专利名称：抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY及其在治疗口臭和牙龈中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY及其在治疗口臭和牙龈中的应用，抗体制备方法以及抗体制剂的配制和使用范围。
背景技术：
目前没有有效的治疗口臭的合适方法，尽管口臭与牙龈、牙周疾病密切相关，但最常见的治疗口臭的方法是使用抗菌素类药物先治疗牙龈、牙周疾病，再间接的治疗口臭，但使用抗菌素类药物治疗口臭有很多弊端。
我国牙龈、牙周疾病发病率占人口的70％以上，其中以成年人牙龈炎、牙周炎为多。牙龈炎、牙周炎患者牙龈红肿、发黑、进食及刷牙易出血、口臭及口腔异味、牙周袋形成、牙龈萎缩、牙槽骨破坏、牙齿松动脱落，若不及时治疗可导致牙齿脱落丧失，此外牙龈炎、牙周炎还是其它全身感染性疾病的病灶和细菌来源。牙龈炎、牙周炎的可疑病因菌有十余种之多，但主要的可疑病因菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、变形链球菌群、牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等。近年来从牙龈炎、牙周炎病灶中分离出牙龈二氧化碳噬纤维菌的患者数不断增多。
牙龈炎、牙周炎没有理想的治疗药物，基本都是抗菌素类药物，如甲硝唑、替其硝唑，以及表面活性剂，如氯己定等，它们的疗效不佳且有一定的副作用，如长期使用易导致白色念珠菌感染，甚至出现周围神经炎等，同时也易导致耐药菌株的产生。因此急需寻找新的方法和手段预防和治疗口臭、口腔异味、牙龈炎及牙周炎。
从主要的可疑病因菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、变形链球菌群、牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌中寻找引起口臭的主要因素是抑制口臭的关键。
有大量文献报道表明临床上使用特异性IgY抗体预防龋齿和治疗婴幼儿轮状病毒性腹泻，预防胆囊纤维化患者绿脓杆菌感染，减轻幽门螺杆菌引起的胃痛，这些治疗效果都已经得到了确切的证明。
我们认为在生物学领域，学术界对特异性IgY还存在一定的误解。一种典型的误解是认为某种IgY必然能抑制某种疾病，例如认为不需要做实验就能推定抗具核梭杆菌IgY能特异性抑制具核梭杆菌、抗牙龈卟啉菌IgY能特异性抑制牙龈卟啉菌、抗伴放线菌放线杆菌IgY能特异性抑制伴放线菌放线杆菌都是不科学的。上述抑制作用必须通过实验数据才能证明效果。
在我们研究的许多种类的IgY中发现，有的种类的抗原免疫的IgY的实验数据没有或没有明显的抑制趋势，简单的说，不是所有的IgY都有明显的治疗作用。例如目前没有实验数据可以证明爱滋病毒免疫的IgY能治疗爱滋病。
由于牙龈炎、牙周炎的可疑病因菌有十余种之多，但主要的可疑病因菌包括具核梭杆菌、牙龈卟啉菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、变形链球菌群、牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等。在探索制备对应的IgY用于治疗牙龈、牙周疾病的同时，我们推测具核梭杆菌、牙龈卟啉菌、伴放线菌放线杆菌、栖牙密螺旋体、变形链球菌群、牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌都有可能引起口臭；但我们事先无法预测在这当中的哪些菌是引起口臭的主要因素，哪些菌是引起口臭的次要因素。
我们认为必须有合适的抗口臭的临床试验来确定哪些菌是引起口臭的主要因素。从而指导制备抗口臭的药物或抗口臭的功能性食品。
目前的现有技术没有相关的提示指导技术人员发现抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY是解决治疗口臭的关键。
技术人员无法预先在不做抗口臭的实验的前提下，预先得知牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌是引起口臭的主要因素。
技术人员无法预先在不做抗牙龈的实验的前提下，预先得知抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY比单独的抗牙龈二氧化碳噬纤维菌IgY、单独的抗中间普氏菌IgY的效果更好。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗中间普氏菌特异性IgY、抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY及其在治疗口臭和牙龈中的应用，抗体制备方法以及抗体制剂的配制和使用范围。
本发明涉及的中间普氏菌的国际标准名为Prevotella intermedia。
本发明涉及的牙龈二氧化碳噬纤维菌的国际标准名为Capnocytophaga gingivalis。
本发明的目的还提供一种制备抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的方法和一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物和纯品，以及由这种抗二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合IgY抗体提取物和纯品配制的制剂，并用这种制剂预防和治疗由牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，以及与其有共同抗原决定簇的厌氧菌引起的口臭、口腔异味，及牙龈炎等。
本发明的目的是通过下列技术方案来实现抗中间普氏菌特异性IgY在制备预防和治疗口臭的制剂中的应用。
抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY在制备预防和治疗口臭的制剂中的应用。
抗中间普氏菌特异性IgY在制备预防和治疗牙龈的制剂中的应用。
抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY在制备预防和治疗牙龈的制剂中的应用。
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY，其中取抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30～60份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY40～70份混合而成。
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY在制备预防和治疗口臭的制剂中的应用。
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的制备方法，其中A细菌种类牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌；细菌的来源和培养牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌，来自牙周病患者口腔牙周袋炎症部位分离的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，以及标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌ATCC 33624和中间普氏菌ATCC 25261菌株，经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌；B免疫原制备取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片30～60份，中间普氏菌菌体的碎片40～70份混合成菌液；将等体积的菌液与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。
或者将等体积的菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原和福氏不完全佐剂混合免疫原中均含有细菌20亿-60亿；C免疫使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.5ml-2.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原1.5ml-2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后；此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫四次，前后共免疫七次。
D抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第30天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7-9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0-5.2，然后放置4℃ 12小时。
然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩5-10倍，然后加入0.02％-2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0-7.5，放置4℃ 12小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。
本发明的技术方案还可以展开如下
一种特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY抗体提取物，其特征在于该IgY抗体提取物是由以下方法和步骤制取(1)细菌来源及培养细菌的来源和培养来自牙周病患者口腔牙周袋炎症部位分离的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，以及标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌(ATCC 33624)和中间普氏菌(ATCC25261)等菌株，经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌；(2)免疫原制备取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体碎片30～60份，中间普氏菌菌体碎片40～70份混合成菌液；将等体积的菌液与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。
将等体积的菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。
每毫升福氏完全佐剂混合免疫原和福氏不完全佐剂混合免疫原中均含有细菌20亿-60亿；(3)免疫使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.5ml-2.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原1.5ml-2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后；此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫四次，前后共免疫七次。
(4)抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第30天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7-9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0-5.2，然后放置4℃ 12小时。
然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩5-10倍，然后加入0.02％-2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0-7.5，放置4℃ 12小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物；抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的制备方法还包括如下步骤将除去脂质物质后的抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、抗中间普氏菌混合IgY抗体提取物使用1N NaOH调节酸碱度至pH5.5-5.7，加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4-12小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4-12小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌、混合IgY抗体纯品；所述的免疫原制备中的牙龈二氧化碳噬纤维菌是指牙龈二氧化碳噬纤维菌的菌体及牙龈二氧化碳噬纤维菌的菌体碎片，所述的中间普氏菌是指中间普氏菌的菌体及中间普氏菌的菌体碎片；所述的免疫原制备中的细菌混合比例是牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体碎片10～70份，中间普氏菌菌体碎片30～90份；细菌与菌体碎片的比例是细菌40～80份，菌体碎片20～60份；细菌数量是从每毫升5亿至每毫升100亿；所述的免疫中的产蛋母鸡包括普通环境下饲养、清洁环境下饲养、以及SPF环境下饲养的各种不同鸡种的产蛋母鸡；所述的一种特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY还包括如下步骤加入药学上可接受的附加剂制成含有一种特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的喷雾剂、滴注剂、含片和牙膏。
按本发明的方法制取的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，IgY抗体的纯度达到30％以上(≥30％)；而经过发明的方法提取的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯化品的纯度，经非还原性SDS-PAGE测定，IgY抗体的纯度达到82％以上(≥82％)；按本发明的方法制取的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的生物学效价，经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的效价大于或等于1∶4000，即效价≥1∶4000/mg蛋白，或者称提取物里每毫克蛋白中特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的比活为≥1∶4000；而按本发明的方法提取的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的生物学效价，经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原的生物学效价达到每毫克蛋白中的特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的效价大于或等于1∶16000，即效价≥1∶16000/mg蛋白，或者称纯品每毫克蛋白中特异性抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的比活为≥1∶16000；按本发明的方法制取的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY配制的口腔喷雾剂、滴注剂、含片、牙膏等局部施于口腔、牙龈、牙周袋等处，与靶细菌表面抗原结合抑制了细菌的生长，排斥了细菌在炎症部位的存在，促进分叶核细胞和巨噬细胞等吞噬细胞对细菌的吞噬和清除。同时也无全身用药的局限性和副作用，又有局部用药起效快、用药量少、疗效好、不吸收、不破坏口腔、牙龈、牙周组织正常菌群的生态环境、不导致局部菌群失调等效果，还无毒副作用，更无抗菌素局部使用易产生耐药性等问题。IgY抗体不激活补体系统，不与类风湿因子产生非特异性结合，不固定金黄色葡萄球菌A蛋白，不与蛋白G，以及人类细胞Fc受体结合，因而不易发生变态反应。抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物不产生急性毒性反应和慢性毒性反应，属于实际无毒级；抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物三致试验阴性，属于无致畸、致癌、致突变的安全制品。
具体实施例方式下面结合实施例详细描述本发明的实现方案。
实施例1抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY，其中取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30～60份，中间普氏菌菌体特异性IgY40～70份混合而成。
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY在制备预防和治疗口臭和牙龈的制剂中的应用。
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的制备方法，其中A细菌种类牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌；细菌的来源和培养牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌，来自牙周病患者口腔牙周袋炎症部位分离的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，以及标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌ATCC 33624和中间普氏菌ATCC 25261菌株，经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌；B免疫原制备取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片30～60份，中间普氏菌菌体的碎片40～70份混合成菌液；将等体积的菌液与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。
或者将等体积的菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原；每毫升福氏完全佐剂混合免疫原和福氏不完全佐剂混合免疫原中均含有细菌20亿-60亿；C免疫使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.5ml-2.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原1.5ml-2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后；此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫四次，前后共免疫七次。
D抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第30天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7-9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0-5.2，然后放置4℃ 12小时。
然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩5-10倍，然后加入0.02％-2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0-7.5，放置4℃ 12小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。
实施例2单独取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片作为菌液；单独制备抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。其余制备参照实施例1。
实施例3单独取中间普氏菌菌体的碎片作为菌液；单独制备抗中间普氏菌特异性IgY提取物。其余制备参照实施例1。
实施例4取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY70份混合而成。
其余制备参照实施例1。
实施例5取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY40份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY60份混合而成。
实施例6取实施例2、3所得的抗中间普氏菌特异性IgY提取物，抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY提取物。按抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY35份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY65份混合而成。
实施例7制备500克抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物生产工艺流程
(1)细菌培养标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌(ATCC 33624)和中间普氏菌(ATCC 25261)等菌株经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并收集细菌；(2)免疫原制备将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。
牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体、中间普氏菌菌体、以及牙龈二氧化碳噬纤维菌体碎片、中间普氏菌菌体碎片50∶50数量份混合，其中细菌菌体与菌体碎片的比例为细菌菌体60份，菌体碎片40份。
将400ml的菌液与400ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备将400ml的菌液与400ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌25亿；(3)免疫产蛋母鸡使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给28周的产蛋母鸡，每只注射2.0ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后，此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫共四次，前后共免疫七次，免疫母鸡总数为300只；(4)抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第50～70天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0，然后放置4℃ 12小时；然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入1.0％的氯已定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0，并放置4℃ 12小时。此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物经ELISA(酶联免疫吸附实验)方法测定，提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1∶4000/mg蛋白，或者称提取物中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活为1∶4000。在IgY抗体提取物中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为33.5％。
实施例8制备500克抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品生产工艺流程
(1)细菌培养标准的牙龈二氧化碳噬纤维菌(ATCC 33624)和中间普氏菌(ATCC 25261)等菌株经BHI-S培养基分离培养和扩增培养的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并经鉴定确认为牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌，并收集细菌；(2)免疫原制备将上述菌体经石炭酸灭活处理。另外，用超声波粉碎机将细菌菌体超声粉碎30分钟，使细菌菌体粉碎裂解成细小的和/或分子的碎片。
牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体、中间普氏菌菌体、以及牙龈二氧化碳噬纤维菌体碎片、中间普氏菌菌体碎片60∶40数量份混合，其中细菌菌体与菌体碎片的比例为细菌菌体50份，菌体碎片50份。
将300ml的菌液与300ml的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏完全佐剂免疫原。福氏不完全佐剂免疫原的制备将300ml的菌液与300ml的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，制成油包水福氏不完全佐剂免疫原。每毫升免疫原中含有细菌50亿；(3)免疫产蛋母鸡使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给26周的产蛋母鸡，每只注射1.5ml免疫原，然后隔一周使用福氏不完全佐剂免疫原1.5ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后，此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫共四次，前后共免疫七次，免疫母鸡总数为300只；(4)抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的制备收集免疫第一次免疫后第60～80天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.05，然后放置4℃ 12小时。
然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将上清置于截留分子量100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩10倍，然后加入2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.03，并放置4℃ 12小时。此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。
将除去脂质物质后的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物加硫酸胺至55％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，将沉淀使用蒸馏水稀释到原体积量，再加硫酸胺至33％的饱和度，充分搅拌，室温静置4小时，然后高速离心10000rpm 10分钟，取沉淀，用蒸馏水稀释溶解后装入透析袋，用蒸馏水透析除盐，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品。抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品经ELISA方法测定，抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品中每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的效价为1∶16000/mg蛋白，或者称抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品中，每毫克蛋白中的特异性IgY抗体的比活性为1∶16000。在IgY抗体纯品中，IgY抗体的纯度经非还原性SDS-PAGE测定为93.6％。
实施例9抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的口腔喷雾剂抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物 0.20％甘露醇 5.0％氯已定 0.001％蒸馏水 补充至100％共100ml。
将60m1蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂的罐中。
其余分别重复实施例5、6、7。
实施例10抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的滴注剂抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物 0.30％甘露醇 5.0％氯已定 0.002％蒸馏水 补充至100％共100ml。
将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的滴鼻剂的瓶中。
其余分别重复实施例4、5、6。
实施例11抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的含片抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物 1.0％羧甲基纤维素 0.15％硬脂酸镁 0.10％山梨醇 补充至100％共100g。
将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。
其余分别重复实施例4、5、6。
实施例12
抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的喷雾剂及滴注剂抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品 0.1％甘露醇 5.0％氯己定 0.002％蒸馏水 补充至100％共100ml。
将60ml蒸馏水加入烧杯中，再依次加入上述成分，最后将蒸馏水补充至100ml，经0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，无菌灌装入消毒的喷雾剂和滴注剂的罐中。
其余分别重复实施例4、5、6。
实施例13抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的含片抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品 0.15％羧甲基纤维素 0.15％硬脂酸镁 0.10％山梨醇 补充至100％共100g。
将上述含片药物低温制粒，然后压成不同形状的口含片，每片0.5g。
其余分别重复实施例4、5、6。
实验例1牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等两种细菌组合的免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后30-40天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的提取物，应用ELISA方法测定抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合不同抗原的生物学效价(见表1)表1 牙龈二氧化碳噬纤维菌、抗中间普氏菌混合IgY抗体提取物的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到(1).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌两种菌菌体+菌体碎片免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗两种细菌的特异性IgY抗体；(2).产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即并不是免疫剂量大的细菌产生的IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；(3).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的混合抗原都能起反应，其效价有叠加作用；(4).由上述实验可见，一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY可以治疗由上述细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(5).同时也可以用一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(6).由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等，都可以使用本发明的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗。
实验例2牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原按本发明的方法免疫产蛋母鸡，取第一次免疫后80-100天的免疫母鸡的鸡蛋，并按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的纯品，应用ELISA方法测定抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY结合不同抗原的生物学效价(见表2)表2 抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY纯品的效价
根据上述实验结果可以清楚地看到(1).按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的纯品要比实验例1中的按本发明的方法制备出抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的提取物的特异性结合牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌混合抗原，以及牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等细菌各自抗原的生物学效价都要高，基本是按比例增加；(2).牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原免疫产蛋母鸡，可以产生分别抗两种细菌的特异性IgY抗体；(3).产生的对各种细菌的特异性IgY抗体的效价并不随免疫产蛋母鸡时每种细菌使用的剂量而变化，即并不是免疫剂量大的细菌产生IgY抗体的效价也高，这是与抗原的免疫原性相关；(4).抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌等两种菌的混合抗原都能起反应，而且总的特异性IgY抗体的效价也增加了，其效价有叠加作用；(5).由上述实验可见，一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY可以治疗由上述细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(6).同时也可以用一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY治疗由上述细菌中的任何一种细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等；(7).由此还可以扩大到由与上述细菌有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等，都可以使用本发明的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY预防和治疗。
实验例3按本发明的方法制备出的牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的菌体及牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌的菌体+菌体碎片等两种免疫原免疫产蛋母鸡，并分别制备出抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体混合IgY抗体提取物和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体提取物，应用ELISA方法测定它们抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原的结合生物学效价，结果见表4表4 不同免疫原诱导的母鸡特异性混合IgY抗体结合不同抗原的生物学效价
根据上述实验结果可以清楚地看到在相同的免疫条件下，按本发明的方法制备出牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片等两种不同免疫原免疫产蛋鸡，并制备出第一次免疫后80-100天免疫母鸡的鸡蛋的抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体混合IgY抗体提取物和抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体提取物等两种IgY抗体。这两种IgY抗体分别与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合抗原反应，结果这两种IgY抗体生物学结合效价有一定的差异，其中抗牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片混合IgY抗体的生物学结合效价更高。这些结果说明牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体+菌体碎片免疫原的免疫效果比单纯牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌菌体免疫原的免疫效果要更好。
实验例4生物学效价为1∶32000/mg，蛋白纯度为93.1％的特异性抗中间普氏菌(P.i，ATCC 25261)IgY抗体分别与牙龈二氧化碳噬纤维菌(Cg，ATCC 33624)、伴放线放线杆菌(Aa，ATCC 29523)、具核梭杆菌(Fn，ATCC 10953)、牙龈卟啉菌(Pg，ATCC 33277)发生免疫交叉反应，结果见表10表10 抗中间普氏菌IgY抗体与其它口腔厌氧菌交叉反应生物学效价
根据上述实验结果可以清楚地看到按本发明的方法免疫产蛋母鸡后，并按本发明的方法制备出第一次免疫后30-40天免疫母鸡的鸡蛋的抗中间普氏菌IgY抗体的纯品，其能够与牙龈二氧化碳噬纤维菌，以及其它口腔厌氧菌发生免疫交叉反应。这明确地证明这些口腔厌氧菌之间有着共同的抗原决定簇，相同的抗原决定簇越多，交叉反应就越强。因此，抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY制剂可以预防和治疗由上述具有共同抗原决定簇的细菌引起的口臭、口腔异味、以及牙龈炎等。
实验例5抗口臭的临床试验一、一般原则1.首次进行的抗口臭产品的功效验证或含有新型活性成分的抗口臭产品的功效验证应被一个以上的独立临床试验证实。
2.产品含有已通过临床验证的抗口臭的成分时，可通过证明此产品与临床已验证的产品的等效性来证实它的有效性。试验组和对照组(阳性对照)的产品应含有相同浓度的同一活性成分。另外，对照组也应包括空白对照或安慰剂。如果产品为一种机械清除的工具，对照组应为自然状态的日常刷牙清洁。
3.含有可能影响抗口臭活性的赋形剂(非活性成分)时，产品的功效应通过临床试验验证。
4.申请者需要提供材料证明配方中活性成分的生物活性和稳定性。
二、研究设计一般应采用盲法、分层、二单位平行试验或交叉试验方法。
三、试验期限应按受检产品的功效强度来确定。可为数小时至数周。
四、研究对象受试者为符合纳入及排除标准的患有口源性口臭的男性和女性。
一般每组完成试验全过程的人群数量应大于等于12人。
五、检查指标或采用指数可同时采用以下两种评价方法1.感官评价(即嗅觉评分)由训练有素的评估人员利用有效记分指标评价受试者的口气。试验前对评估者进行校正实验。
检查者与受检者距离约为10厘米，两者之间放置一屏蔽隔板。受检者用口向外呼气，检查者通过主观感受，分别评分，可采用0-5的等级，评分标准如下0察觉不到气味；1勉强可以察觉到气味，若有若无；2轻微但可明确察觉；3中等臭味；4重度臭味；5极强的不能忍受的恶臭。取检查者评分的均值作为结果。
2.仪器测量采用评估主要致臭因素的有效分析仪器测量(如口气测量仪Halimeter)口气测量仪利用电化学的原理，将口腔气体中挥发性硫化物的浓度以数值的形式表现出来，可作为衡量患者口气水平的指标。使用前先用环境空气调零，嘱受试者闭口三分钟后测量，测量时受试者用鼻呼吸，口微张，将集气管口放在舌背中后三分之一交界处上方0.5cm处，读取显示屏上的数值。每次检查重复三次，结果取平均值。
六、效果评价按医学统计方法，对试验组和对照组分别统计试验前、后口气值均数的变化和仪器读数均值变化情况；并比较两组之间各时间段、各指标的变化。
表11 抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY抑制口臭的实验效果使用方法取(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)的溶液1毫升，喷雾于口臭级别为四级(重度臭味)病人的口腔中，含漱三分钟，每天三次，疗程一个月后，评价治疗效果。
病人人数72人，随机分为六组，每组12人。
(1)组取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY35份，中间普氏菌菌体特异性IgY65份混合，加十万份蒸馏水而成。
(2)组取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。
(3)组取中间普氏菌菌体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。
(4)组取Treponemas denticola栖牙密螺旋体特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。
(5)组取Mutans streptococci变形链球菌群特异性IgY100份，加十万份蒸馏水而成。
(6)组蒸馏水。
权利要求
1.抗中间普氏菌特异性IgY在制备预防和治疗口臭和牙龈的制剂中的应用。
2.抗牙龈二氧化碳噬纤维菌特异性IgY在制备预防和治疗口臭和牙龈的制剂中的应用。
3.抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY，其特征在于取抗牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体特异性IgY30～60份，抗中间普氏菌菌体特异性IgY40～70份混合而成。
4.权利要求1所述的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY在制备预防和治疗口臭和牙龈的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY的制备方法，其特征在于A细菌种类牙龈二氧化碳噬纤维菌和中间普氏菌；B免疫原制备取牙龈二氧化碳噬纤维菌菌体的碎片30～60份，中间普氏菌菌体的碎片40～70份混合成菌液；将等体积的菌液与等体积的福氏完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原。或者将等体积的菌液与等体积的福氏不完全佐剂混合，使用高速搅拌器搅拌乳化，最终制成油包水福氏不完全佐剂牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌混合免疫原；C免疫使用注射器将福氏完全佐剂混合免疫原皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，每只产蛋母鸡注射1.5ml-2.0ml免疫原，然后每隔一周使用福氏不完全佐剂混合免疫原1.5ml-2.0ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡，加强免疫二次后；此后每隔八周再使用福氏不完全佐剂混合免疫原1ml皮下和肌肉注射给产蛋母鸡加强免疫四次，前后共免疫七次。D抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物的制备收集免疫第一次免疫后第30天的免疫母鸡鸡蛋，使用70％的酒精进行鸡蛋表面消毒，打开蛋壳取蛋黄，去除蛋黄膜取蛋黄液，将蛋黄液与蒸馏水按体积比1∶7-9的比例加蒸馏水，充分搅拌，并使用1N HCl调节酸碱度至pH5.0-5.2，然后放置4℃ 12小时。然后将蛋黄稀释液高速离心10000rpm，30分钟，取上清，将蛋黄稀释液上清置于截留分子量为100KD的中空纤维超滤器中超滤浓缩5-10倍，然后加入0.02％-2.0％的氯己定充分搅拌，并使用1N NaOH调节酸碱度至pH7.0-7.5，放置4℃ 12小时，此后高速离心10000rpm，15分钟，取上清，除去脂质物质，将上清经0.45μ-0.22μ的消毒微孔滤膜过滤除菌，即得抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合特异性IgY提取物。
全文摘要
本发明涉及一种抗中间普氏菌和牙龈二氧化碳噬纤维菌混合IgY及其在治疗口臭和牙龈中的应用，抗体制备方法以及抗体制剂的配制和使用范围。本发明是使用两种细菌的菌体和菌体碎片，制备成免疫原免疫母鸡，并应用本发明的方法从鸡蛋黄中提取、除脂和纯化IgY抗体，其得率高。使用本发明的IgY抗体配制的制品，如喷雾剂、滴注剂、含片、牙膏等，可以用于预防和治疗口臭、口腔异味、以及多种牙龈病。使用本发明的IgY抗体配制的制品效果长久，长期使用安全、无不良反应。
文档编号C07K16/12GK101028515SQ20061012549
公开日2007年9月5日 申请日期2006年12月15日 优先权日2006年12月15日
发明者唐宁, 胡国柱, 张进, 聂荣庆, 李昕昕, 李跃洪 申请人:胡国柱, 唐宁, 李跃洪