专利名称：桑寄生抗肝癌bel－7402蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种桑寄生抗肝癌BEL-7402蛋白的制备方法，属生化分离纯化工艺方法技术领域。
背景技术：
桑寄生科植物作为一种传统植物中草药，具有悠久的历史。在欧洲，寄生作为降压药在德国、奥地利等国民间也已广泛使用。近三十年研究成果表明，欧寄生中的凝集素成分已成为治疗肿瘤的一个药物于二十世纪八十年代进入临床。在我国，桑寄生多用于冶成风湿、腰背痛、明目、坚发齿、安胎等病症。现代生化分离和药理研究也多集中在小分子物质如黄酮类、生物碱等成分上。采用现代生物技术，对中草药桑寄生组分分离，从中寻找抗肿瘤新资源的研究，对于挖掘具有自主知识产权现代中药具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从中草药桑寄生分离出具有抗肝癌活性蛋白组分的方法。
本发明一种桑寄生抗肝癌BEL-7402蛋白制备方法，其特征在于具以以下工艺过程和步骤a.桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，用0.1～0.3mol/L氯化钠溶液在4℃下浸提12～24小时，浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为60～80％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP；b.粗品蛋白的分子筛层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI缓冲液透析，随后用孔径为0.45μ滤膜超滤；滤液上SephadexG100分子筛层析柱，用0.05mol/LTris-HCI缓冲液洗脱，流速为1毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，合并收集管得二部分有效组分；然后冷冻干燥，得二部分分子筛凝胶层析产品，即为纯化后的桑生蛋白。
本发明另一种桑寄生抗肝癌BEL-7402蛋白的制备方法，其特征在于具有以下工艺过程和步骤c.桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，用0.1～0.3mol/L氯化钠溶液在4℃下浸提18～24小时，浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为60～80％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP；d.粗品蛋白的CM-Sepharose Fast Flow层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI缓冲液平衡，随后上CM-Sepharose Fast Flow层析柱，依次以0.05mol/L Tris-HCI缓冲液、含0.1mol/L氯化钠-0.2mol/L氯化钠的0.05mol/LTris-HCI缓冲液洗脱，流速为10毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，按含量合并产物为四部分；然后冷冻干燥，得四部分层析产物，即为纯化后的桑生蛋白。
本发明方法制得的桑寄生蛋白对人体肝癌细胞生长具有抑制作用，可作为抗癌药物的有效组分。
具体实施例方式
现将本发明的实施例具体叙述于后。
实施例1本实施例中的制备步骤如下(1)桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，称取100克粉末，用0.15mol/L氯化钠溶液750毫升在4℃下浸提12小时，在此期间不断搅拌；将此浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为70％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP；(2)粗品蛋白的分子筛层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液透析，随后用孔径为0.45μ滤膜超滤；滤液上Sephadex G100(葡聚糖凝胶G100)分子筛层析柱，Sephadex G100层析柱尺寸为1×60cm，事先需用pH 8.0的0.05mol/L Tris-HCI缓冲液平衡；以0.05mol/L Tris-HCI进行洗脱，流速为1毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，合并收集管得二部分有效组分a和b；然后冷冻干燥，得分子筛凝胶层析产品CLGa和CLGb，即为纯化后的桑生蛋白。
实施例2本实施例中的制备步骤如下(1)桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，称取100克粉末用0.15mol/L氯化钠溶液750毫升在4℃下浸提12小时，在此期间不断搅拌；将此浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为70％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP。
(2)粗品蛋白的CM-Sepharose Fast Flow(羧甲基琼脂糖快速凝胶)层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液平衡，随后上CM-Sepharose Fast Flow层析柱；CM-Sepharose FastFlow层析柱尺寸为1×40cm，事先需用pH 8.0的0.05mol/L Tris-HCI缓冲液平衡；依次以0.05mol/LTris-HCI(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液、含0.1mol/L氯化钠-0.2mol/L氯化钠的0.05mol/L Tris-HCI缓冲液洗脱，流速为10毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，按含量合并产物为四部分；然后冷冻干燥，得四部分层析产品CLF1、CLF2、CLF3和CLF4，即为纯化后的桑生蛋白。
实施例中的测定蛋白质含量是采用Bradford法(考马斯亮蓝G250法)。Bradford法测定蛋白含量的方法如下以200微克/毫升牛血清蛋白溶液作标准，配制梯度浓度溶液，每管取1毫升，随后加5毫升Bradford工作液，轻轻混均，2分钟后测吸光度值A595，测量在1小时内完成。以蛋白质浓度为横坐标，A595为纵坐标绘制标准曲线。这样就可在样品测定A595后，查知样品的蛋白含量，该值乘以稀释倍数就可以定出总蛋白量。
现将中药桑寄生蛋白组分对肝癌细胞BEL-7402生长抑制试验叙述于后(1)、实验材料人肝癌细胞株BEL7402，购于上海生命科学院细胞所，PRM 1640培养基为Inviftogen公司产品，噻唑蓝和二甲基亚砜为Sigma公司产品。
(2)、实验方法将在含10％新生牛血清的MEN培养液、37℃、5％CO2培养中培养的肝癌BEL-7402对数期生长细胞，用胰蛋白酶消化后，配制成浓度为10000个/毫升的细胞悬浮，每孔200微升接种在96孔板中，每组至少设6孔平行。37℃、5％CO2继续培养24小时。然后弃上清，依次加入PBS配成10毫克/毫升的CLP、CLGa、CLGb、CLF1～4溶液，每孔200微升。MTT检验的阳性对照用5-Fu(5-氟脲嘧啶)(5微克/毫升)。阴性对照组用DMSO(二甲基亚砜)。37℃、5％CO2继续培养24小时后，弃上清，加入200微升DMSO溶解的6毫克/毫升MTT，37℃孵育4小时，用酶标仪测定490nm波长的吸光度A值并计算相对抑制率。
(3)实验结果经Bradford法检测、CLP总蛋白得率为0.33％、纯度为33.6％。CLP经层析纯化后纯度提高。CLGa、CLGb的蛋白纯度分别增加到87.6％和75.8％；CLF1、CLF2、CLF3和CLF4蛋白质纯度依次是92.7％、94.62％、93.3％、86.7％。MTT实验结果，以相对抑制率作条形图，如
图1所示，表明CM-Sepharose FastFlow纯化与Sephadex G100都能纯化桑寄生粗品蛋白，并且都能抑制BEL-7402肝癌细胞生长。其中CLGa、CLF2、CLF3作用较为显著。
权利要求
1.一种桑寄生抗肝癌BEL-7402蛋白制备方法，其特征在于具有以下工艺过程和步骤a.桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，用0.1～0.3mol/L氯化钠溶液在4℃下浸提12～24小时，浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为60～80％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP；b.粗品蛋白的分子筛层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI缓冲液透析，随后用孔径为0.45μ滤膜超滤；滤液上SephadexG100分子筛层析柱，用0.05mol/L Tris-HCI缓冲液洗脱，流速为1毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，合并收集管得二部分有效组分；然后冷冻干燥，得二部分分子筛凝胶层析产品，即为纯化后的桑生蛋白。
2.一种桑寄生抗肝癌BEL-7402蛋白的制备方法，其特征在于具有以下工艺过程和步骤a.桑寄生粗品蛋白的制备将干燥的中草药桑寄生粉碎成200目粉末，用0.1～0.3mol/L氯化钠溶液在4℃下浸提18～24小时，浸提液用布氏漏斗过滤，得滤液；在滤液中加入硫酸铵固体，调至饱和度为60～80％，随后在4℃下静置过夜；然后用离心分离机在6000rpm转速下低温离心分离20分钟，得沉淀物粗品蛋白CLP；b.粗品蛋白的CM-Sepharose Fast Flow层析纯化将上述所得的粗品蛋白CLP用去离子水溶解，并用Tris-HCI缓冲液平衡，随后上CM-Sepharose Fast Flow层析柱，依次以0.05mol/L Tris-HCI缓冲液、含0.1mol/L氯化钠-0.2mol/L氯化钠的0.05mol/L Tris-HCI缓冲液洗脱，流速为10毫升/分钟，每5分钟收集1管，分部收集；检测蛋白质含量后，按含量合并产物为四部分；然后冷冻干燥，得四部分层析产物，即为纯化后的桑生蛋白。
全文摘要
本发明涉及一种桑寄生植物中草药中抗肝癌BEL－7402蛋白的提取或制备方法，属生有分离纯化工艺方法技术领域。本发明方法的特征在于具有以下工艺步骤(1)将中草药桑寄生粉碎，用氯化钠溶液浸提12～24小时，抽滤混合物得滤液；(2)滤液中加入硫酸铵固体调至饱和度70％，离心分离得沉淀物粗品蛋白；(3)将粗品蛋白以水溶解、超滤，滤液上层析柱得蛋白活性组分，然后冷冻干燥，得纯化后的桑寄生蛋白。由MTT法检测肝癌细胞BEL－7402生长抑制实验结果表明，桑寄生蛋白对肝癌细胞BEL－7402生长抑制作用较为显著。
文档编号C07K2/00GK101070339SQ20071010807
公开日2007年11月14日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年5月26日
发明者刘山莉, 张林甦, 张健 申请人:上海大学