专利名称：花鲈白细胞介素8基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于花鲈白细胞介素8基因序列。
背景技术：
白介素8(interleukin 8 IL-8)基因又称噬中性粒细胞激活因子或粒细胞趋化因子，属C-X-C型趋化性因子，是最早发现的趋化性因子。它由单核—巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞和肥大细胞等多种细胞经炎症刺激后产生，具有趋化和激活嗜中性粒细胞的能力，包括吸引噬中性粒细胞向炎症部位迁移，并诱导它们脱颗粒，释放溶菌酶，启动呼吸代谢爆发，增加细胞表面粘附分子的表达等多种功能，在炎症发生和发展过程中有重要的作用，是一种重要的免疫抗病基因。目前随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是当今病害防治的趋势。至今对花鲈免疫基因的研究还较少，尤其对IL-8的研究还属空白。
发明内容
本发明的目的是通过以近源物种IL8基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的全表达序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
本发明的目的通过以下技术措施实现1、总RNA的提取解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。2、cDNA第一链的合成花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。
3、引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为180bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4、IL-8基因cDNA全序列的克隆以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
在5′RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的测定所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈IL-8同源序列。比对结果Score ESequences producing significant alignments(Bits) Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlege|1541e-36
gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine [Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin-8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin-8[Cyprinus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28本发明的优点随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，一般的抗生素药物极易引起环境污染，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是病害防治的趋势。因此该基因的获得，不仅为研究鱼类IL-8在炎症反应中的作用，进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
具体实施例方式
1.总RNA的提取取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2.cDNA第一链的合成取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)IL8同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为180bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为F5’TGCCRCTGCATHGARAC 3’R5’ACTTGTTVATGACYHTCTTVACCCA 3’4.IL-8基因cDNA全序列的克隆以近源物种IL8基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为180bp。
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为10xPCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为1个循环，94℃变性5min；35个循环94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。
在3′RACE中，利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释50倍后，取1μL作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
在5′RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。
5.对花鲈白细胞介素8(IL-8)基因的测定所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈IL-8同源序列。比对结果Score ESequences producing significant alignments (Bits)Valuegi|74095881|ref|NP 001027759.1|interleukin-8[Takifugu rubri...1592e-38gi|62901686|gb|AAY18807.1|interleukin 8[Acanthopagrus schlegel1541e-36gi|19911219|dbj|BAB86884.1|CXC chemokine[Paralichthys olivaceu1463e-34gi|15667642|gb|AAL05442.1|interleukine-8[Paralichthys olivaceu1448e-34gi|52547128|gb|AAU81660.1|interleukin-8[Gadus morhua]1419e-33gi|77621310|emb|CAD59734.2|interleukin 8[Gadus morhua]1387e-32gi|91701717|gb|ABE47600.1|interleukin 8[Cypr inus carpio]1302e-29gi|31087942|gb|AAP42829.1|interleukin 8X[Oncorhynchus mykis...1262e-28
序列表<110>中国水产科学研究院南海水产研究所<120>花鲈白细胞介素8基因序列<160>2<210>1<211>803<212>RNA<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)<220>
<221>3’UTP<222>(460)…(803)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(159)<220>
<221>CDS<222>(160)...(459)<220>
<221>PolyA site<222>(788)...(803)<400>1ccaagaaaag gaaaagtaga gagagtgaac tcagtgaaag aataaggaat acagaagaat60aaaaaacttc tttactttta tacaggcttc atcagacggc tttctgaagg gcattcatat120ccttagtgat aatttgttgc aaaatttgta aaaggcaaa atg aag agc agc aga 174Met Lys Ser Ser Arg1 5gtg att gtc acc tct act gtg gtg ctc ctg gct ttc ttg gcc atc act 222Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu Ala Phe Leu Ala Ile Thr6 12 18gaa ggg atg agt ctg aga agc ctt gga gtg gag ctg cac tgc cgc tgc 270Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly Val Glu Leu His Cys Arg Cys22 28 34att gag acg gag agc aaa ccc atc ggc cgc cac att gag aag gtg gag 318Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile Gly Arg His Ile Glu Lys Val Glu38 44 50ctg att cct gcc aac tcc cac tgc gag gag act gag ctc att gcc act 366Leu Ile Pro Ala Asn Ser His Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr54 60 66ctg aag aag aca ggc caa gaa gtt tgc ctg gac ccg gag gct ccc tgg 414Leu Lys Lys Thr Gly Gln Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp70 76 82gtc aag aaa gtc atg aac aag ttc ctg tcc aac aga aca ccc tga 459Val Lys Lys Val Met Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Thr Pro86 92 98
acagatcggg agagatgtgt ttcatgagtc tgaacaattt caaagtacta aaaagtattt519atttgatagt catcacactc aatttaatac aatcaactgt caatttgatc aactgttgaa579aatgacaaca gaatttacca agtaaggtta tgtttgtatc aaacatgtgt gttaacaagc639ctgtgcttgt ttgtatgtca cttgtgtgtg ttactgtgta ttcttatcta taacttattt699gcttaaaata tttattgata tatttatgat gtaaatgtca attgtttagc tctgctgaca759accaattgat ttattaaaaa agtttaccta aaaaaaaaaaa aaa 803<210>2<211>99<212>PRT<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)<400>2Met Lys Ser Ser Arg Val Ile Val Thr Ser Thr Val Val Leu Leu1 7 13Ala Phe Leu Ala Ile Thr Glu Gly Met Ser Leu Arg Ser Leu Gly16 22 28Val Glu Leu His Cys Arg Cys Ile Glu Thr Glu Ser Lys Pro Ile31 37 43Gly Art His Ile Glu Lys Val Glu Leu Ile Pro Ala Asn Ser His46 52 58Cys Glu Glu Thr Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Thr Gly Gln61 67 73Glu Val Cys Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Val Lys Lys Val Met76 82 88Asn Lys Phe Leu Ser Asn Arg Tht Pro91 9权利要求
1.一种花鲈白细胞介素8基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQID NO.1所述。
2.一种花鲈白细胞介素8基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所述。
全文摘要
本发明以近源物种IL8基因的CDS序列的保守区设计兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈白细胞介素8(IL－8)基因的全表达序列。该基因不仅为研究鱼类IL－8在炎症反应中的作用，进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过氨基酸序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
文档编号C07K14/54GK1869229SQ200610035460
公开日2006年11月29日 申请日期2006年5月15日 优先权日2006年5月15日
发明者江世贵, 邱丽华, 张汉华, 黄桂菊 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所