专利名称：花鲈肌动蛋白的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中基因克隆领域，特别是涉及一种花鲈肌动蛋白的基因序列。
背景技术：
肌动蛋白被定义成一种分子发动机，与细胞移动、细胞分裂以及伤口愈合有关；同时肌动蛋白还参与DNA转录，可以召集RNA聚合酶II，在RNA聚合酶II开始转录时充当一个分子发动机。如果肌动蛋白受到抑制，转录就无法开始。DNA转录这个过程对细胞的所有活动都非常重要。这些功能将使我们能够在遗传转录出错时进行有效干预；肌动蛋白可以作为辅助因子，具有降解细胞骨架的病毒酶的功能。
目前随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，因此从鱼体自身入手，克隆相关的功能基因，获得纯化的具活性的体外重组蛋白，高鱼体抗病能力是当今病害防治的趋势。至今对花鲈细胞方面的基因研究还较少，尤其对肌动蛋白基因的研究还属空白。
发明内容
本发明的目的是通过以近源物种肌动蛋白的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，克隆到花鲈肌动蛋白的基因的表达序列。它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所述。
1、总RNA的提取解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。
2、cDNA第一链的合成花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。
3、引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)肌动蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为F5’ATg gA(A/T) g(A/g)(T/C) gAA ATC gCC gC 3’R5’TTA gAA gCA TTT (g/A) Cg gTg gA 3’4、肌动蛋白基因PCR扩增、克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。测序所得序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对花鲈肌动蛋白的基因的测定所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈肌动蛋白基因同源序列。比对结果为Score ESequences producing significant alignments (Bits) Valuegi|56554009|gb AAV97945.1beta actin 2[Rivulus marmoratus]...6550.0gi|6716561|gb|AAF26678.1|beta-actin[Rivulus marmoratus]6550.0gi|52547951 gb AAR97600.2beta actin[Epinephelus coioides]...6550.0gi|40362701 gb AAR84618.1beta actin[Acanthopagrus schlegelii]6550.0
gi|19309743|emb|CAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...6540.0gi|13241079|gb|AAD14159.2|beta-actin[Oryzias latipes]＞gi|2...6530.0该基因序列不仅为研究鱼类肌动蛋白在DNA转录中的作用奠定了基础，而且通过该基因序列可获得具有活性的体外重组蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
具体实施例方式
1.总RNA的提取取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2.cDNA第一链的合成取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)肌动蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为F5’ATg gA(A/T)g(A/g)(T/C)gAA ATC gCC gC 3’
R5’TTA gAA gCA TTT(g/A)Cg gTg gA 3’4.肌动蛋白基因cDNA序列的克隆以近源物种肌动蛋白基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10x PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为1个循环，94℃变性5min；35个循环94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。测序所得序列利用Clustal W软件进行拼接。
5.对花鲈肌动蛋白基因的测定所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈肌动蛋白基因同源序列。比对结果为Score ESequences producing significant alignments(Bits)Valuegi|56554009|gb AAV97945.1beta act in 2[Rivulus marmoratus]...6550.0gi|6716561|gb|AAF26678.1|beta-actin[Rivulus marmoratus]6550.0gi|52547951|gb AAR97600.2beta actin[Epinephelus coioides]...6550.0gi|40362701|gb AAR84618.1beta actin[Acanthopagrus schlegelii]6550.0gi 19309743 emb CAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...6540.0gi|13241079|gb AAD14159.2beta-actin[Oryzias latipes]＞gi|2...6530.0
序列表<110>中国水产科学研究院南海水产研究所<120>花鲈肌动蛋白的基因序列<160>2<210>1<211>1128<212>RNA<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)<220>
<221>CDS<222>(1)...(1128)<400>1atg gat gac gaa atc gcc gca ctg gtt gtt gac aac gga tcc ggt atg48Met Asp Asp Glu Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met1 7 13tgc aaa gcc gga ttc gcc gga gac gac gcc cct cgt gct ttc ttc ccc96Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro17 23 29tcc atc gtc gtg cgc ccc aga cat cag gga gtg atg gtg ggt atg ggc144Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly33 39 45cag aag gac agc tac gtt ggt gat aaa gcc cag agc aag aga ggt atc192Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Lys Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile49 55 61ctg acc ctg aag tac ccc atc gag cac ggt att gtg acc aac tgg gat240Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp65 71 77gac atg gag aag atc tgg cat cac acc ttc tac aac gag ctg aga gtt288Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu ArgVal81 87 93gca cct gag gag cac cca gtc ctg ctc aca gag gcc ccc ctg aac ccc336Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Aal Pro Leu Asn Pro97 103 109aaa gcc aac agg gag aag atg acc cag atc atg ttt gag acc ttc aac384Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn113 119 125acc ccc gcc atg tac gtt gcc atc cag gct gtg ctg tcc ctg tat gcc432Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Aal Val Leu Ser Leu Tyr Ala129 135 141tct ggt cgt acc acc ggt atc gtc atg gac tcc ggt gat ggt gtg acc480Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr145 151 157cac aca gtg ccc atc tat gag ggc tac gcc ctg ccc cac gcc atc ctg528
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<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)<400>2Met Asp Asp Glu Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met1 7 13Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro17 23 29SerIle Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly33 39 45Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Lys Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile49 55 61Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp65 71 77Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val81 87 93Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Aal Pro Leu Asn Pro97 103 109Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn113 119 125Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Aal Val Leu Ser Leu Tyr Ala129 135 141Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr145 151 157His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu161 167 173Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile177 183 189Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile193 199 205Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu209 215 221Gln Glu Met Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr225 231 237Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg241 247 253Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys257 263 269Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp273 279 285Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr289 295 301Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu305 311 317Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys321 327 333
Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe337 343 349Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Ile Pro Ser353 359 365Ile Val His Arg Lys Cys Phe369 37权利要求
1.一种花鲈肌动蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2.一种花鲈肌动蛋白基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本发明从近源物种肌动蛋白的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总RNA，并用PCR法扩增，克隆到花鲈肌动蛋白的基因的表达序列。该基因序列不仅为研究鱼类肌动蛋白在DNA转录中的作用奠定了基础，而且通过该基因序列可获得具有活性的体外重组蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
文档编号C07K14/435GK1884531SQ200610035878
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者邱丽华, 江世贵, 张汉华 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所