgggccatgtgctmcaaaccatgggccatgtgcttttcaaaccttcttggtactcctgtcctgaaagaattatgggagaactggagccttca;3attacattagmggaagatgtgcctttcaaVaaggcaaatcatctacactagatgaccataactgagaccttacaccgtttctcaatgggaggaatagg丁gaaga丁g丁tagaatctgaatgcgtctactgtgatccacctgcacaatgtgcacatgtaccggactatggacacttcgtgccggagaaggaagagttggtattatcctgacgcatcaaactaattgtgaaattgtctgccgcatcaaactaattgtgaaattgtctgccgmggtggaaatgccatattagagaacagtacctatatgtcacagaagtgatcccagattagaaaaatgttcacaagggactccacagttgacttgtcatcttgatttctggacctcgacaatgtgcacatgtacc反向引物cftrexon3ACCTATTCACCAGATTTCGTAGTCTTTTCAcftrexon4TGTACCAGCTCACTACCTAATTTATGACAcftrexon5GAGCTGAGGAAGAGTTAAGCAGTAA丁丁AGcftrexon7G丁GMGATTGC丁AG丁ATTAGCTGGGAAGcftrexon9CTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAAcftrexon9-1cftrexon9-2cftrexon10cftrexon11cftrexon12cftrexon13cftrexon14Bcftrexon16cftrexon17Acftrexon17Bcftrexon18cftrexon19cftrexon19-1cftrexon19-2cftrexon20cftrexon21cftr3849+1OkbVs1lntstdFVs1lntstdRGAAATTACTGMGAAGAGGCTGTCATCACCTCCAAAAATACCTTCCAGCACTACAAAGACTAAOCGATTGAATATGGAGCCAAACTTAAATGTGATTCTTAACCCACTAGCCAGAGGTAAAATGCAATCTATGATGGGACATAAGGGAGTCTTTTGCACAATGGAAAAACCTCACCCMCTAATGGTCATCATAGACAGGACTTCAACCC丁CAATCAGAGTATCGCACATTCACTGTCATACCAAGGTAACAGCMTGAAGAAGATGACAAATAATGACAGATACACAGTGACCCTCAAGCTTCAGGCTACTGGGATTCACGTCATCTTTC丌CACGTGTGAATTC丁CAAGCTTCAGGCTACTGGGATTCACTTCTGGCTAAGTCCTTTTGCTCACCATTTCAGTTAGCAGCCTTACCTCATCCTCCCTGAGMTGTTGGATCAATGATGGTGGTATGTTTTCAGGCTAGAGTTCTCCCCTGTCCCAGTTTTMC如上所述进行PCR反应(在72t;下延伸2.5分钟，在95C下变性45秒)，进行14个循环。将混合物加热至991C进行IO分钟，然后冷却至63X:进行1小时。所述结果显示于图9A-B中。delF508样品是Coriell#3;G85E/621+1G〉T是Coriel121;1717-1G〉A，Coriell28;delF508/R117H是Coriell30;delF508/3849+10kb，Coriell5;A455E/delF508，Coriell8;以及R560T/delF508，Coriell9。这些结果表明可用多重PCR反应来运行组合的PCR加INVADER测定法。实施例9四重INVADER测定法4-染料系统增加分析通量的其他方法是增加可在单一反应或反应容器中进行和分析的INVADER反应的数目，本实施例描述了4重INVADER测定法的实施，在4重INVADER测定法中，在单一反应中包含了四组寡核苷酸。在该情况下，反应也包括4个不同的靶序列2个不同SNP的野生型和变体形式。还考虑了可选择的设置，包括4个不同的基因座、3个不同的基因座和一个内部对照等。在对用于多重FRET分析的INVADER测定法进行设置中的一个变量与FRET探针上包含的染料的选择相关。许多染料和猝灭剂的组合在本领域是已知的(参见例如，美国专利5,925,517、5,691,146和6,103,476，各在此引用作为参考)。在一些实施方案中，想要选择展现出对裂解酶的切割活性干扰最小的染料-猝灭剂组合。这样的染料-猝灭剂组合，当用于INVADER测定法时，可有利于更佳的转换率。影响染料的选择的另一个考虑与其光谗特征相关。在一些实施方案中，例如对于在荧光平板读取其中检测的测定法，优选的是，来自各染料的荧光信号相互之间在光谱上可通过仪器进行辨析。如果它们在光语上不具有充分的差异，那么来自一种染料的荧光输出可干扰或"渗透(bleedover)"入属于另一种染料的信号中。这种"串扰(crosstalk)"可导致测定法灵敏度降低或误差率增加。一些仪器具有足够的分辨在多通道中被检测的信号检测的能力(例如，通过使用光过滤和/或收集的信号的软件处理)，因此染料的各种组合的选择与用于检测多重化的反应的仪器相关。如下，来自荧光平板读取器扫描的给定染料的荧光输出与其浓度成比例荧光=aW染料]+b(1)其中a是随激发和发射波长以及平板读取器的增益设置而变化的常数，b是背景。如果存在多种染料，那么各染料如下对总荧光作出贡献荧光-ot參[染料a]+P+背景或荧光-背景"a"染料a](3)+Y,[染料。]+…n"染料J(2)P參[染料b]+Y，[染料c]+,..n"染料J当进行多个扫描时，可照此记录来自每个扫描的荧光荧光「背景产ot，[染料,]+p，[染料b〗+y,[染料J+...[染料n]荧光2-背景产OC2*[染料a〗+02攀[染料J+y2參,J十…[染料n]荧光3-背景3=OC3*[染料a]+P3*[染料b]+y3*,J+.[染料n]荧光n-背景n=OC[染料a]+P[染料b]+y,[染料。]+...[染料n]其中数字下标表示每个扫描的荧光读数、染料系数和背景组分。该系列的线性公式可以如下以矩阵形式书写广F2-b2F3-b3Fn-bn、_y0c3P3Y2n2Y3n3nn染料B染料C染料!NV」(3)或其中线性矩阵F的元素是减去背景的荧光读数，J是两维系数矩阵，d是其元素是从INVADER测定释放的每种游离染料的量的线性矩阵。可以确定,和]矩阵的元素，只要对于每个不同的扫描使用纯染料和空白进行某种校准。因此，通过使公式(4)的两边都乘以j的倒数可找到cT的解。如下推导出对于4重染料组的这样的矩阵.使用染料-T10寡核苷酸(即包含10个dT残基并且具有5'末端染料的oligos)来确定"游离染料"的发射特征。将不同比率的这些dT10oligos与包含相应的染料和合适的猝灭剂的FRET探针相组合，以模拟在一段时间内来自INVADER测定法的信号产生，500nM的工作母液分别由各dT10和各FRET探针组成。总样品体积为15ul，并且各样品用15ul矿物油覆盖。受试比率为0%dT10/100%FRET探针;25%dT10/75%FRET探针；50%dT10/50%FRET探针；75%dT10/25%FRET探针；和麵dT10/0%FRET探针。受试染料是荧光素(FAM)、Cal-Gold和Cal-Orange(BiosearchTechnologies,Inc.,Novato，CA)和REDMONDRED(SyntheticGenetics)。在适合于各染料的激发和发射波长处在TecanSafireXFLU0R4中对管进行读数。在每种情况下，从各染料观察到的荧光随着dT10oligo的比例增加而线性地增加，并且信号是累加性的。如下将线性回归的斜率输入系数矩阵。<table>tableseeoriginaldocumentpage115</column></row><table>如上所述通过采用各值的倒数以获得,来产生相应的矩阵，从而推导出d(每种情况下的游离染料的百分比).如下进行INVADER测定。如上所述，用裂解酶VIII和5pM(终浓度)合成的靶以15u1的终体积建立标准反应体系。在本实施例中使用4种不同的合成的靶SNP1和2的野生型和突变体。使用的FRET探针如下<table>tableseeoriginaldocumentpage116</column></row><table>在63t:下温育测定，在20分钟后在指定的波长上读取荧光。这些組合式反应的结果显示于图io中，其显示了靶分子的各种组合的检测。实施例10用用于粑检测的INVADER测定法试剂预加载的微观流体卡下列实施例描述了使用包含INVADER测定法试剂的微观流体卡来探询DNA样品的用途。在本实施例中，靶材料已通过PCR分别地进行制备。3M微观流体卡具有8个加载端口(loadingport)，其中每个端口被设置成用于通过对卡进行离心而给48个单独的反应室提供液体试剂。反应室包含预先分配的且干燥的用于检测一种或多种特定等位基因(例如，如在下面实施例11中所示的)的INVADER测定法反应組分。当这些试剂在通过对卡进行离心而与液体试剂接触到时，它们被溶解.使用下列组分(显示的浓度为它们在PCR反应体系中的终浓度)制备多重PCR反应混合物2ng/iiL基因组DNA、0.2nM多重PCR引物混合物、IXPCR緩沖液+MgCl2、0.2mMdNTPs和0.2U/rxn天然Taq聚合酶。最终的反应体积为20nL。将这些混合物在95C下加热2.5分钟，然后通过95X:30秒的步骤、551C1.5分钟的步骤和721C2.5分钟的步骤循环20次。最后，将样品在99t:下温育IO分钟以破坏聚合酶活性。PCR后，用dH20以1:25稀释扩增子，并将50uL该样品与50u1包含28mMMgCl2和4ng/u1裂解酶X的溶液混合。然后向前面实施例中描述的3MCF微观流体卡的8个单独端口中的一个之中加入该混合物。在63'C下进行INVADER测定法20分钟，并在微量板荧光计上检测来自所述测定法的荧光。结果显示于图1U-11G中。基因组样品DNA的基因型标示于各图板的上部，并且每个受试突变沿着X轴标示。实施例113MCF微观流体卡上的INVADER和PCR下列实施例描述了使用包含INVADER测定法试剂的微观流体卡来探询DNA样品的用途。在本实施例中，在单一反应中扩增和检测靶材料。如上所述，在3M微观流体卡上进行反应。微观流体卡的反应室包含干燥至卡上的用于进行48个不同INVADER测定的INVADER测定法反应组分(即，INVADER寡核苷酸、第一探针和FRET盒)。为了制备这样的卡，将2ylIXPPIFF-MOPS混合物(0.25uM各第一探针寡核苷酸、0.125uM各FRET寡核苷酸、0.025uMINVADER寡核苷酸，于10mMMOPS緩冲液中)分配入微观流体卡的小孔中。然后让卡在风箱中进行干燥，其中将经HEPA过滤的空气强迫通过所述风箱。通常不需要控制空气的温度或相对湿度。在装配好的微观流体卡中的各反应室的体积为大约1.7uL，因此在反应期间这些组分的终浓度为IXPPIFF-MOPS混合物的浓度的大约1.18倍.由这些INVADER测定法寡核苷酸组检测到的等位基因变体如下<table>tableseeoriginaldocumentpage118</column></row><table>制备包含对于扩增INVADER测定法的靶的多重PCR来说所必需的所有材料和对于INVADER测定法来说所需的裂解酶VIII的母混合物，并将其分成8个液池(pool)。向这8个液池中的7个之中加入独特的基因组DNA样品，其余的样品用作不含模板的对照。向卡上的每个加载端口加入100uL这8个混合物中的每一个，并通过离心而加载入卡中的小孔之中。这些混合物中的组分的终浓度如下7.5mMMgCl2、6.67ng/uL裂解酶VIII、.033U/wL天然Taq-pol、25uMdNTP混合物、0.2uM多重PCR引物。如下温育组合式PCR和INVADER测定法反应体系15秒，72*C2分15秒，进行15个循环，然后是进行10分钟的单一的99X:步骤以破坏天然Taq-pol活性，然后在601C下进行1小时以用于INVADER测定法反应.在荧光微量板读取器上检测来自INVADER测定法的荧光信号，结果呈现在图12A-12G中(无把对照样品被省略)。每个基因组样品DM的基因型标示于各图板的上方，并且每个受试突变沿着X轴标示。实施例12未纯化的全血样品中的直接检测本实施例描述了，达到了直接检测在未纯化的全血样品中的靼序列。特别地，本实施例，类似于上面的实施例，描述了用于检测基因组DM的在单个反应容器中的PCR扩增和INVADER测定法检测的组合。然而，本实施例还通过将单个反应容器的、组合的PCR-INVADER分析的方法运用于未纯化的全血样品而进一步扩展了上述实施例。如下制备总体积20jj1的PCR/INVADER测定法反应混合物。对于緩沖液，使用大约4y1来自Shimadzu(无5XAmpAddition-1)的0.5XAMPDIRECT-A或10raMTAPS生物緩沖液(3-[[三(羟甲基)甲基]氨基]丙磺酸)(PH大约为9)。注意到，意外地发现TAPSpH9而非仅仅AMPDIRECT-A,可用作在全血中的直接PCR和INVADER检测的緩冲液。此外，可在例如美国专利公开号20020102660和20020142402，以及Nishimura等人，Clin.Ub.，2002,48:377-84，和Nishimura等人，Ann.CIinBiochem,2000，37:674-80(就所有目的，所有这些文献在此引用作为参考)中找到关于在全血中的AMPDIRECT-A緩沖液和PCR的其他细节。^使用下列其他的试剂6.25yMdNTPs(各dNTP)、0.2uM各PCR引物、0.3个单位的Taq聚合酶(天然的)、40ng裂解酶VIII、3mMMgCl2(除了AMPDIRECT緩沖液中的任何MgCh外，如果使用该緩沖液)、0.5uM用于待检测的每个靶(例如，被靶向的基因组DM和内部对照)的第一探针、0.05uM用于待检测的每个等位基因的INVADER寡核苷酸(与多个第一探针一起使用，如果要检测SNP)或0.05pM用于待检测的每个乾的INVADER寡核苷酸(例如，当相对于内部对照乾来定量可变的靶时使用)、0.25yM各FRET探针(用于靶和对照反应)和用于加至20pL总反应体积的蒸馏水。首先用抗凝剂例如柠檬酸钠、EDTA二钾或肝素钠(sodiumheparinate)处理待测试的液体人全血样品。通过将其加栽至反应管的底部而不混合来向PCR/INVADER反应混合物中加入大约0.4u1(或更少)的该经处理的人全血。如果需要可用矿物油覆盖。然后，对样品进行PCR，总共进行28个循环。可使用例如下列适合于人全血的温度特性进行PCR:在80'C下预热15分钟，然后在下进行4.5分钟，然后进行28个循环(在94r下进行30秒，在退火温度下进行1分钟，在72。C下进行1分钟)和在72'C下进行7分钟。在这些循环反应后，将混合物加热至99t:进行10分钟以使TaqDNA聚合酶失活。然后在63X:下温育反应混合物大约30分钟至大约3小时以使INVADER测定反应发生。收集来自INVADER测定法的结果(参见例如，上述实施例)。本实施例的结果显示了全血中基因组DNA中的靶序列的成功的PCR扩增，以及目的靶序列的成功的INVADER测定法检测。无论AMPDIRECT还是TAPSPh9用作緩冲液，都可能在从该全血中检测目的靶核酸中获得成功。也可使用血滤纸片(blood-spotcards)(例如来自WHATMAN的血滤纸片)进行采用组合式PCR和INVDADER测定法的直接DNA检测。与上述内容相似，可如下制备PCR-INVADER反应緩沖液10mMTAPSpH9緩冲液、3mMMgCl2、0.2wM各PCR引物、6.25uM各dNTP、0.5uM用于待检测的每个靶(例如，被靶向的基因组DNA和内部对照)的第一探针、0.05iiM用于待检测的每个等位基因的INVADER寡核苷酸(与多个第一探针一起使用，如果要检测SNP)或0.05uM用于待检测的每个把的INVADER寡核苷酸(例如，当相对于内部对照靶来定量可变的靶时使用)、0.25uM各FRET探针(用于靶和对照反应)、0.06u1TaqPol(天然的，5u/u1)、0.2u1裂解酶VIII(200ng/u1)和用于加至20uL终体积的蒸馏水。从沾有血液的WHATMANFTAGene卡上取下一个1毫米的包含血液的穿孔片(punch)，从卡上没有任何血液的位置处取下一个相同直径的对照穿孔片。然后在lml水中洗涤纸穿孔片大约IO分钟，偶尔摇动或搅拌。如上所述进行PCR和INVADER测定法。该过程的结果显示了从全血内的基因组中靶序列的成功的PCR扩增，以及目的靶序列的成功的INVADER测定法检测。实施例13包括在单个反应管中的反转录、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应的单步骤反应下面，通过在单个管中以单一反应施行下述步骤而不插入纯化或添加步骤而提供了目的核酸(例如，MA)的检测(例如，用于检测目的基因的表达水平或用于确定病原体核酸的存在)经反转录(RT)合成cDNA、经PCR进行扩增和经INVADER测定法进行检测。在单个管中进行RT、PCR和INVADER测定的初步尝试遇到了困难。为了确实单步反应工作所处的条件，测试了多个反应条件(参见，例如，表3)。改变緩冲液中KC1盐、裂解酶和MgCh盐的终浓度但保持RNA模板和其他反应组分的量恒定。保持恒定的反应组分是lOmMMOPS緩冲液、25yMdNTPs、0.5nM探针寡核苷酸、0.05uMINVADER寡核苷酸、0.25uMFRET寡核苷酸、0.4yMRT/PCR引物寡核苷酸、0.5个单位/rxnAMVRT酶和0.5个单位/rxnTaqDNA聚合酶。此外，将温度循环反应条件保持恒定在481C45分钟；5分钟；两步骤的20个重复循环(951C45秒，72X:2分钟)；10分钟；和63r90分钟。如可从下面看到的(参见，例如，表3)，看起来最好的反应条件为0mMKC1、100ng裂解酶和7.5mMMgCl2。此外，通过保持所有反应条件恒定而只替换RT酶，确定了，来源于AMV的逆转录酶提供比来源于AMV的逆转录酶(其产生较高的背景信号)稍微更加有效和灵敏的反应条件.因此，在大量尝试后，通过采用几个经确定对于反应有效地进4亍工作来说很重要的反应条件，单步反应提供了可检测的信号(参见，例如，表3)。特别地，緩沖液的组成和RT酶的身份经确定在单步反应的效率和灵敏度中起着作用(尽管如果想要或需要较低的效率或灵敏度可使用可选择的条件)。表3.单步反应条件的优化。<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>当在单个管中进行RT、PCR和INVADER测定法的尝试获得成功时，使用纯化的病毒RNA作为靶核酸进行进一步的优化。将靶RNA与下列测定法组分混合并在15uL的终反应体积中进行测定，所述终反应体积包含75个单位/rxnMMLV逆转录酶、0.5个单位/rxnTaqDNA聚合酶、100ng/rxn裂解酶Vin、7.5mMMgCl2、10mMMOPS緩沖液、0.667uM探针寡核苷酸、0.067uMINVADER寡核苷酸、luM正向引物、luM反向引物、0.333uMFRET探针和25uMdNTPs。在下列条件下进行所述测定42*Cl小时、951C5分钟；三步骤的28个重复循环(95匸30秒，601C30秒，72t:2分钟)；10分钟；和63匸1小时。包括没有加入靶RNA的单步反应用作对照(参见，例如，表4，NTC)。显示了耙RM的检测(参见，例如，表4，F0Z-零上倍数)。因此，本发明的单步反应提供了用于检测样品中的靶DNA的有效且灵敏的(例如，少至1个拷贝的病毒RM提供了〉3的F0Z信号，表2)<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>方法，所述单步反应包括在单个管中进行的反转录、PCR和通过INVADER测定法的检测而不插入纯化或添加步骤。表4.单个管中的RT/PCR/INVADER乾病毒RNA拷贝数/rxn平均值净值FOZ5010271048107610508334.831710651116111310988805.04610591089104910668484.901.99299176418296113.810.67148986937685513.530.2212213754213-50.980.1230252211231131.06NTCtRNA222221210218实施例14多用途寡核苷酸将多用途寡核苷酸设置成用作用于反转录期间cDNA合成的引物、用作PCR扩增期间的3'("反向")引物和用作在INVADER测定法的侵入性切割反应中使用的INVADER寡核苷酸。如实施例13中所描述的，可在单个管中进行RT、PCR和通过INVADER测定法的检测的步骤。纯化的病毒RNA用作靶核酸。将靶RNA与下列测定法组分混合并在15laL的终反应体积中进行测定，所述终反应体积包含75个单位/rxn醒LV逆转录酶、0.5个单位/rxnTaqDM聚合酶、100ng/rxn裂解酶VIII、7.5mMMgCl2、10mMMOPS緩沖液、0.667yM探针寡核苷酸、lnM正向引物、luM反向引物/INVADER寡核苷酸、0.333uMFRET探针和25uMdNTPs。在下列条件下进行所述测定42°C1小时、95"C5分钟；三步骤的28个重复循环(95n30秒，60X:30秒，72X:2分钟)；99"CIO分钟；和63匸1小时.作为对照，使用没有靶RNA的样品(参见，例如，表5，NTC)。为了进行比较，在单个管中在包含用于RT、PCR和INVADER的传统组分的反应体系中测试相同的靶RNA。该测定以相同的量包含所有上述组分和以1uM的终浓度包含额外的寡核苷酸，所述额外的寡核苷酸位于在反应中所涉及的INVADER寡核苷酸杂交位点的下游。在该情况下，INVADER寡核苷酸以0.067wM的终浓度存在于反应体系中。同样，在该情况下，INVADER寡核苷酸在其3'末端包含错配，该错配抑制其在RT或PCR期间的延伸。平行地进行两次测定(参见，例如，表5和6)。因此，使用单个寡核苷酸作为用于RT的反向引物、作为PCR的引物和作为形成切割结构的寡核苷酸(例如，侵入性切割反应中的探针或INVADERoligo),提供了比对于各反应使用多个寡核苷酸的传统方法更加有效和灵敏的选择。表5.多用途RT/3'PCR/INVADER寡核苷酸HIV病毒RNA拷贝数/rxn平均值净值FOZ5010251050100310268576.0617"301091109011049346.52610491122109710899206.431.91073"16109210949246.460.6162107511477956254.690.2170702817017011.000.116518117217331.02NTCtRNA174162172169表6.传统的RT/PCR/INVADERHIV病毒RNA拷贝数/rxn平均值净值FOZ5010271048107610508334.83171065"1611131098咖5.04610591089104910668484.901.99299176418296113.810.67148986937685513.530.2212213754213-50.980.1230252211231131.06NTCtRNA222221210218上面说明书中提到的所有出版物和专利在此引用作为参考，就好象此处特意指出的那样。所描述的本发明的方法和系统的各种修饰和变化对于本领域技术人员来说是明显的，而不背离本发明的范围和精神。虽然用特殊的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，所要求保护的本发明不应当过度地限定于这些特殊的实施方案。事实上，希望将对于相关领域内技术人员来说显而易见的所描述的本发明实施方式的各种修饰包括在下列权利要求的范围之内。权利要求1.用于检测样品中的靶核酸的方法，其包括在所述靶核酸，如果存在，在单步反应中被检测到的条件下，将所述样品暴露于检测测定法试剂，其中所述单步反应包括反转录反应、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应。2.权利要求l的方法，其中所述样品是未純化的体液。3.权利要求1的方法，其中所述聚合酶链式反应具有低于20个的扩增循环。4.权利要求l的方法，其中所述聚合酶链式反应具有低于15个的扩增循环。5.权利要求1的方法，其中所述聚合酶链式反应具有低于12个的扩增循环。6.权利要求1的方法，其被设置成用作反转录引物割结构的寡核苷酸。7.权利要求1的方法，8.权利要求1的方法，9.权利要求1的方法，10.权利要求2的方法11.权利要求1的方法12.权利要求1的方法，核酸酶和緩冲液。13.权利要求12的方法，其中所述緩沖液的氯化钾浓度为OmM。14.用于检测样品中的靼核酸的试剂盒，其包含逆转录酶、聚合酶、5，核酸酶、被设置成用于在所述靶核酸存在的情况下形成侵入其中所述单步反应包含多用途寡核苷酸，,用作聚合酶链式反应引物和用作形成切其中所述靶核酸是哺乳动物基因组DNA。其中所述靶核酸来自病原体。其中所述靶核酸来自植物。其中所述液体包括血液。其中所述靶核酸通过荧光来检测。其中所述试剂包括逆转录酶、聚合酶、5，和可检测的扩增的緩沖液。15.权利要求14的试剂盒，其中所述5，核酸酶包括FEN-1内切核酸酶。16.权利要求14的试剂盒，其中所述緩冲液的氯化钾浓度是OmM。17.权利要求14的试剂盒，其还包含扩增引物。18.权利要求14的试剂盒，其还包含多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。19.用于检测样品中的靶核酸的试剂盒，其包含多用途寡核苷酸，其被设置成在靶核酸和用于进行反转录、聚合酶链式反应和侵入性切割反应的试剂存在的情况下用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。20.用于耙核酸的多重检测的方法，其包括a)在微观流体卡中提供反转录、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法试剂，其中所述试剂被设置成用于反转录、扩增和检测所述靶核酸；b)使用离心力将怀疑含有所述靶核酸的样品暴露于所述试剂；和c)检测所述靶核酸的存在或不存在。21.权利要求20的方法，其中所述暴露包括进行20个或更少循环的聚合酶链式反应。22.权利要求20的方法，其中所述试剂包括逆转录酶、聚合酶和5'核酸酶。23.权利要求22的方法，其中所述5，核酸酶包括FEN-1内切核24.包含酶组合物的试剂盒，其中所述酶组合物包含一种或多种具有逆转录酶活性和FEN-1内切核酸酶活性的酶。25.权利要求24的方法，其中所述试剂盒包含逆转录酶。26.权利要求24的方法，其中所述试剂盒包含FEN-1内切核酸酶。27.权利要求24的方法，其中所述试剂盒还包含聚合酶，28，用于定量样品中的靶核酸序列的方法，其包括在所述靶核酸在单步反应中被定量的条件下，将所述样品暴露于检测测定法试剂，其中所述单步反应包括反转录反应、聚合酶链式反应和侵入性切割测定法反应。29.权利要求28的方法，其中所述定量确定相对于所述样品中细胞核酸序列的量来说所述乾核酸序列的量。30.权利要求28的方法，其中所述测定法试剂包括多用途寡核苷酸，其被设置成用作反转录引物、用作聚合酶链式反应引物和用作形成切割结构的寡核苷酸。全文摘要本发明提供了用于开发和优化核酸检测测定法的方法和程序，所述核酸检测测定法用于基础研究、临床研究以及用于开发临床检测测定法。特别地，本发明提供了用于设计在多重扩增反应中使用的寡核苷酸引物的方法。本发明还提供了优化多重扩增反应的方法。本发明还提供了用于组合式靶和信号产生测定法的方法。文档编号C07H21/02GK101341258SQ200580045803公开日2009年1月7日申请日期2005年11月3日优先权日2004年11月3日发明者H·T·阿拉威,S·M·劳,V·A·叶拉金,V·利亚米切夫申请人:第三次浪潮技术公司