专利名称：：使用地中海拟无枝酸菌细胞制备11β-羟基-9β,10α-类固醇类的方法
技术领域：
：本发明涉及地中海拟无枝酸菌(爿附^C0,fl鄉s/S附efif/^/7Z"e/)物种的菌林用于将9(5，10a-类固醇类(反类固醇类)微生物转化为其对应的llp-羟基类似物的用途，以及涉及该物种的特定菌林。另外，本发明涉及使用地中海拟无枝酸菌物种的菌林将邓，10a-类固醇类(反类固醇类)转化为其对应的lip-羟基衍生物的方法，并涉及随后从细菌培养基中分离lip-羟基衍生物。得到的lip-羟基化产物是制备在llp-位置上具有不同类别取代基的具有9p，10a-构象的新型类固醇类化合物的有用中间体。通过引用将本文用于说明本发明背景的出版物和其它资料，尤其是提供关于实践的另外细节的案例并入本文，并不承认其是现有技术。反类固醇类反类固醇类，即具有；9p，10a-构象的类固醇，在本领域中是众所周知的。市售可得的下式(I-1)化合物地屈孕酮((9p，10a)-孕-4，6-二烯-3，20誦二酮)是一种口服有效的孕激素，并通常用于纠正机体内的孕酮缺乏。通过照射和光化学反应合成地屈孕酮例如描述于欧洲专利EP0152138B
背景技术：
：(US4，601，855)和EP0558119B1(US5，304，291)中。另外已知的反类固醇类例如，如US3,937,700中公开的1，2-亚甲基-3-酮-厶4'6-双脱氢-6-囟代-9|5，10a-类固醇和如BE652,597和US3，304，314所描述的3-酮-A4，6-双脱氬-6-离代-9[3，10a-类固醇。此外，专利US3，555，053描述了一种制备6-卣代-或6-烷基-9p，10a-类固醇的方法。一些6，7-脱氢-9p，10a-类固醇由Westerhof&Hartog[1965描述。另外反类固醇的合成公开于Hartog等[1972中，关于一些16-亚甲基-1701-乙酰氧基-9p，10a-孕-4,6-二烯-3，20-二酮衍生物和Halkes等[1972中，关于1,2(3-亚甲基-17a-乙酰氧基-9p，10a-孕烷。另外，18-烷基-9p，10a-孕烷衍生物由VanMoorselaar&Halkes[1969公开。然而，迄今已知的反类固醇类化合物全部被开发具有促孕活性，即是孕酮受体激动剂。显示激素活性并在Cll位上携带羟基或酯化的羟基取代基的另外的反类固醇已描述于GB1，111，320中。特别描述的化合物或中间体是1lp-羟基-9(5，10a-孕-4，6陽二烯画3，20-二酮(CASNo.22413-62-3)，11p-羟基-9p,10a-孕-4-烯-3，20-二酮(CASNo.10007-43-9)，和1lp-17a-二羟基-9p，10a画孕画4-烯-3，20-二酮(CASNo.4076-89-5)，以及其lip-乙酰氧基衍生物，其由对应的llp-羟基化合物通过化学修饰得到。由于化合物(它们是孕酮受体的激动剂、部分激动剂(即部分活化剂和/或组织特异性活化剂)和/或拮抗剂，优选显示平衡的激动/拮抗特征)被认为对妇女健康的改善具有重要价值，因此仍然需要开发新型的用改进的激动和/或拮抗模式在治疗上调节孕酮受体的化合物，其显示对孕酮相对于其他的齒体激素受体具有较目前已知的化合物更高的受体选择性，并且其提供了一种良好的组织选择性(例如，对子宫组织相对于乳腺组织的选择性)。，在ciip-位置上携带不同类型取代基的反类固醇类化合物可以实现此目标。然而，尽管有化合物公开于GB1，111,320中，但是迄今为止没有公开在Clip-位置上携带不同类取代基的反类固醇衍生物。因此，本发明的主要方面是提供可用于制备在Cll(5-位置上携带不同类型取代基的具有9p，10a-构象的新型类固醇类化合物(甾体化合物)的关鍵中间体，以及-"种以高收率和产量得到希望的中间体的方法。这些关键的中间体优选在甾核的ciip-位置具有羟基基团，并包含11(5-羟基-地屈孕酮，1lp-羟基-9p，10a-孕酮及其衍生物。甾核Cll位的微生物转化-羟基化类固醇类化合物的微生物转化，包括甾核Cll-位的羟基化，在本领域内是一种众所周知的方法。通常，曲霉(Js/^/^7/"s)或酒曲菌(及/ii^/7i^)物种的真菌菌林用于具有9a，10P-构象的类固醇类的lla-鞋基化(如在例如欧洲专利申请EP0028309和美国专利6，046，023中所公开的)。具有9a，10P-构象的类固醇类的1lp-羟基化作用可通过^f吏用真菌如弯孢霉属(美国专利4，353，985)的真菌，或更具体而言使用月状弯孢霉(C"簡/fl""/画似)(美国专利第4,588,683号)，或旋孢腔菌(/imW附)[ZakeJj國Mavric等人，1990来实现。反类固醇类的羟基化vanderSijde等人[1966的出版物用真菌赭曲霉林NRRL405处理反类固醇类，例如9p，10a-孕酮的Cll-羟基化。然而，反类固醇核的羟基化发生在lla-位。Saucy等人[19661的另一出版物也公开了反类固醇类在Cll位的微生物羟基化，但4吏用赭曲霉(/4s/^/^7/"s进行lla-羟基化且未揭示的微生物进行lip-羟基化。专利说明书GB1，111,320公开了某些特定的反类固醇类在Cll位的微生物羟基化。具体地，该说明书揭示了制备一些lip-羟基-反类固醇类的方法，该方法包括将相应的11-未取代的反类固醇与以下分类学亚群的微生物发酵半斧菌(F"w^,'i7n/7e//e"/)、子嚢菌、藻菌纲(尸/y^附j;"/M)、担子菌或放线菌目。特别适合于进行羟基化过程的前述分类学亚群的具体菌林包括南极生境真菌(G7^c/a力'wwcfl^w"/"-、链祐爭霧(^//<^/"(//附msew附J、好e/i'a鄉/ii附/;/r(/br附e、变灰青霉菌CPew/"7//"/cflesces)、gr/seocj;flw"51、伞状毛審菌(M"corc6^戸6f/er)、曲巻笄霉(Oroflw印/rom"/"""awsj、TVocfl/v//"/"尸油(=东方拟无枝酸菌苍黄亚种(J附jTo/fl鄉s"o"V"似/i'ss"As/.ZwnV/fl))、土霉素链霉菌(5Vr印似附j;cMW附M"s)和新霉素链霉菌(5V"/;,o附^myh//"e)。所提供的实施例显示了9卩，10a誦孕-4，6-二烯國3，20-二酮(地屈孕酮)、9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮(9p，10a-孕酮)或17a-羟基-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮(即与地屈孕酮相应或最相似的反类固醇类)的羟基化，其使用了以下菌林A^cflnZ/fl/"nV/fl、变灰青霉菌、南极生境真菌、"/,!7^we,曲巻笄霉、新霉素链霉菌、gWs^cjwiws和土霉素链霉菌。已公开的发酵方法的主要缺点是期望的发酵产物相对较低的收率，其典型地为2~10%，在一个实施例中相应浸提物的收率至多30%。地中海拟无枝酸菌细菌地中海拟无枝酸菌物种以前也被称为5Vr印M附j;cesweW/er-rawe/和7V0Cfln/ifl/we力'/e/Tffwe/[MargalithandBeretta，1960，k乂及Lechevalier等人1986。地中海拟无枝酸菌属于Actinobacteria纲，特别是属于分类学亚群放线菌目，并且属于Amycolatopsis属。从这一物种中已知数个菌林，并阜可从公众培养物保藏机构例如"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，,即DSMZ(地址MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,德国)获得，例如DSM43304(还在其它培养物保藏机构保藏，保藏号为ATCC13685、CBS121.63、CBS716.72、DSM40501、IFO13415、1MET7651、ISP5501、JCM4789、KCCS-0789、LBGA3136、NBRC13142、NBRC13415、NCIB9613、NRRLB-3240、RIA1376或VKMAc-798)、DSM40773和DSM46096(还在其它培养物保藏机构保藏，保藏号为ATCC21411、IMET7669)。用于抗生活性化合物利福霉素B的微生物产生的地中海拟无枝酸菌菌林是公知的；然而此物种到目前为止并未描述用于类固醇类化合物的羟基化，特别是未描述用于反类固醇类的cilp-羟基化。从微生物培养物中纯匕类固醇类的方法发酵方法的产物通常是从培养基中通过如下的多步方法分离的过滤(除去菌丝体)、萃取、任选色i瞽纯化、结晶以及后续的重结晶以便获得纯化合物。例如，专利说明书GB1，111，320中公开的微生物羟基化产物是从发酵批料通过包括以下步骤的充分精制的程序获得的多个液液萃取步骤和后续的柱色谱分析或者重结晶以进一步纯化，由此使用毒性和/或非-健康的有机溶剂例如苯或四氯化碳。因此，仍然需要最优化的用于反类固醇类化合物的微生物llp-羟基化的方法，尤其是需要鉴别能够进行这种具有高效率和高收率的鞋基化方法的细菌物种和相应的菌林。
发明内容本发明的目的是开发一种新的用于容易且定量地产生具有ciip-羟基基团的反类固醇类化合物的微生物转化方法，该化合物可用作合成基于已知孕酮激动剂地屈孕酮的反类固醇核的新型孕酮受体调节剂化合物的关键中间体。因此，本发明的一个目的是鉴别微生物物种，该微生物物种能够高效率和高收率进行与地屈孕酮相同或相似的反类固醇类的lip-羟基化。令人意外的是发现，通过使用地中海拟无枝酸菌物种的细菌微生物，通式(I)的9p，10a-类固醇(反类固醇)化合物可被转化为其对应的lip-羟基类似物，R1和R4—起形成氧，或者R4是P-乙酰基基团，且Rl选自氩、-OH、—O-(C广C0烷基和-O-CO-(d-C4)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。在一个实施方案中，在上述转化中所用的9P，10a-类固醇(反类固醇)化合物由通式(II)化合物表示其中Rl选自氢、-OH、-O-(d-C0烷基和-O—CO-(d—d)烷基；以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。进一步的实施方案涉及地中海拟无枝酸菌物种的细菌微生物用于前述转化的用途，该细菌性微生物是选自以下的菌抹地中海拟无枝酸菌LS30、DSM43304(对应于ATCC13685、CBS121.63、CBS716.72、DSM40501、IFO13415、IMET7651、ISP5501、JCM4789、KCCS-0789、LBGA3136、NBRC13142、NBRC13415、NCIB9613、NRRLB画3240、RIA1376或VKMAc-798)、DSM40773和DSM46096(对应于ATCC21411、IMET7669)。优选使用的微生物是菌林地中海拟无枝酸菌LS30,其保藏在"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，，即DSMZ(地址MascheroderWeglb，D-38124Braunschweig,德国)，保藏号为DSM17416。用于所述微生物转化的一个特别的微生物是菌抹地中海拟无枝酸菌LS30，其是新近鉴别的并且以前未在文献中描述过。该菌林LS30的特征是属于地中海拟无枝酸菌物种，基于宏观和微观外观(菌落形态学)、基于化学分类学分类(脂肪酸型)并且基于比较16SrRNA测序。因此，本发明还涉及菌林地中海拟无枝酸菌LS30，其保藏在"DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，，即DSMZ(地址MascheroderWeglb，D-38124Braunschweig,德国)，保藏号为DSM17416。当转化通式(I)的反类固醇类化合物时，其lip-羟基类似物由此将以转化产物获得，该转化产物由以下通式(IV)表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>其中R1和R4—起形成氧，或者R4是卩-乙酰基基团，且R1选自氢、-OH、-O-(d-C4)烷基和-0-CO-(C广C4)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。当转化通式(II)的反类固醇类化合物时，将获得作为转化产物的其llp-羟基类似物，该转化产物由以下通式(V)表示其中Rl选自氢、—OH、-O-(C广C4)烷基和-0-CO-(d-Q)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。所述通式(IV)和(V)化合物是期望的关鍵中间体化合物，其可用于制备新型的具有9p，10a-构象的类固醇类化合物，该类固醇类化合物在ciip位具有不同种类的取代基。落入通式(V)范围的一些特别的化合物是已知的，例如iip-羟基-9p，10a-孕-4,6國二烯國3，20誦二酮(CASNo.22413-62-3)、11卩誦羟基國9卩，100[-孕誦4誦烯-3，20-二酮(CASNo.10007画43誦9)和1lp-17a画二羟基國9p，10a-孕画4-烯-3，20-二酮(CASNo.4076-89-5);然而，通式(V)的其余化合物是新的，并且也形成本发明的一部命。因此，本发明进一步的目的是提供通式(V)的iip-羟基-反类固醇类化合物其中a)Rl选自氬、-OH、-O-(d-d)烷基和—O-CO-(C广CO烷基，并且R2和R3—起形成亚甲基，或者b)Rl选自-O-(d-C4)烷基和-0-CO-(d-C4)烷基，且R2和R3二者都表示氢；或者；c)Rl是-OH，R2和R3二者都表示氢，且该化合物是4，6-二烯。在一个实施方案中，所述lip-幾基-反类固醇中间体化合物选白1lP-羟基-l，2-亚曱基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-lip-羟基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-lip-羟基-l，2-亚曱基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，1lp-17a-二羟基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3,20-二酮，11p-17a-二羟基画l，2-亚甲基誦9p，10a國孕-4，6-二烯-3，20國二酮，11卩-羟基-1,2-亚曱基-9|3，10-孕-4-烯-3，20-二酮，17a-乙氧基國lip誦羟基画9p，10a画孕-4誦烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-ll卩-羟基-l，2-亚甲基-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮，和1lp-17a-二羟基-l，2-亚甲基-9卩，10a-孕-4-烯-3,20-二酮。因为本发明的目的是开发新的和改进的递送所述中间体化合物的方法，本发明进一步的方面涉及将通式(I)的反类固醇类化合物微生物体外转化成其相应liP-羟基类似物的方法，R4其中R1和R4—起形成氧，或者R4是P-乙酰基基团，且R1选自氢、-OH、—O-(C广Cj)烷基和—O-CO-(C广Q)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚曱基；该方法包括在(适宜的)发酵培养基中使式(I)化合物与能够进行式(I)化合物向其相应的lip-羟基类似物转化的地中海拟无枝酸菌物种的细菌成员接触，在一个实施方案中，本发明涉及将通式(II)的反类固醇类4匕合物微生物体外转化成其相应的lip-羟基类似物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>(II)Rl选自氩、—OH，-O-(d-<:4)烷基和-O-CO—(C广C4)烷基；以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基，该方法包括在(适宜的)发酵培养基中将式(II)化合物与能够进行式(II)化合物向其相应的iip-羟基类似物转化的地中海拟无枝酸菌物种的细菌成员接触。本发明进一步的实施方案涉及将通式(III)的9p，10a-类固醇类化合物微生物体外转化成其相应的ll卩-羟基类似物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>(III)其中Rl是氢或-O-(C广C4)烷基；以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚曱基，该方法包括在(适宜的)发酵培养基中将式(III)化合物与能够进行式(III)化合物向其相应的lip-羟基类似物转化的地中海拟无枝酸菌物种的细菌成员接触。此外，本发明涉及从发酵液中分离上文定义的通式(IV)和/或(V)的所需lip-羟基-反类固醇类化合物的优化方法。相应地，本发明还涉及用地中海拟无枝酸菌物种的成员转化上文定义的通式(I)、(II)或(III)的反类固醇类化合物之后，从发酵培养基(=细菌培养基)中分离所述lip-羟基类似物的方法，由此该lip-羟基类似物通过包括以下步骤的方法从发酵培养基中被分离a)从发酵培养基中获得上清液，其任选无任何细菌细胞、细菌碎片、粘液物质和固体，b)将上清液物质与足以吸附所述上清液物质中所含的lip-羟基类似物的量的非离子型半极性聚合物吸附树脂接触，由此获得栽荷有lip-羟基类似物的非离子型半极性聚合物吸附树脂，其后将该栽荷的吸附树脂与其余的上清液物质分离，所述上清液物质选自步骤a)中所获得的上清液、通过减少f斤述上清棟体积所形成的浓缩物和通过膜过滤所述上清液所得到的截留物质；c)将该载荷的吸附树脂用pH值为至少12.0,优选12.5至14的碱性含水洗涤液体洗涤；d)任选进行中间洗涤步骤，其中用水洗涤所述栽荷的吸附树脂；以及e)将经过洗涤的吸附树脂与足以脱附其上吸附的lip-羟基类似物的量的洗脱液体接触，所述洗脱液体含有至少一种水可混溶的有机溶剂，其选自水可混溶的醚、低级链烷醇和低级脂肪族酮或任选呈碱性的水至少一种选自水可混溶的醚、低级链烷醇和低级脂肪族酮的水可混溶的有机溶剂的混合物，以及f)将含有lip-羟基类似物的洗出液从吸附树脂中分离出来，并任选通过减少体积将该洗出液浓缩。定义如本文所使用的，以下术语用以下含义定义，除非另有说明。如本文所使用的，术语"包含"和"包括"以其开放的、非限制性的含义用于本文。词语"化合物"在此应被理解为涵盖所述化合物的任意和全部异构体(例如对映体、立体异辨体、非对映体、旋转异构体、互变异构体)或异构体的任意混合物、前药以及可药用盐，除非另有说明。对于化合物、盐等使用复数形式时，它还意指单一的化合物、盐等。本发明化合物可在分子中含有至少一个不对称中心，例如，手性碳原子，其取决于不同取代基的性质。在这种不对称中心的情况下，所述化合物因此可以两种旋光活性的立体异构体形式存在或者以外消旋体形式存在。本发明应包括外消旋混合物和异构体纯的化合物，除非在撰写中特别指明，或者在例如关于9(U0a-构象或Clip构象或C17p-乙酰基所呈现的结构式中特别指明。本发明化合物可在分子中含有另外的不对称中心，其取决于不同取代基的性质。在某些情况下，也可能因在邻接具体指明化令物的两个芳环的中心键周围受限旋转而存在不对称。预期所有^异构体(包括对映体和非对映体)，其由不对称中心的属性或由上述的受限旋转引起，作为分离的，纯化的或部分纯化的异构体或其外消旋混合物均被包括在本发明范围内。任何不对称碳原子可呈(R)-、(S)-或(R，S)-构型，优选呈(R)-或(S)-构型，无论哪个最有效。在双键或环上的取代基可以呈顺式-(-Z-)或反式(-E-)形式。术语"反类固醇"是指具有外，10a构象的类固醇类化合物。术语"取代的"意指具体指明的基团或部分具有一个或多个取代基。其中任何基团均可带有多个取代基并提供多种可能的取代基，所述取代基独立地选择并且不需要相同。术语"未取代的"意指具体指明的基团不具有取代基。术语"任选取代的"意指所述具体指明的基团未被取代或者被一个或多个取代基取代。术语"羟基"或"羟基"是指基团-OH。术语"烷基"表示烃基，其可以是线状、环状或具有单个或多个分支的分支状，由此该烷基通常包括1至12个碳原子。在一个实施方案中，术语"烷基"表示1至4个碳原子的线状或分支状(具有单个或多个分支)的烷基链，例如术语(C广CO烷基。术语(d-C4)烷基进一步的例子有例如如下基团甲基；乙基；正丙基；异丙基；正丁基；仲丁基；异丁基；以及叔丁基。该烷基或(d-Ct)烷基可以是部分不饱和的，形成例如以下的基团:？乙烯基、l-丙烯基、2-丙烯基(烯丙基)和丁烯基。术语"烷基"进一步包括环烷基，优选环(C3-C0烷基，其是指环丙基或环丁基以及其异构形式例如甲基环丙基。环烷基还可以是部分不饱和的。此外，术语(d-C4)烷基还包括环丙基甲基。术语"亚曱基，，是指-CH2-。术语"乙酰基"是指-CO-CH3。化合物编号(命名法)此外，为在对结构相似但取代基不同的化合物命名中保持一致性，本文描述的化合物是根据以下一般指南命名的。还提供了在所述化合物上的取代基的位置的编号系统。孕烷衍生物的甾核的;C-原于根据以下一般方案编号<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>反孕酮-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮-具有下式(I-3):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>一般的结构式通常用罗马符号I、II、III等表示。中间体用作为具有相应通式的罗马符号的相同编号和另外的字母或数字表示，例如1-2表示落入通式I范围内的具体衍生物。将本发明化合物指定为No.l、No.2等。缩写和首字母缩略词BV柱床体积d天DCM二氯甲烷DDQ2，3國二^L誦5，G誦二^L，6li(dkyanonezoquinone)DM干物质DMSO二曱亚砜DSMZDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenh小时HPLC高效液相色镨法LAH氬化铝锂min分钟NMMON-甲基吗淋-N-氧化物rpm每分钟转数通式(I)的浸提物通式(I)的9p，10a-类固醇(反类固醇)化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中R1和R4—起形成氧，或者R4是P-乙酰基基团，且Rl选自氢、-OH、-O-(d-C()烷基和-O-CO-(d-C4)烷基，以及R2和R3都是氩，或者一起形成亚甲基，以及用作本发明方法的原料，可以从已知的反类固醇类通过使用已知的化学反应和程序制备。虽然如此，提出以下一般性的制备方法以帮助读者合成用于本发明的浸提物。如果未在下文特别定义这些方法的所有可变基团，它们具有一般性描述中所述的含义。应当理解，本发明具有各要求保护的任选官能团的一些浸提物可不通过下列各方法制备。在各方法的范围内，任选的取代基可以出现在试剂或中间体上，所述试剂或中间体可用作保护基团或其它不参与的基团。使用本领域技术人员公知的方法，这些基团在提供本发明化合物的合成方案的过程中被导入和/或被除去。合成本发明化合物的厂般方案的步骤顺序显示于下文。在各方案中，R基团(例如R1、R2等)与说明书和实施例中所示的具体取代模式相对应。方案I<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>方案I显示了任选的反应，商业可得的式(I-1)的地屈孕酮(9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮)在1,2位被亚甲基取代。1，2-亚甲基的导入可根据如Halkes等人[1972和美国专利第3，937，700中针对17a-羟基-9p，10a-孕-4,6-二烯-3，20-二酮所述的公知程序进行，其通过脱氢，接着与二甲基亚甲基氧锍反应进行。方案II根据方案II,然后在根据美国专利第3,555,053号中所公开的程序的还原条件下，将通式1-1，2的任选地1，2亚甲基取代的9p，10a-孕-4，6-二烯-3,20-二酮转化成通式1-3，4的相应的9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮(9卩，10a-孕酮)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>在C17a位导入另外的侧链-如方案III所示-以便获得通式(I-A)化合物，其中Rll是-H、-(d-C4)烷基或-CO-(d-d)烷基，可以通过根据Halkes&vanMoorselaar[1969和美国专利第3，555，053号及第3,937,700号中所述的程序的方法，通过导入17a-羟基，以及任选接着醚化或酯化在碳原子17处的羟基。如果需要，为了获得通式(I-B)化合物，C6-C7位的双键可以通过脱氢被重新导入。C17位的官能化以在C17a位导入-OH基团开始例如，式1-3或1-4的(9p，10a)-孕-4-烯-3，20-二酮可通过使用适合的还原剂例如氢化铝锂(LAH)而被还原，产生相应的3，20-二醇。然后用选择性氧化剂例如在芳香族溶剂中的2，3-二氯-5，6-二氢苯醌(ddq)或二氧化锰将3-羟基选择性重新氧化。所得到的20-羟基-(9(5，10a)-孕-4-烯-3-酮通过用甲苯磺酰氯在吡啶中甲苯磺酰化而进一步被脱水。接着用沸吡啶处理产生的甲苯磺酸酯，得到顺式和反式异构体混合物形式的17，20不饱和的衍生物。然后使用胺氧化物例如N-曱基吗啉-N-氧化物(NMMO)作为化学计量的氧化剂和另外的过氧化氢在催化量的四氧化锇存在下将后一化合物氧化，产生相应的17a-羟基-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮。通过在碳原子C17处的羟基进行醚化或酯化反应可将该化合物进一步修饰，由此该反应一般性地描述于比利时专利说明书BE577,615或美国专利第3,937,700号中。适宜的酰化剂是羧酸、羧酸酐或羧酸氯化物，存在催化剂例如对甲苯磺酸、三氟乙酸、酸酐或吡啶-HC1，或者存在绰酸剂例如有机碱如可力丁。酰化反应是在溶剂例如烃如苯或曱苯存在下进行的。反应温度可在室温至所用溶剂的沸点之间变化。由于—如果起始物质中除含有除17_oh以外还含有一个或多个其它OH-基团一这些还可被酯化，所述其它的OH-基团应当预先被保护。或者，通过与烷基g在Ag20存在下反应，或者通过在弱酸性、弱碱性或中性介质中二氢吡喃或二氢呋喃的反应，可以进行烷基化反应。最后，所得化合物可再次脱氢，得到通式I-B的4，6不饱和的衍生物。方案IV1-1,2,3,4l-C根据方案IV，如Halkes&vanMoorselaar[1969所述，通过依次还原、氧化和消除，接着臭氧化解中间体18-甲基-9p，10a-孕-4,17(20)-二烯-3-酮或中间体18-甲基-9(3，10a-孕-4，6，17(20)-三烯-3-酮，可以将通式1-1,2,3,4的任选1,2亚甲基取代的9p，10a-孕-4-(6-二)-烯-3,20-二酮进一步转化成相应的通式I-C的18-甲基-外，10(1-雄甾-4-(6-二)-烯-3，17-二酮。微生物lip-羟基化的方法一般性实施该方法以通常的方式进行。为此目的，通常首先针对菌林产生已灭菌的营养液(-培养基)，然后将此营养液接种该菌林(通常是通过从琼脂板中刮取一些菌落并将其混悬于该培养基中)，接着培养。任选地，通过用等份样的所得到的培养混悬液接种新营养液可制备第二预培养物(preculture)。然后将以此方法产生的该预培养物加至发酵罐中，该发酵罐中还含有适宜的营养液。优选地，在该菌林培养物的生长期之后，然后将起始物质一通式I的化合物一加至该发酵罐中，以便可进行根据本发明的反应一将通式I的化合物转化为相应的通式IV的11-羟基化化合物。反应结束之后，将物质的混合物以通常方法或以本发明的方法纯化来分离需要的lip-羟基化反类固醇。地中海拟无枝酸菌菌株本发明提供的方法是基于如下发现地中海拟无枝酸菌物种的微生物能够将lip-羟基基团导入到11-未取代的9卩，1001-孕-4，6-二烯-3，20-二酮和9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮衍生物。这些菌林(其可从天然物质如土壤获得，也能在公开的培养物保藏机构获得)可以使用反类固醇类作为碳源或者在其它可同化碳源存在下能够耐受这些类固醇。因此，本发明提供的用于制备上文所定义的式IV或V的反类固醇类的方法包括将相应的11-未取代的反类固醇与地中海拟无枝酸菌物种的成员发酵。可用于进行本发明方法的具体的地中海拟无枝酸菌菌林的实例包括新近鉴别的LS30菌林以及可从公开的培养物保藏机构得到的菌林例如DSM43304(对应于ATCC13685、CBS121.63、CBS716.72、DSM40501、IFO13415、IMET7651、ISP5501、JCM4789、KCCS-0789、LBpA3136、NBRC13142、NBRC13415、NCIB9613、NRRLB-3240、RIA1376、VKMAc國798)、DSM40773和DSM46096(对应于ATCC21411、IMET7669)。在一个实施方案中，所述的菌株地中海拟无枝酸菌LS30是以DSM17416在DSMZ("DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，，)保藏的菌林地中海拟无枝酸菌。通过分子生物学方法、通过化学方法(例如通过用亚硝酸盐处理)用于发明的方法。或者，发酵ll-未取代的反类固醇类的酶也可从细菌培养物中或营养培养基中除去，并开始与类固醇底物在缺乏活细胞时接触。优选地，该菌林本身用于实施本发明以避免额外的生产步骤。如果需要，该菌林或从中拿离出的酶可以被固定在适宜的底物上。本发明方法是在通常用于以放线菌物种进行lip-羟基化的条件下进行的；例如GB1,111,320中所示。营养液(营养培养基)用于本发明方法的地中海拟无枝酸菌菌林可以在固体或液体营养液(=培养基)上培养，该营养液含有可同化的氮源、可同化的碳源和无机盐。适宜的可同化的氮源包括动物、植物、微生物和无机化合物例如肉萃取物、蛋白胨、玉米浸渍液、酵母萃取物、甘氨酸和硝酸钠，或者其混合物。适宜的可同化的碳源包括所有的糖类及其聚合物(例如淀粉、糊精、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖)和氨基酸、蛋白质、蛋白胨、脂肪酸、脂肪和类固醇(尤其;1^类固醇类)以及其混合物。优选地，该营养培养基含有作为氮源的至多2.5%(w/w)，优选0.2-2%量的酵母萃取物和作为碳源的至多20%(w/w)，优选5-10%量的葡萄糖。该培养基可含有微量元素(天然存在的或添加的)，其可得自无机或有机成分。铁的存在是特别期望的。优选地，该营养培养基含有Fe3+离子形式的铁，浓度为0至200mg/ml(FeCl3)，优选约50mg/mlFeCl3。硫可以以有机或无机化合物的形式存在，该化合物存在于该培养基的其它组分中，或者可以是特别添加的。对于磷也一样，但是通常它是以无机盐形式存在。根据需要或期望，可以向该培养基中加入其它生长因子或刺激物例如维生素(例如生物素或吡哆醇)或植物生长激素(例如吲哚基-乙酸)。为了保护避免感染，该培养基可以被灭菌，另外，可以含有抑制例如细菌生长的物质。对于较大容量的培养基，特别是在发酵罐中，可向该培养基中加入消泡剂。任选地，起泡程度可用消泡电极测定并通过自动添加消泡剂来控制。消泡剂包括，例如，硅-基(Silicon-based)消泡剂或表面活性剂如PEG或PPG。培养条件(PH值、温度、培养时间)接种之前，营养培养基的pH值期望调节到如下大致范围地中海拟无枝酸菌生长的最佳pH值是5-8，优选7.0-7.5。培养温度优选设置于地中海拟无枝酸菌的最佳生长温度，其为18'C-40。C，优选25-35。C，最优选28-32'C。然而，通常在开始微生物转化方法之前，给予地中海拟无枝酸菌一定的预生长期。通常，该细菌培养至多96小时，优选约12至约72小时，甚至更优选约24至约48小时。然而，确切的生长期可才艮据用于接种的预培养物的体积和年龄而改变，或者根据该培养基的体积而改变。优选地，当转化方法是通过添加式(I)的反类固醇开始时，细菌处于其指数生长期的中期或后期。可以使用深层发酵技术。优选的，该培养物是在通气(即通过在旋转振荡器上以一定的速度摇动含有发酵培养基的烧瓶，或者—在发酵罐中—通过搅拌和泵入无菌空气空过发酵培养基)下生长的。11-未取代的反类固醇(9B,10a-类固醇)(-"浸提物"或"底物")的添式(I)的11-未取代的反类固醇可以在地中海拟无枝酸菌生长的任何阶段加至发酵批料中。然而，优选地，如上所述给予该地中海拟无枝酸菌一定的预生长期，并且该11-未取代的反类固醇在开始发酵后12-96小时首先加入。该待转化的11-未取代的反类固醇可以任何方便的方式加入，但优选以导举11-未取代的反类固醇和细菌之间最大接触表面的方式加入。例如，该11-未取代的反类固醇可以粉末形式通过机械分散至培养基中加至培养物中，或以乳化的形式通过分散剂的方式加至培养物中，或者其可以以溶解于可与水混合的有机溶剂(例如丙酮、丙二醇、乙二醇单甲基醚、二甲基亚砜(DMSO)、二曱基甲酰胺和醇类例如甲醇或乙醇)中的溶液加入。然而，应当小心以保持下面所用的任何此种溶剂的水平(其会不利地影响细菌)，即通常低于约1%的体积。可以进行ll-未取代的反类固醇底物的乳化，例如，通过将后者以微粉化形式喷雾，或在水-可混合的溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮、乙二醇单甲基醚、二甲基曱酰胺或二甲基亚砜)中在强力下湍流到(优选脱钓的)水中，其含有常用的乳化辅助剂。适宜的乳化辅助剂包括，但不限于，非离子型乳化剂，娜如氧化乙烯加合物或聚乙二醇类的脂肪酸酯。优选地，将该浸提物(ll-未取代的反类固醇)溶解于DMSO中，浓度至最大为40mg/mL，然后在无菌条件下灭菌之后，加至该培养基中。加入的11-未取代的反类固醇的浓度对发酵反应结果的收率和效率有非常大的影响。由于通式(I)和(II)化合物在水性培养基中的相对低的溶解性，该浸提物和产物的浓度应当不超过一定的值。取决于细菌培养物的年龄和所用浸提物的溶解度，每升营养液可加入至多约lg的浸提物；然而，优选地每升营养液应加入约50mg至约500mg的浸提物，并且甚至更优选每升100-250mg。最优选的，类固醇起始化合物的量不应超过每升发酵培养基150mg的值。因此，应当小心，每升营养液的期望羟基化产物的量不应累积在lg值以上；优选产物应以每升约50mg至约500mg的量存在，甚至更优选每升发酵液存在100-250mg。最优选的是，每升发酵液的羟基化产物的量不应超过150mg的值。在一个实施方案中，全部量的11-未取代的反类固醇类化合物在转化过程开始时立即加入，或者在转化过程开始时的1至5小时期间(即短的时间期间)加入。在可替代的实施方案中，所述量的11-未取代的反类固醇类化合物是在完全转化期间以连续的方式加入的。例如，该11-未取代的反类固醇是以1至20mg/小时培养/升营养液(mg/h/l)的浓度加入的。优选地，该11-未取代的反类固醇是以2至5mg/小时培养/升营养液(mg/h/1)的浓度加入的。转化条件转化通常是在与地中海拟无枝酸菌菌林生长所需的相同pH和温度下进行的。然而，在某些情况下，用于生长的最佳温度和/或pH在整个11-未取代的反类固醇类的羟基化过程中可能不是最佳的，并且需要作出调整。11-未取代的反类固醇转化所需时间有一定的波动，取决于发酵批料、操作方式和所用的个体地中海拟无枝酸菌菌林，但通常在2-172小时的大致期间内。优选地，转化时间为约12-96小时，并且甚至更优选36-60小时。发酵过程通常是在需氧条件下进行的，优选培养基的相对02饱和pCVp02，max被调节为约5%至约95%,优选约20%至约80%，甚至更优选约30%至约75%，并且最优选约40%至约70%。对于各发酵批料，转化的过程可以通过通常的分析方法例如取自发酵批料的小试样的薄层色镨法，紫外吸收法或HPLC(高效液相色镨法)来测定。此外，转化方法的过程通过分析参数例如pH值、温度、相对02饱和、葡萄糖含量等监测。提供特定的通式IV或V的llp-羟基-反类固醇的生长期和转化过程的具体细节提供于下文实施例部分。最佳底物浓度、底物添加的时间和转化持续时间取决于式I、II或III的lip-未取代的反类固醇类的结构，并且最后还取决于用于羟基化反应的地中海拟无枝酸菌菌抹个体。在各单个的羟基化反应中，这些变量可以容易地用常规的初步试验在本领域普通技术人员的经验范围内确定。诱导转化的速度和产物的收率可以通过在添加11-未取代的反类固醇之前诱导需要的酶而被增加。任何类固醇(包括正常类固醇如雌二醇和睾酮)可以用作酶诱导剂。然而，比所用底物的水溶性更好的那些类固醇是优选的酶-诱导剂。添加诱导剂的量和时间不是关键的，虽然通常约l-10wt。/o的所用类固醇被加至培养基中。增加式IV或V的iip-羟基反类固醇类的收率的其它可能性包括将细胞毒性物质例如2，4-二硝基-苯酚或氰化钾或抗生素物质如氯霉素添加至发酵批料中，在该发酵批料中已经存在llp-羟基化所必需的酵。羟基化的反类固醇产物的分离完全转化之后，将羟基化的反类固醇从批料中分离。优选地，首先通过例如以下的已知分离方法将发酵批料分离成上清液和细胞物质、细菌碎片及其它固体物质沉积和倾析、分离、过滤或离心，这些方法更详细地解释于下文。实现分离的可能方法是借助用于类固醇可与水混溶的溶剂(例如乙酸乙酯、二氯曱烷、氯仿、甲基异丁基酮、四氯化碳、乙醚、三氯乙烯、醇类、苯和己烷)的萃取。细胞物质也可用前面段落提及的溶剂分离，并且还通过水-可混溶的溶剂(例如丙酮、二曱基亚砜和乙醇)萃取。从萃取物中获得的类固醇类可以通过重结晶、色谱法或通过逆流分配法纯化，并与发酵过程的不需要的副产物分离。优选地，式IV或V的llp-羟基-反类固醇类是从发酵批料中通过柱色谱法使用半极性非离子吸附树脂分离的。从妊娠母马的尿(PMU)中分离缀合的雌激素的类似方案公开于国际专利申请WO98/08526中，并且适用于本发明的目的。在第一步骤，用已知方法将发酵液除尽任何固体、细菌细胞和组分以及任何粘液物质。有利地，通过已知的分离方法将固体物质分离，该分离方法例如倾析、分离和/或过滤。这样，发酵液可以例如通过已知的分离装置如分离麥、过滤单元或沉积器。商业可得的分离器可用作分离装置，例如可以使用喷嘴分离器或腔室分离器。如果需要，也可使用微量过滤装置或超滤装置，并且如果使用它们，同时获得基本上无菌的且过滤的上清液是可能的。或者，离心可用作分离手段。步骤a)的上清液、通过减少其体积从中获得的浓缩物、或通过膜过滤从中获得的截留物质可用作本发明纯化方法的起始上清液物质。如果使用浓缩的上清液截留物质代替该上清液，其可从该上清液通过已知的膜过滤法获得。该截留物质的固形物含量及其组成可以根据所用的各个发酵培养物以及用于膜过滤的膜如其孔径、以及过滤条件而变化。例如，当使用纳米过滤膜时，可以达到该上清液截留物质中类固醇含量的实际上无,失疼缩，同时除去至多50%重量的低分子量发酵液的内容物。本发明方法可以使用已浓缩至约1:10比率例如约1:7比率，以及具有由此可减小到约1/10例如约1/7的原始上清液体积的体积的上清液截留物质。用于本发明纯化方法的适宜的吸附剂是聚合物吸附树脂。特别优选的吸附树脂是半极性的，尤其是非离子型半极性的聚合物吸附树脂。可用于方法步骤b)的非离子型半极性聚合物吸附树脂是多孔的有机非离子型聚合物，与非极性疏水聚合物吸附树脂相比，其具有中间极性(例如该树脂的活性表面的偶极矩范围为1.0-3.0,特别是1.5-2.0德拜)，并具有稍更亲水的结构，例如聚羧酸酯树脂。有利地，使用大孔半极性树脂，其具有优选大网络结构，平均孔径范围为50-150，优选70-100埃，并且比表面积范围为300-900mVg，优选范围为400-500m2/g。已证明特别适宜的是大孔交联脂肪族聚羧酸酯树脂，特别是交联聚丙烯酸酯树脂例如Rohm和Haas制造的AmberliteXAD-77"或AmberliteXAD-7-HPTM。根据本发明，羟基化的反类固醇类在半极性吸附树脂上的吸附可通过使所述上清液或者其浓缩物或截留物质与吸附树脂接触来实现，其中，所述上清液物质被导入到含有该吸附树脂的反应器中并在其中保持与该吸附树脂接触足够的时间以吸附类固醇内容物。一旦发生lip-羟基取代的反类固醇类在该半极性吸附树脂上的吸附，栽有lip-羟基取代的反类固醇类的吸附树脂可以用已知方法与剩余的上清液物质分离。有利地，该上清液物质可以以这样的流速通过含有该吸附树脂的柱子中，该流速使得接触时间足以吸附所述的类固醇内容物。适宜的流速例如是对应于3-J0，优选5-7体积份上清液物质/一体积份吸附树脂/小时的通量的那些。该吸附优选在室温下完成。有利地，上清液物质流过反应器的速率可以通过以微小的超压或降压(即相对于环境压力)操作来控制。所用的非离子型半极性吸附树脂的量可根据所用吸附树脂的类型以及上清液物质中所含固体的量而变化。当使用上清液时，例如，一体积份吸附树脂(如交联脂肪族聚羧酸酯吸附树脂)可栽荷或填充至多80，优选约30-50体积份预处理的上清液，在流出液中没有可觉察量的类固醇类化合物可检测到。当使用上清液浓缩物或上清液截留物质时，吸附树脂的载荷能力当然地减小到该上清液物质被浓缩的程度。例如，l体积份交联脂肪族聚羧酸酯吸附树脂可以负栽相应于20-80，优选30-50体积份的非浓缩上清液的量的浓缩上清液物质。在方法步骤c)中将栽，11(5-羟基取代的反类固醇类的半极性吸附树脂用洗涤水洗涤，该洗'^水被^节至pH范围为至少12.0，特别是12.5至14，优选约13.5-14。惰性碱性物质的水溶液(其溶解于该上清液中，并且其碱性足够强而达到pH值至少12.5)可以用作洗涤液体。适宜的水溶性碱性物质(其对半极性聚合物吸附树脂是惰性的)优选是水溶性无机碱例如碱金属氢氧化物或碱土金属氬氧化物，特别是氲氧化钠。有利地，洗涤水仅含有大约达到所需pH值，优选约pH13-14的量的碱性物质。选择碱性洗涤水的量是，使得足以实质上除去发酵液的所有其它内容物，而无明显量的11(3-羟基取代的反类固醇类与它们一起被洗出。例如，已证明有利的是使用2-10,特别是4-6柱床体积洗涤液体/柱床体积吸附树脂。在此情况下，该洗涤水以如下通过速度有利地通过含有吸附树脂的反应器3-10，优选5-7体积份洗涤水/1体积份吸附树脂/小时。在方法步骤d)中，然后任选地在方法步骤c)之后的第二中间洗涤操作中，将载有lip-羟^取代的反类固醇类的所述的非离子型半极性吸附树脂用水洗涤。洗涤水的量作个体调整。优选地，已证明使用2-10，更优选4-6柱床体积洗涤水/柱床体积吸附树脂是适当的。在此情况下，该洗涤水有利地以如下的通过流速通过含有吸附树脂的反应器3-10,优选5-7体积份洗涤水/l体积份吸附树脂/小时。在本发明方法的有利的实施方案中，任选的洗涤步骤d)是在低于室温，特别是在0。C-10。C的温度下进行的，因为已显示，可显著减少可能因额外的中间洗涤操作而引起的llp-羟基取代的反类固醇的损失。通常环境温度被认为是"室温"，例如该术语定义为20。-30。C的温度。在实际为0。C或大约0。C的温度下进行该方法是非常有利的。事实上，因此推荐在接近但^过0。C的温度下操作，并通过适宜的措施保证维持前述温度范围。可以为此使用降低温度的常规措施，例如使用冷却的反应器、冷却的物质和/或冷却的原料例如上清液物质。根据实际观点，O'C至约5'C、特别是O'C至约3'C的温度范围可以被认为是O'C或大约O'C的温度。为了使在中间洗涤期间lip-羟基取代的反类固醇类化合物的损失尽可能低，根据该方法的变型，用于中间洗涤操作的洗涤水和/或还有用于方法步骤C)的呈碱性的洗涤水将预冷至低于室温的温度，特别是预冷至0。C-10。C的温度。进一步有利或优选的温度范围是，如上文所述，0。C至约5°C，特别是0。C至约3。C的温度。优选在0。C或大约0。C的温度下操作，即优选地，用于中间洗涤操作的洗涤水和/或还有用于方法步骤d)的呈碱性的洗涤水被预冷至接近但高于0。C的温度。通过在方法步骤c)中使用呈碱性的冷却的洗涤水，达到一类预冷却或保持已发生的吸附树脂的冷却，例如，当使用冷却的洗涤水用于中间洗涤时，为了防止发生不需要的对水重新加热。因此优选地，该中间洗涤步骤和方法步骤c)均在例如低于室温，特别是在0。C-10。C的温度范围内进行，或者优选在如上所述相同的温度范围内进行。在该方法的以上变型中，其中所述的方法是在低于室温的温度下进行的，使用全部所用的装置(例如接受半极性吸附树脂的反应器、或已经含有它的和/或所用的上清液的反应器)，相应地预冷却至低于室温的温度，特别是0。C-10'C的温度，或者预冷却至上文所给的优选温度范围内可能是理想的。在方法步骤e)中，然后将载有lip-羟基取代的反类固醇类的洗涤的吸附树脂用足以洗脱11(5-羟基取代的反类固醇类的量的洗脱液体处理，然后在方法步骤f)中获得含有lip-羟基取代的反类固醇类的洗脱物。根据本发明使用的洗脱液体优选基本上由选自如下的水可混溶的有机溶剂组成水可混溶的醚、低级链烷醇和低级脂肪族酮或者任选呈碱性的该水可混溶的有机溶剂与水的混合物。该洗脱液体的适宜的醚组分包括水可混溶的环醚例如四氢呋喃或二噁烷，以及水可混溶的开链醚例如乙二醇二甲醚(=单甘醇二曱醚)、二乙二醇二甲基醚(=二甘醇二甲醚)或乙氧基乙氧基乙醇(=卡必醇)。适宜的低级链烷醇包括水可混溶的具有1-4个，优选1-3个碳原子的烷基醇，特别是乙醇或异丙醇。适宜的低级脂肪族酮包括水可混溶的有3-5个碳原子的酮，特别是丙酮。已证明有机溶剂是乙醇的洗脱液体是特别有利的。有利地，任选呈碱性的前述水可混溶的有机溶剂之一与水的混合物被用作洗脱液体。该含水洗脱剂的pH偉是中性至碱性范围至高pH13，并且有利地可以是约10-12。在所用的该pH范围内稳定的溶剂被选择作为该含水洗脱液体的溶剂组份。在具有pH值大约10-12的含7JC碱性洗脱液体中，低级链烷醇，优选乙醇，是特别适宜作为溶剂组份的。该含水洗脱剂的期望pH值是通过添加相应量的水溶性惰性碱性物质达到的，该惰性碱性物质优选为无机碱，例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，特别是氢氧化钠。在含水洗脱液体中，水可混溶的有机溶剂与水的体积比可以在40:60至20:80的范围内，优选大约30:70。所用的洗脱剂的量可以是大约3-10,特别是大约4-6柱床体积洗脱液体/柱床体积吸附树脂。有利地，该洗脱液体是以这样的流速通过含有栽有11P-羟基取代的反类固醇的吸附树脂的反应器，该流速使得接触时间足以完全洗脱所述的lip-羟基取代的反类固醇类。当使用体积比为30:70的乙醇与水的混合物时，适宜的是例如流速为3-10，优选5-7体积份洗脱液体/1体积份吸附树脂/小时。当使用乙醇作为洗脱液体时，适宜的是例如流速为3-10，优选5-7体积份洗脱液体/1体积份吸附树脂/小时。有利地，该洗脱是在室温至大约60。C的温度范围内，优选在室温下进行的。如果需要，通过在轻微升高的压力例如在直到0.2bar(相对于环境压力)的过压下操作来调节流速，并且以数个级分收集洗脱物。所需的lip-鞋基取代的反类固醇的含量和任选的在单个洗脱物级分中的相应的11未取代的反类固醇类的含量可以以已知方法通过HPLC测定。洗脱后，最初获得实际上无类固醇的初期级分，其量通常对应于大约1个柱床体积。在进行中间洗涤步骤e)的情况下，当开始洗脱方法时已经获得的第一级分可以已经含有显著量的llp-羟基取代的反类固醇。然而，存在于起始上清液中的大量的lip-羟基取代的反类固醇类例如80-99%的lip-羟基取代的反类固醇类是在后续主要的洗脱物级分中，其量通常为2-4柱床体积。在后续运行后级分中通常仅含有痕量的类固醇。如果获得:的后续级分仍然有显著量的类固醇，则可以将它们与含有lip-羟基取代的反类固醇的主洗脱物合并以进一步处理。吸附柱可以在此后通过用5-10柱床体积的水洗涤来再生。以前述方式从吸附树脂中分离的主洗脱物含有11p-羟基取代的反类固醇类。如果需要，为了获得基本上无有机溶剂的浓缩物，洗脱物的体积可以进一步以已知方式例如通过蒸发来减少。通常，lip-羟基取代的反类固醇从浓缩的洗脱物中沉淀。或者，洗脱物浓缩物的体积可以进一步减少，直到获得lip-羟基取代的反类固醇类为固体物质。通常，通过过滤分离该沉淀的反类固醇类化合物，并且可进一步用水洗涤。千燥之后，该固体物质可直接用于后续转化反应而不必进一步纯化。然而，如果需要，获得的化合物可再次溶解于适宜的有机溶剂中，并从其中结晶。或者，该化合物的进一步纯化可通过急骤色镨法完成。式IV的110-羟基-9B,lOa-类固醇类(llB-羟基-反类固醇类)收率、鉴别和应用通过本发明的方法获得的式IV的11J5-羟基-反类固醇类的收率将根据所用的培养和发酵条件而变化，但是通常，在发酵过程结束时所需产物的收率大于理论收率的约40%，优选大于约50。/。，甚至更优选大于60%,并且最优选^于70%，其基于原料的量。本领域寺支术人员用常规试验可以选择最佳条件，包括最佳菌林的选择和对于给定原料的最佳底物浓度，得到最佳收率。包括优选的从发酵批料中分离式IV和V的iip-羟基-反类固醇类的方法、以及使用急骤色镨法的另外的纯化步骤，式IV和V的ll卩-羟基-反类固醇类的总收率为理论收率的约40%至约60%,其基于原料的量。发酵产物(即式IV和V的iip-羟基反类固醇类)的分离和鉴别可通过薄层色镨法实现，用于鉴别的适宜的显色反应是通过用浓硫酸喷雾接着用含3%香草醛的乙醇喷雾来完成的。加热时各种类固醇产物与硫酸产生显色反应。用含香草醛的乙醇喷雾显色也同样是特征性的。或者，发酵产物可以通过HPLC(高效液相色谦法)分析和鉴别，也可以定量。通过进行该方法的发酵步骤获得的式IV和V的llp-羟基-反类固醇类代表了优选的用于合成新型的具有11-位取代基的反类固醇类化合物(其显示出促孕和/或抗-促孕活性)的中间体。以下实施例意在更详细地说明本发明而非限制其范围。具体实施例方式实验部分实验1.浸提物的合成1.1.1，2-亚曱基-9(5，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮的合成如美国专利第3,937,700号所述通过脱氢并接着与二甲基.亚甲基氧锍反应，将商业可得的式1-1的地屈孕酮(9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮)转化成相应的式1-3的1，2-亚甲基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20画二酮((l，2-亚甲基-地屈孕酮))。1.2.9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮(9(5，10a-孕酮)在还原条件下将商业可得的式1-1的地屈孕酮(9p,10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮)转化成相应的式1-3的9p，10a-孕-4-烯-3,20-二酮(9p，10a-孕酮)。将0.75g的Pd/CaC03(5。/。Pd)在100ml甲苯中的混悬液用H2氢化。然后加入50g地屈孕酮(160mmol)在550ml甲苯中的溶液；通过用2x50ml份的甲苯清洗，加入地屈孕酮的残余物。在剧烈搅拌下进行氢化，直到已吸收3.61的H2(约lh)。将该混悬液通过硅藻土抽吸过滤，用一些曱苯再洗涤。真空下除去溶剂，再将所得残余物重新溶解于约90ml二氯甲烷(DCM)中。通过添加900ml温的己烷将产物结晶。通过抽吸过滤除去形成的结晶，再用100ml的10%DCM/己烷再洗涤。真空千燥，得到36.9g的(I-3)([aD2(^-60(c^，CHCl3))。将溶剂从母液中完全除去，并将残余物(约13g)溶解于大约20ml的DCM中。通过添加150ml己烷开始结晶。抽滤和洗涤之后，获得7.3g的(I-3)的第二结晶。总收率44.2g的(I-3)(88%)。1.317a-乙氧基-9(5，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮的合成然后通过如一般部分所述的多步反应，将从实施例1.2获得的式1-3的9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮(9p，10a-孕酮)转化成相应的式1-5的17a-乙氧基-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮。1.417a-乙氧基-l，2-亚甲基-9卩,10a-孕-4，6-二烯-3,20-二酮的合成<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>根据上文实施例1.2和1.3所示方案，将式1-2的1，2-亚甲基-地屈孕酮(实施例1.2中获得)转化成相应的式1-6的17a-乙氧基-l，2-亚曱基誦9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮。1.5.18-甲基-9p，10a-雄甾-4-烯-3，17-二酮的合成如一般部分所述，通过依次还原、氧化和消除，接着臭氧分解中间体18-曱基-9p，10tt-孕-4，17(20)-二烯-3-酮，将商业可得的式1-1的地屈孕酮(9p,10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮)转化成相应的式1-7的18-曱基-9卩，10a-雄甾-4-烯-3，17-二酮(脱-乙酰基-9卩，10a-孕酮)。2.用地中海拟无枝酸菌生物转化浸提物和产物的检测通过HPLC分析取自发酵培养基的试样或者分析产物萃取后提取的稀释的试样，可以监测发酵反应的过程或结果。使用装配有LC-10ATVP泵、SPD-10AVPUV-VIS波长检测器、SCL-10AVP控制系统、FCV-1010ALVP溶剂组混器和SIL-IOAD-VP自动进样器的仪器(来自Shimadzu)进行该色谱法。使用C18反相ET250/4Nucleosil120-5柱(Machery&Nagel)和甲醇/水(75:25，体积)溶剂系统分离类固醇和转化产物。操作条件是样品体积20jU，流速0.5ml/min，UV检领寸298nm，压力约92巴。营养培养基为了培养地中海拟无枝酸菌，使用含有80g/l葡萄糖、2g/l酵母萃取物、1.3g/lK2HP04x3H20和lg/1MgS04x7H20的含水培养基。用0.1MHC1将pH值调节至pH7.0-7.2。较大体积(即51以上)未调节pH;未经调节的培养基pH值约为7.5。将该培养基在121。C下灭菌至少20分钟(取决于体积大小)。2.1.用地中海拟无枝酸菌LS30生物转化地屈孕酮(小培养物容积)从琼脂板中转移地中海拟无枝酸菌LS30菌落，再在500mlEr-lenmeyer烧瓶中使用100ml营养培养基生长。该培养物在以200rpm和30'C操作的旋转振荡器(Certomat，B.Braun，德国)中孵育。在这些条件下培养3_4天之后，将由此获得的预培养物(其含有丸状沉淀形式(即聚集形式)的细菌)通过使用stomacher轻轻均化。使用均化的预培养基的l-10。/。(vol/vol)接种物，通常2。/。(vol/vol)接种物接种于含有100ml相同营养培养基的500ml烧瓶中。如上所述将该培养物再次培养46-50小时。然后，将15mg的地屈孕酮(为20mg/ml的DMSO溶液)加至第二培养基中，使得类固醇的初始浓度为0.015%(重量)。如上所述将所得混悬液在30。C'和200rpm下孵育46-50小时，以促进地屈孕酮羟基化。然后，将该培养基离心(20min，17,000xg)。将等份样的上清液通过HPLC分析。在添加固体NaCl的情况下将该上清液用%体积的乙酸乙酯萃取两次。合并有机相，用NaS04干燥，再如上所述通过HPLC分析。来自三个独立试验的结果显示在表1中表l:地屈孕酮在Erlenmeyer烧瓶中发酵的收率<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>2.2.用地中海拟无枝酸菌LS30生物转化地屈孕酮(大发酵罐批次)从琼脂板中转移地中海拟无枝酸菌LS30菌落，并在500mlEr-lenmeyer烧瓶中使用100ml营养培养基生长。该培养物在以200rpm和30'C操作的旋转振荡器中孵育。在这些条件下培养4天之后，将lml等份样的第一预培养物用于接种两个含有80ml营养培养基(=接种培养基)的500ml烧瓶。如上所述将该培养物再次培养28-32小时。然后，将1天龄的预培养物合并，并加至无菌发酵罐(大小151，B.Braim，德国)中，该发酵罐中填充有6-81灭菌营养培养基-接种体积设置为约2%vol/vol的发酵罐体积。使该细菌生长40-44小时，任选在30。C下添加PPG2000作为消泡剂，并通气(31/min，151发酵罐)和搅拌(开始时300rpm，151发酵罐)。搅拌器的速度任选调节至较高速度以^使获得至少50%的相对02饱和(p02/p02,max)。然后开始添加地屈孕酮将该地屈孕酮在以下转化期间以在DMSO中的20mg/ml溶液的形式、以通常约3-3.5mg/升营养培养基/小时培养的浓度连续加入，直到加入预定量的地屈孕酮(确切值见表2)，然后停止转化；或者在1小时内加入总量的地屈孕酮，然后继续转化46-50小时。在一固定时间段之后，停止转化，并通过微孔过滤将细菌从发酵液中分离。通过HPLC分析获得的上清液。如以下实施例3所述将羟基化的地屈孕酮从上清液中分离。来自四个独立发酵的结果总结于以下表2中表2:地屈孕酮发串<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>A)在500ml烧瓶中发酵以实施例2.1所述程序类似的方式，使用15mg的17-乙氧基-1，2-亚甲基-地屈孕酮作为浸提物，获得4mg的17-乙氧基-11-羟基-1，2-亚甲基-地屈孕酮(收率26%)。力NMR(501MHz，氯仿-d):Sppm0.87(s，3H)0.89■0.93(m，1H)1,13画1*18(m，3H)1*30-1,36(m，1H)1,39(s，3H)1,40國1,49(m，1H)1.69-1.83(m，3H)1.87-1.94(m，1H)1.95國2.01(m，1H)2.11-2.17(m，4H)2.39-2.47(m，1H)2.49誦2.55(m,1H)2.59(dd，J=14.5,4.4Hz,1H)2.70曙2.77(m，1H)2.98-3.06(m，1H)3.39-3.47(m，1H)4.70画4.75(m，J=2.4Hz，1H)5.51-5.53(m，1H)6.08画6.10(m，2H)13CNMR(126MHz，氯仿-d):Sppm13.8(q，1C)15.6(q，1C)16.4(q，1C)23.3(t，1C)24.2(t，1C)25.4(d，1C)26.5(q，1C)26.7(d,1C)28.6(q，1C)34.9(d,1C)36.9(s，1C)37.9(t，1C)44.2(d，1C)47.6(s，1C)48.1(d，1C)59.9(t，1C)69.3(d，1C)95.8(s，1C)120.3(d，1C)127.2(d，1C)139.0(d，1C)156.2(s，1C)198.3(s，1C)210.3(s，1C)B)在151发酵罐中发酵以实施例2.2所述程序类似的方式，将17-乙氧基-1，2-亚甲基-地屈孕酮用作浸提物以便获得相应的17-乙氧基-11-羟基-1，2-亚甲基-地屈孕酮衍生物从琼脂板中转移地中,海麵无枝酸菌LS30菌落，并在500mlEr-lenmeyer烧瓶中使用100ml营养培养基生长。该培养物在以200rpm和30'C操作的旋转振荡器中孵育。在这些条件下培养4天之后，将lml等份样的第一预培养基用于接种两个含有80ml营养基(=接种培养基)的500ml烧瓶。如上所述将该培养物再次培养24-30小时。然后，将1天龄的预培养物合并，并加至无菌发酵罐(大小151)中，该发酵罐中填充有81灭菌营养培养基。使该细菌生长44-50小时，任选在30。C下添加PPG2000作为消泡剂，并通气(31/min)和搅拌(2卯rpm)。搅拌器速度调节至较高速度以便获得至少50%的相对02饱和(p02/p02，max)。然后，以在DMSO中的8mg/ml溶液的形式、以通常约22.7mg/小时培养的浓度连续加入0.578g的17-乙氧基-l，2-亚甲基-地屈孕酮。发酵24-28小时之后，停止该过程，并通过微孔过滤将细菌从发酵液中分离。将获得的上清液通过HPLC分析。该上清液含有0.187g的17-乙氧基-11-羟基-1,2-亚曱基-地屈孕酮，相应的收率为31%。根据下文实施例3所述的程序，将该17-乙氧基-11-羟基-1，2-亚曱基-地屈孕酮从上清液中分离。2.4.用地中海拟无枝酸菌LS30生物转化17-乙氧基-地屈孕酮以实施例2.1所述程序类似的方式，使用10、15或20mg的17-乙氧基-地屈孕酮作为浸提物，获得相应的17-乙氧基-11-羟基-地屈孕酮，收率分别为32、37和30%。力匪R(400MHz,氯仿國d):Sppm0.86(s，3H)1.15(t，J=6,9Hz，3H)1.28(s,3H)1.37誦1.52(m，1H)1.64國1.94(m，5H)2.15(s，3H)2.27誦2.68(m，6H)2.70-2.79(m，1H)2.97-3.07(m，1H)3.39-352(m，1H)4鲁48画4.54(m，1H)5.70-5.73(m，1H)618國6.26(m，2H)13CNMR(101MHz，氯仿誦d):8ppm15.6(q，1C)16.3(q，1C)21.5(q，1C)23.3(t，1C)24.2(t，1C)26.4(q，1C)33.8(t，1C)35.1(d，1C)35.4(t,1C)35.7(s，1C)38.0(d，1C)44.7(t，1C)47.0(s，1C)50.1(d，1C)59.8(t，1C)68.2(d，1C)95.7(s，1C)124.1(d，1C)127.0(d，1C)140.6(d，1C)162.5(s，1C)199.1(s，1C)210.3(s,1C)2.5.用地中海拟无枝酸菌丄S30生物转化18-甲基-9卩，10a-雄甾誦4誦烯-3,17-二酮以实施例2.1所述程序类似的方式，使用10、15或20mg的18-甲基-9p，10a-雄甾-4-烯-3，17-二酮作为浸提物，获得相应的18-甲基-1lp-羟基-9p，10a-雄甾-4-烯-3，17-二酮，收率分别为27、39和36%。13CNMR(126MHz,氯仿誦d):5ppm15.4(q，1C)22.0(t，1C)22.3(q，1C)27.2(t，1C)29.0(t，1C)31.1(d，1C)33.5(t，1C)35.1(t，1C)37.8(t，1C)38.2(s,1C)38.3(t，1C)43.0(d，1C)47.3(s，1C)55.0(d，1C)68.6(d，1C)124.4(d，1C)170.7(s，1C)199.2(s，1C)219.4(s，1C)2.6.用地中海拟无枝酸菌DSM43304生物转化地屈孕酮为了显示其它地中海拟无枝酸菌菌抹也能够将通式(I)的反类固醇类转化成其相应的11-羟基化化合物，用可以公开的培养物保藏机构获得的菌抹重复如实施例2.1所述的发酵。从琼脂板中转移地中海拟无枝酸菌DSM43304菌落，并在500mlErlenmeyer烧瓶中使用100ml营养培养基生长。该培养物在以200rpm和30'C操作的旋转振荡器中孵育。培养2天之后，将15mg的地屈孕酮(为20mg/ml的DMSO溶液)加至该培养基中。如上所述将所得溶液在30。C和200rpm下孵育46-50小时，以促进地屈孕酮羟基化。然后，将该培养基离心(20min，17，000xg)。将等份样的上清液通过HPLC分析。然后，将该上清液用^体积的乙酸乙酯萃取两次并添加固体NaCl。合并有机相，用NaS04干燥，再如上所述通过HPLC分析。两个独立的试验产生约5.7mg的需要的ll-OH-地屈孕酮(收率36%，未作任何优兆)。.3.从细菌培养基中分离lip-OH地屈孕酮地屈孕酮在221、8.81和8.81中的三个单独发酵反应如实施例2.2所述进行。总共，将5.88g地屈孕酮加至营养培养基中。发酵反应结束之后(约47小时后)，将含有需要的lip-羟基地屈孕酮的培养基立即通过微孔过滤(膜的孔径为0.2-0.3jum)纯化。通过HPLC分析，测定三个发酵批次中lip-OH地屈孕酮的收率为约28-64%,最低值来自异常低表现的发酵批次。将三个批次获得的滤液(=上清液)合并，得到37.91的上清液物质，其中含有约0.07mg/ml的llp-OH地屈孕酮。3.1.在半极性聚丙烯酸酯吸附树脂上发酵上清液的类固醇内含物的吸附将高27cm、直径6.5cm的柱子填充1000ml在水中溶胀的半极性聚丙烯酸酯吸附树脂(-AmberliteXAD-7HPTM，Rohm和Haas生产)。将该柱子通过4柱床体积(BV)的99%乙醇和5BV的水平衡。在室温下以约110ml/min(-大约6.5BV/小时)的流速将37.9升发酵上清液(对于干物质含量(-DM)以及11-羟基-地屈孕酮、9-羟基-地屈孕酮和地屈孕酮的含量也是通过HPLC方法测定的)通过该柱子。发酵溶液的类固醇内含物完全吸附在该半极性吸附树脂柱上。尿流出物的类固醇内含物是通过HPLC测定的，并且证明该流出物实质上无类固醇。丢弃底部产物。3.2.栽荷的吸附树脂柱的碱洗涤将载荷类固醇的吸附树脂柱用51的pH值约为14的2%氢氧化钠水溶^t洗涤。为此目的，该碱洗涂水以90-95ml/min.(-大约5.5-5.7BV/小时)的流速通过该柱子。在该洗涤液体流出物中不同反类固醇类的含量通过HPLC分析。分析显示，低于1%的载荷在该柱子上的总类固醇类在该洗涤期间被洗涤出来。3.3.栽荷的吸附树脂柱的中间洗涤将洗涤的和栽荷类固醇的吸附树脂柱用51水洗涤。为此目的，将该水以95ml/min.(-大约5.7BV/小时)的流速通过该柱子。在该洗涤液体流出物中不同反类固醇类的含量通过HPLC分析。分析显示，几乎没有栽荷在该柱子上的总类固醇类在该中间洗涤期间被洗涤出来。3.4.缀合雌激素从洗涤的吸附树脂柱中的解吸在室温下以大约95ml/min的流速使61洗脱液体(99%乙醇)通过柱子。洗脱出的洗脱物以6个级分收集。各级分约1000ml(-大约1BV)。在级分中各个反类固醇类的含量通过HPLC分析。吸附在柱上的lip-OH地屈孕酮的总i:的约92%包含于级分2和3中。任选地，在溶剂内含物被蒸出后，剩余级分可返回到方法步骤b)。由HPLC测定的干物质的含量(％重量)以及11-羟基-地屈孕酮、9-羟基-地屈孕酮和地屈孕酮的各自含量给于以下表3(在下一页)中。3.5.吸附树脂柱的再生为了再生柱子，将其用51(-5BV)水洗涤。该柱可装填和再生多次，例如至多40次。表3:吸附色谱法的分析<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>*与起始量5.88g的地屈孕酮(-18.8mmol)相比较**计算的3.6.进一步后处理洗脱物级分将洗脱物级分1至4(El=970.95g、E2-813.82g、E3=764.80g、E4-765.35g)混合，再通过在60。C下蒸发从3314.92g(DM-0.26。/o)减少到355.12g。从所得混悬液中沉淀类固醇(上清液的DM=2.0%)，并通过抽滤分离(收率约2.2g干燥的沉淀物)。从该剩余的上清液中，通过蒸发将量进一步减少到50.0g可获得第二沉淀物。将合并的沉淀物(约4g)通过急骤色谗法(洗脱剂乙酸乙酯环己烷2:1变化到纯乙酸乙酯)进一步纯化。最初沉淀物中含有的杂质可鉴别为9-羟基-地屈孕酮。最.后，获得2.15g的ll-羟基-地屈孕酮(总收率35%)。13CNMR(101MHz，氯仿-d):Sppm14.7(q，1C)21.7(q，1C)22.6(t，1C)24.8(t，1C)31.2(q，1C)33.7(t，1C)35.2(d，2C)35.7(s,1C)43.4(s，1C)46.2(t，1C)49.7(d，1C)49.9(d，1C)63.6(d，1C)67.6(d，1C)124.2(d，1C)126.9(d,1C)140.2(d，1C)162.2(s，1C)199.1(s，1C)208.6(s，1C)NMR(400MHz，氯仿-d):5ppm0.9(s，3H)1.2(s，3H)1.4-1.5(m，1H)1.7-2.0(m，6H)2.2(s，3H)2.2-2.3(m，1H)2.3-2.4(m,2H)2.4-2.6(m，3H)2.7(ddd，J=12.0，5.8，5.6Hz，1H)4.4画4.5(m，1H)5.7-5.7(m，1H)6.2-6.2(m，2H)描述上述说明和实施例仅用于说明而不是限制本发明。由于对于本领域技术人员来说，可以进行对结合本发明精神和实质的所述实施方案的修改，本发明应被宽泛地解释为包括落入所附权利要求及其同等方案范围内的所有变型。引用的文献BE577,615BE652,597EP0028309EP0152138Bl(=US4,601,855)EP0558119Bl(=US5,304,291)GB1,111,320HalkesSJ，HartogJ，MorsinkL,deWachterAM.(1972)"Investigationsonsterols.38.Synthesisofl，2-methylene-17a-acetoxy-9p，10a-pregnanes，aclassofpotentprogestationalagents"JournalofMedicinalChemistry,15(12):1288國92HalkesSJ&VanMoorselaarR(1969)"InvestigationsonSterolsXXXIV:Synthesisof18画methyl-9p，10a画androstanes，，RecueildesTravauxChimiquesdesPays-Bas,1969,88(7):752-765HartogJ，WittelaarJI，MorsinkL，deWachterAM(1972)"Investigationsonsterols.39.Synthesisandprogestationalactivitiesofsome16-methylenG—17ot-acetoxy-9p，10a-pregna-4，G-dkne-3，20-dionederivatives"JMedChem.1972Dec;15(12):1292-7Lechevalier，M.P.，Prauser，H.，Labeda，D.P.，andRuan，J.S.(1986)"Twonewgeneraofnocardioformactinomycetes:Amycolatagen.nov.andAmycolatopsisgen.nov."Int.J.Syst.Bacteriol.36:29-37.Margalith，P.，andBeretta,G.(1960)"Rifamycin.IX.Taxo誦nomicstudyonStreptomycesmediterraneisp.nov."Mycopathol.Appl.13:321-330.SaucyG,ElsH，MikeschF，FtirstA(1966)tber9P，10a-Steroide:Strukturaufkl3rungvonmikrobiologischenUmsetzungsproduktenmitSauerstoff-FunktioninStellung11"HelvChimActa49(5):1529-1542.US3,304,314US3,555,053US3,937,700US4,353,985US4,588,683US6，046，023vanderSijdeD,deFlinesJ，vanderWaardWF(1966)"Microbialtransformationof9p，10a-Steroids:III.11-Hydroxylationandsidechaindegradationof9P，10a-Steroids，，RecueildesTravauxChimiquesdesPays-Bas，85:721-730.VanMoorselaarR.&HalkesSJ(1969)"InvestigationsonSterolsXXXIII:Synthesisof18-alkyl-9|3，10a-pregnanederivatives"RecueildesTravauxChimiquesdesPays-Bas,88(7):737-51WesterhofP.&HartogJ.(1965)"InvestigationsonSterolsXXIX:Synthesisandpropertiesofsome6，7-dehydro-9p，10a-steroids，，RecueildesTravauxChimiquesdesPays-Bas，84(7):918漏31WesterhofP.，HartogJ.&HalkesSJ(1965)"InvestigationsonSterolsXXVI:Synthesisandpropertiesof6-substituted9|3,10a-steroids"RecueildesTravauxChimiquesdesPays-Bas，84:863-884.WO98/08526Zakelj-MavricM,PlemenitasA，KomelR,BelieI.(1990)"11beta-hydroxylationofsteroidsbyCochlioboluslunatus."JSteroidBiochem.35(5):627-9.<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>关于用于专利程序的微生物保藏的DSMZ国际承认的布达佩斯条约SE8:,"uiJZellkulKirenGmbH一国际表格索尔瓦药物有限公司德国，汉诺威30173在原始保藏情况下的收条，由本页下面所示的国际保藏单位根据第7.1款发给<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>1当适用第6.4(d)款时，该日期是取得国际保藏单位资格的曰期DSMZ-BP/4表格(单页)12/200权利要求1、地中海拟无枝酸菌物种的细菌微生物用于将通式(I)的9β，10α-类固醇类化合物转化成其相应的11β-羟基类似物的用途，其中R1和R4一起形成氧，或者R4是β-乙酰基基团，且R1选自氢、-OH、-O-(C1-C4)烷基和-O-CO-(C1-C4)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。2、根据权利要求1的用途，其中所迷的地中海拟无枝酸菌物种的细菌微生物是选自LS30、DSM43304、DSM40773和DSM46096的菌抹。3、根据权利要求2的用途，其中所述的菌林是以DSM17416保藏的地中海拟无枝酸菌LS30。4、以DSM17416保藏的地中海拟无枝酸菌LS30菌林。5、体外将通式(I)的外，10a-类固醇类化合物微生物转化成其相应lip-羟基类似物的方法，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R1和R4—起形成氧，或者R4是P-乙酰基基团，且Rl选自氩、-OH、-O-(C广Q)烷基和-O-CO-(C广C4)烷基，以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基；该方法包括在发酵培养基中将式(I)的化合物与能够进行式(I)化合物向其相应的llp-鞋基类似物转化的地中海拟无枝酸菌物种的细菌成6、根据权利要求5的微生物体外转化的方法，其中所述的9卩，10a-类固醇类化合物具有通式(II)其中Rl选自氢、—OH、-O-(C广C4)垸基和-0-CO-(C广C4)垸基；以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚曱基。7、根据权利要求6的微生物体外转化的方法，其中所述的9(5，10a-类固醇类化合物具有通式(III)员接触。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中Rl是氢或-O-(d-Q)烷基；以及R2和R3都是氢，或者一起形成亚甲基。8、根据权利要求5至7任一项的方法，其中所述的地中海拟无枝酸菌物种的成员是选自LS30、DSM43304、DSM40773和DSM46096的菌抹。9、根据权利要求8的方法，其中所述的菌抹是以DSM17416保藏的地中海拟无枝酸菌LS30。10、根据权利要求5至9任一项的方法，其中至少所述发酵的转化过程是在需氧条件下进行的，优选所述发酵培养基的相对02饱和p02/p02max为约5%至约95%,优选约20%至约80%，更优选约30%至约75%,并且最优选约40%至约70%。11、根据权利要求5至10任一项的方法，其中当通过向所述培养基中添加9p，10a-类固醇类化合物开始所述转化时，所述的地中海拟无枝酸菌细菌处于其指数生长期的中期或后期。12、根据权利要求5至11任一项的方法，其中以约50mg/l至约500mg/l的量，优选约100mg/l至约250mg/l发酵培养基，并且最优选以约150mg/l发酵培养基的量加入所述的9p，10a-类固醇类化合物。13、根据权利要求12的方法，其中在所述转化过程开始时，或者在转化过程开始时的1至5小时期间一次性加入所述全部量的9卩，10a-类固醇类化合物。14、根据权利要求12的方法，其中在完全转化期间向所述的发酵培养基中连续添加所述量的9p，10a-类固醇类化合物。15、根据权利要求14的方法，其中以1至20mg/小时培养/升发酵培养基的浓度，优选以2至5mg/小时培养/升发酵培养基的浓度加入所述的9p，10a-类固醇类化合物。16、根据权利要求5至15任一项的方法，其中通过包括以下步骤的方法从发酵培养基中分离所述的llp-羟基类似物a)从发酵培养基获得上清液，该发酵培养基任选无任何细菌细胞、细菌碎片、粘液物质和固体，b)将上清液物质与足以吸附所述上清液物质中所含的lip-羟基类似物的量的非离子型半极性聚合物吸附树脂接触，由此获得栽荷有lip-羟基类似物的非离子型半极性聚合物吸附树脂，其后将该栽荷的吸附树脂与其余的上清液物质分离，所述上清液物质选自步骤a)中所获得的上清液、通过减少所述上清液体积所形成的浓缩物和通过膜过滤所述上清液所得到的截留物质；c)将该载荷的吸附树脂用pH值为至少12.0，优选12.5至14的碱性含水洗涤液体洗涤；d)任选进行中间洗,步骤，其中用水洗涤所述栽荷的吸附树脂；以及e)将经过洗涤的吸附树脂与足以脱附其上的lip-羟基类似物的量的洗出液体接触，该洗出液体含有至少一种水可混溶的有机溶剂，其选自水可混溶的醚、低级链烷醇和低级脂肪族酮或任选呈碱性的水和至少一种选自水可混溶的醚、低级链烷醇和低级脂肪族酮的水可混溶的有机溶剂的混合物，以及f)将含有lip-羟基类似物的洗出液从吸附树脂中分离出来，并任选通过减少体积将该洗出液浓缩。17、根据权利要求16的方法，其中所述的非离子型半极性聚合物吸附树脂是大孔聚羧酸,酯树脂，优选交联脂肪族聚羧酸酯树脂，并且更优选具有大网络结构^交联聚羧酸酯树脂。18、根据权利要求16或17的方法，其中在步骤e)中所述的洗脱液体包含乙醇。19、通式(V)的1lp-羟基-9p，10a-类固醇类化合物其中a)Rl选自氩、—OH、—O-(C广Q)烷基和-O-CO-(C广C0烷基，以及R2和R3—起形成亚曱基，或者b)Rl选自-O-(d-C4)烷基和-0-CO-(Ci-C4)烷基，以及R2和R3均表示氢；爲者c)Rl是-OH,R2和R3均表示氩，以及该化合物是4,6-二烯。20、根据权利要求19的11p-羟基-9p，10a-类固醇类化合物，其中所述化合物选自由如下化合物组成的组1lp-羟基-l，2-亚甲基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-lip-羟基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-llp-羟基-l，2-亚甲基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，1lP-17a-二羟基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，11P-17a-二羟基-l，2-亚曱基-9p，10a-孕-4，6-二烯-3，20-二酮，1lp-羟基-l，2-亚曱基，9卩，10a-孕-4-烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-lip-羟基-9p，10a-孕-4-烯-3，20-二酮，17a-乙氧基-lip-羟基-l，2-亚甲基-9卩，10a-孕-4-烯-3，20-二酮，以及1lp-17a-二羟基-l，2-亚甲基-9卩，10a-孕-4-烯-3，20-二酮。全文摘要本发明涉及地中海拟无枝酸菌物种的菌株用于将通式(I)的9β，10α-类固醇类微生物转化成其相应的11β-羟基类似物的用途，以及涉及该物种的特定菌株。另外，本发明涉及将9β，10α-类固醇类转化成其相应的11β-羟基衍生物的方法，该方法使用地中海拟无枝酸菌物种的菌株，并且涉及后续从细菌培养基中分离11β-羟基衍生物。所得到的11β-羟基化产物是制备具有9β，10α-构象的新型类固醇类化合物的有用的中间体，该类固醇类化合物在11β-位置上具有不同种类的取代基。文档编号C07J7/00GK101360832SQ200780001651公开日2009年2月4日申请日期2007年1月16日优先权日2006年1月18日发明者H-H·拉斯奇,H-H·索尔,J·哈卡拉,J·梅辛格,M·施密特申请人:索尔瓦药物有限公司