专利名称：西米特酸的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种化合物提取方法，尤其是指一种从中国南海海绵Rhabdastrella globostellata中提取西米特酸(异臭椿酸化合物)的方法。
背景技术：
海绵是最原始的多细胞动物之一，种类繁多，分布极广，以海产为主。我国南海地处热带和亚热带，海洋生物物种极为丰富，特别是海绵，约占世界总数的一半。近年来人们已从海绵生物中发现了许多结构独特的有机化合物如萜类、甾体、苷类、生物碱、多肽和聚醚类等，其中许多具有抗肿瘤、抗心血管病、抗菌和抗病毒等生理活性，不少化合物具有潜在的临床应用价值。特别是以这些化合物为先导物，经过化学结构的修饰，获得生理活性更强、毒性更低的有机药物，引起世界各国越来越多的关注。
本发明所涉及的异臭椿酸化合物，结构上属于一种三萜酸，因此也称异臭椿酸三萜，是海绵中一类具有重要生理活性的三萜类天然产物，我们称之为西米特酸。它是一类具有重要生理活性的天然产物。中科院上海药物研究所的初步筛选发现，西米特酸对B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖显示出100％的抑制作用(0.1μM浓度下)；动物体内抑瘤试验表明，西米特酸对艾氏腹水癌实体瘤、S180肉瘤、A-549人肺腺癌、人肺巨细胞(PG)癌和人LOVO结肠癌等 异臭椿酸三萜(西米特酸)多种肿瘤模型有较高的抑制增殖活性，且安全系数较大。在华南肿瘤学国家重点实验室进行的抗癌作用机理研究表明，西米特酸能通过激活Caspase-3酶诱导HL-60肿瘤细胞的凋亡；基因芯片检测试验显示，西米特酸能增高或降低一些凋亡基因的表达；抑制PI3K/AKT信号转导途径可能是其抗肿瘤的作用机制。
海绵Rhabdastrella globostellata资源在南海数量可观，采集方便(水深2～3米)，海绵中的西米特酸含量较丰富(约占干重的0.02％)。但原有的提取工艺(见专利申请号“95116029.X”)，该专利公开了如下提取工艺晒干海绵破碎后用乙醇抽提，将抽提物浓缩至浆状，然后将其分散于适量水中，再以石油醚，乙酸乙酯和正丁醇依次进行萃取分离，将所得乙酸乙酯部分经5次硅胶柱层析和2次葡聚糖凝胶柱层析，分别以石油醚-乙酸乙酯和氯仿-甲醇作淋洗剂，将洗出液减压浓缩后得到金黄色固体，再将该固体溶解于适量苯中，得到圆片状晶体，即西米特酸。其产率为0.0022％。该方法的缺点在于比较繁琐，耗时长、成本高，需要多次、反复使用不易操作的硅胶柱层析，多次变换淋洗剂，且需用到价格较贵的葡聚糖凝胶LH-20作柱层析分离，不仅周期长、成本高，而且产率低，无法适应较大规模的制备，1克样品的生产通常耗时2～3个月，有时甚至达半年。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种西米特酸(异臭椿酸化合物)的提取方法。该方法充分利用了该类化合物的理化性质，以工业乙醇为初步提取剂，并连续以乙酸乙酯、氯仿作萃取剂，再通过石油醚除杂、柱层析和重结晶等步骤获得纯品异臭椿酸化合物。本发明提取方法具有生产周期短、成本低和产率高，适应规模制备的要求等优点。
本发明的目的通过下述技术方案实现一种西米特酸(异臭椿酸化合物)的提取方法，包括如下工艺步骤(1)海绵(Rhabdastrella sp.)用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液。
(2)乙醇提取液经浓缩得到海绵浸膏，将海绵浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，浓缩，得到乙酸乙酯浓缩物。
(3)将乙酸乙酯浓缩物分散于体积浓度为80～95％的甲醇水溶液中，用石油醚萃取除杂后，剩余液用水稀释至40～70％(指甲醇的体积浓度)，再用氯仿萃取，合并、浓缩，得氯仿萃取物。
(4)氯仿萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶剂系统梯度淋洗，直至米黄色的西米特酸组分完全洗脱。
(5)合并所有西米特酸组分，浓缩，得到西米特酸粗品。
为了更好地实现本发明，将西米特酸粗品用柱层析除杂，得到金黄色粉末；然后重结晶，得到桔红色的西米特酸纯品。
所述乙醇为体积浓度95％的工业乙醇。所述海绵用乙醇浸泡3～5周，抽提3次。所述水为蒸馏水。步骤(4)中米黄色的西米特酸组分完全洗脱，可用色层法或TLC(薄层色谱)法进行监控。所述浓缩为减压浓缩。
所述柱层析采用体积比8∶2的石油醚-丙酮柱层析或体积比9∶1的氯仿-丙酮柱层析。所述重结晶采用氯仿-石油醚重结晶，氯仿∶石油醚的体积比为6∶4。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明的产率由原工艺的0.0024％提高到现在的0.03％，增加约12倍；生产周期由原先的2～3个月缩短至1～2个月；操作简化，易于掌握；成本降低，本发明充分利用产品的理化性质，运用不同极性的溶剂，多次、分级萃取，取代原工艺的多次硅胶柱层析和凝胶柱层析，节省了大量硅胶和凝胶的消耗。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1将2.0公斤(干重量)南海海绵Rhabdastrella globostellata破碎后用95％的工业乙醇室温浸泡1周，滤干后残渣再浸泡2次，每次1周，共抽提3次，得到乙醇提取液。将乙醇提取液合并后减压浓缩至黑色浆状物(海绵浸膏)。将该浆状物均匀分散在500ml蒸馏水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合并萃取液并减压浓缩，得乙酸乙酯浓缩物64克。将乙酸乙酯浓缩物均匀分散在300毫升93％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除杂。剩余液水层再用蒸馏水稀释至70％(指甲醇的体积浓度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合并萃取液，浓缩得氯仿萃取物20克。该萃取物经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶剂系统梯度淋洗，依次除去绿色、黑色的低极性组分，至出现米黄色的西米特酸组分，用颜色界面监控(即色层法)，直至西米特酸组分完全洗脱下来。合并所有米黄色的西米特酸色谱层，减压浓缩，得西米特酸粗品10克。将该粗品用体积比8∶2的石油醚-丙酮柱层析进一步除杂，得金黄色粉末2克。最后用氯仿-石油醚(体积比6∶4)重结晶，得桔红色的西米特酸纯品0.35克。产率0.0175％。
产品化学结构的确认红外数据vmax(cm-1)3427，2939，1711，1691，1579，1542，1422，1391，1289，1184，1160，974，803；核磁数据δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
实施例2将2.0公斤(干重量)南海海绵Rhabdastrella globostellata破碎后用95％的工业乙醇室温浸泡2周，滤干后残渣再浸泡2次，每次1.5周，共抽提3次，得到乙醇提取液。将乙醇提取液合并后减压浓缩至海绵浸膏(浆状物)，将该海绵浸膏均匀分散在500ml蒸馏水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合并萃取液并减压浓缩，得乙酸乙酯浓缩物80克。将乙酸乙酯浓缩物均匀分散在300毫升80％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除杂，剩余液水层再用蒸馏水稀释至40％(指甲醇的体积浓度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合并萃取液，浓缩得氯仿萃取物35克。该萃取物经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶剂系统梯度淋洗，依次除去绿色、黑色的低极性组分，至出现米黄色的西米特酸组分，用TLC法进行监控，直至西米特酸组分完全洗脱下来。合并所有TLC斑点与西米特酸标准样品接近的组分，减压浓缩，得西米特酸粗品20克。将该粗品用体积比9∶1的氯仿-丙酮柱层析进一步除杂，得金黄色粉末4克。最后用氯仿-石油醚(体积比6∶4)重结晶，得西米特酸纯品0.6克，产率0.03％。
产品化学结构的确认红外数据vmax(cm-1)3427，2939，1710，1691，1579，1541，1422，1391，1289，1183，1160，974，803；核磁数据δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
实施例3将2.0公斤(干重量)南海海绵Rhabdastrella globostellata破碎后用95％的工业乙醇室温浸泡2周，滤干后残渣再浸泡2次，每次1周，共抽提3次，得到乙醇提取液。将乙醇提取液合并后减压浓缩至黑色浆状物(海绵浸膏)。将该浆状物均匀分散在500ml蒸馏水中，以乙酸乙酯(500ml)萃取3次，合并萃取液并减压浓缩，得乙酸乙酯浓缩物78克。将乙酸乙酯浓缩物均匀分散在300毫升87％的甲醇水溶液中，用石油醚(300ml)萃取3次除杂。剩余液水层再用蒸馏水稀释至55％(指甲醇的体积浓度)，用氯仿(500ml)萃取3次，合并萃取液，浓缩得氯仿萃取物33克。该萃取物经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(体积比9∶1→8∶2→7∶3→5∶5)溶剂系统梯度淋洗，依次除去绿色、黑色的低极性组分，至出现米黄色的西米特酸组分，用颜色界面监控(即色层法)，直至西米特酸组分完全洗脱下来。合并所有米黄色的西米特酸色谱层，减压浓缩，得西米特酸粗品18克。将该粗品用体积比8∶2的石油醚-丙酮柱层析进一步除杂，得金黄色粉末3.5克。最后用氯仿-石油醚(体积比6∶4)重结晶，得桔红色的西米特酸纯品0.55克。产率0.0275％。
产品化学结构的确认红外数据vmax(cm-1)3428，2940，1711，1692，1579，1542，1422，1391，1289，1186，1160，973，803；核磁数据δ1H(CDCl3)7.42(1H，d)，7.06(1H，dd)，6.76(1H，d)，6.676(1H)，6.659(1H)，6.44(1H，d)，2.76(1H，m)，2.44(1H，m)，2.37(3H，s)，2.25(2H，dd)，2.21(2H，m)，2.07(3H，s)，2.05(3H，s)，1.90(1H，dd)，1.64(1H，m)，1.54(2H，m)，1.46(3H，s)，1.15(3H，s)，1.08(3H，s)，0.88(3H，s)。
权利要求
1.一种西米特酸的提取方法，包括如下工艺步骤(1)海绵用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液；(2)乙醇提取液经浓缩得到海绵浸膏，将海绵浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，浓缩，得到乙酸乙酯浓缩物；(3)将乙酸乙酯浓缩物分散于体积浓度为80～95％的甲醇水溶液中，用石油醚萃取除杂后，剩余液用水稀释至40～70％，再用氯仿萃取，合并、浓缩，得氯仿萃取物；(4)氯仿萃取物经硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯溶剂系统梯度淋洗，直至米黄色的西米特酸组分完全洗脱；(5)合并所有西米特酸组分，浓缩，得到西米特酸粗品。
2.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述西米特酸粗品用柱层析除杂，得到金黄色粉末；然后重结晶，得到桔红色的西米特酸纯品。
3.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述乙醇为体积浓度95％的工业乙醇。
4.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述海绵用乙醇浸泡3～5周，抽提3次。
5.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述水为蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于步骤(4)中米黄色的西米特酸组分完全洗脱，用色层法或薄层色谱法进行监控。
7.根据权利要求1所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述浓缩为减压浓缩。
8.根据权利要求2所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述柱层析采用体积比8∶2的石油醚-丙酮柱层析或体积比9∶1的氯仿-丙酮柱层析。
9.根据权利要求2所述的西米特酸的提取方法，其特征在于所述重结晶采用氯仿-石油醚重结晶，氯仿∶石油醚的体积比为6∶4。
全文摘要
本发明公开了一种西米特酸的提取方法。该提取方法如下海绵用乙醇浸泡抽提得到乙醇提取液；经浓缩得到海绵浸膏，将海绵浸膏分散于水中，用乙酸乙酯萃取，合并萃取液，浓缩，得到乙酸乙酯浓缩物；将乙酸乙酯浓缩物分散于甲醇水溶液中，用石油醚萃取除杂后，剩余液用水稀释，再用氯仿萃取，合并、浓缩，得氯仿萃取物；氯仿萃取物经硅胶柱层析，用石油醚－乙酸乙酯溶剂系统梯度淋洗，直至米黄色的西米特酸组分完全洗脱；合并所有西米特酸组分，浓缩，得到西米特酸粗品。本发明具有生产周期短、成本低和产率高等特点。
文档编号C07C59/82GK1861558SQ20061003589
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月12日 优先权日2006年6月12日
发明者肖定军, 邓松之 申请人:中国科学院广州化学研究所