禽流感疫苗的制作方法

专利名称：：禽流感疫苗的制作方法禽流感疫苗相关申请本申请要求以下申请的权益2006年10月10日提交的美国临时申请第601850,761号、2006年11月20日提交的美国临时申请第601860,301号、2007年3月30日提交的美国临时申请第601920,874号和2007年4月2日提交的美国临时申请第601921,669号，全部文献因而〉开地通过引用的方式完整并入。发明领域本发明涉及免疫原性组合物和用作抗禽流感病毒疫苗的方法。相关技术的描述流感病毒从动物适应于人的能力由几种病毒基因产物决定(见Parrish,C.R.等2005微生物学年评《AnnuRevMicvobiol》中综述)。它们当中，病毒血凝素(HA)尤其令人感兴趣；它结合至呼吸道中影响传播的特定唾液酸(SA)受体(Parrish,C.R.等2005微生物学年评《AnnuRevMicvobiol》59:553;Bean,W丄等1992病毒学杂志(JVirol)66:1129;Vine、A.等1998病毒学杂志(JVirol)72:7626)。与此同时，它影响作为免疫保护主要决定因素的中和抗体的敏感性(Subbarao，K.等200620免疫学《Immunity》24:5;B.R.Murphy和R.G.Webster,费氏病毒学《FieldsVirology》.D.M.Knipe等编辑(Lippincott，Philadelphia,第3版，1996)，第1403页)。发明简述提供了因突变而适应于人的H5血凝素(HA)多肽和相关多核苷酸、方法、组合物和疫苗，其中所述的突变改变H1血清型的受体特异性。本发明的实施方式涉及分离或重组的血凝素(HA)多肽，所述多肽选自由以下项所组成的组中(a)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列编码的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度严格性条件下与编码(a)、(b)或(c)的多核芬S交序列的基本上全长杂交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含与所述(a)、(b)或(c)中连续的至少约350个氨基酸、与至少约400个氨基酸、与至少约450个氨基酸或与至少约500个氨基酸基本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y或V,优选地是A，并任选包含T192除T之外的氨基酸的又一个突变，其中所述氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V,优选地是I。本发明的另一个实施方式涉及分离或重组的血凝素(HA)多肽，所述多肽选自由以下项所组成的组中(a)具有SEQIDNO:2的氨基S臾序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核香酸序列编码的多肽，其中所述的多核苦Si^列在高度严格性条件下与编码(a)、(b)或(c)的多核苦酸序列的基本上全长杂交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含与所述(a)、(b)或(c)中连续的至少约350个氨基酸、连续的至少约400个氨基酸、连续的至少约450个氨基酸或连续的至少约500个氨基S緣本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含K/R除K或R之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸即是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y或V,优选地是S、A、T或N，并包含由以下项所组成的组中的至少一种突变S136除S之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸即是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V，优选地是T;E190除E之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V，优选是D、N,或G;L194除L之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、优选是I或F;R216除R之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、优选是E;S221除S之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、优选是P;K222除K之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、M、F、P、S、T、W、Y，或V、优选是W;G225除G之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V、优选是D或N;Q226除Q之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、优选是R或L;S227氨基酸除S之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y，或V、优选是A、H、P、E，或N;以及G228除G之外的氨基酸的突变，其中所述的氨基酸是A、R、N、D、C、E、Q、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y,或V、优选是S。本发明的其它实施方式涉及包含与前述血凝素多肽具有至少95%序列同一性的序列的多肽、其免疫原性片段、其组合物、其免疫原性组合物、修饰其裂解位点、修饰替代跨膜结构域的前述血凝素多肽的外部三聚区的羧基末端、编码前述血凝素多肽的多核苷酸序列、载体、产生方法、使用方法、对其特异的抗体和抗体9B11、IODIO、9E8及11H12。图1.曱型流感病毒粒子的结构示意图。图2.流感病毒A血凝素蛋白的图示。图3.曱型流感病毒(A/泰国/l(KAN-l)/2004(H5N1))血凝素(HA);GenBank登录号AY555150;野i型；多肽序列是SEQIDNO:2;并且多核苷酸序列是SEQIDNO:1。图4.血凝素突变的结构和遗传基础。A)显示可选性病毒血凝素的RBD。B)130主环和220主环和190螺旋内氨基酸序列的比较。图5.HANA假型慢病毒载体的功能性活性野生型和突变H5血凝素的等效表达、具有a2,3和a2,6SA特异新凝集素的293A细胞的反应性、除神经氨酸酶之外还含有野生型或突变HA的假型病毒介导进入的能力。(A)使用流式细胞术，在转染的293T细胞中显示野生型或所述突变流感病毒H5MHA的表达(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶学方法《MethodsEnzymol》138:162);免疫前对照(灰色)或抗H5(黑色)。(B)293A细胞如所示与生物素化标记MAA或SNA—起孵育，由流式细胞术分析。(C)在如实施例1中所述制备除NA之外以所示HA野生型(WT)或突变型变体假型化的慢病毒载体后，利用萤光素酶测定法测量，分析了由H5(KAN-1)及其衍生物介导的进入的效率。对应于所述突变体的表达水平是对照，4.78x10、WT,3.16xlO8;Q226L,G228、3.79xlO8;E190D,1.55x107;K193、3.78xlO8;G225D,2.97xl08;E190D,K193、4.51x108;E190D，G225D,8.3x168;K193S,G225D,4.03x108;E190D,K193S，G225D，3.05x108。图6.与随同NA—起共表达的野生型KAN-201H5相比，三重突变体H5的变异特异性。在随同NA共表达后纯化的(A)野生型或(B)三重突变体HA的聚糖微阵列分析通过先前技术(Steven、J.等2006自然-微生物学综述《NatRevMicrobiol》4:857)的改良(实施例1)进行，由CoreH,功能基因组协会，Emory大学实施。具有相关系的聚糖通过编号进行分组选择糖蛋白(1-6),主要是2，3-唾液酸糖香(7-44),2,6-唾液酸糖苷(45-60),2,8配体(61-67)或其它(68-84)，如前所示(表8)。图7.突变H5N1假病毒的变异中和敏感性。(A)对转染的293T细胞中随NA共表达的HA的结合由流式细胞术以所示mAb(黑色)或同种型对照IgG(灰色)测定。(B)中和敏感性用所示mAb评价。(C)显示了所示野生型和突变HA对这些mAb(400ng/ml)的中和敏感性。(D)展示了野生型以及S137A、T1921突变体对mAb9E8和11H12的中和敏感性。图8.H5(Kan画l)(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序列(SEQIDNO:8)、DNA序列(SEQIDNO:26)。图9.H5(Kan-l)(mut.A)(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序列(SEQIDNO:9)、DNA序列(SEQIDNO:27)。图10.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(折叠子)(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序列(SEQIDNO:10)、DNA序列(SEQIDNO:28)。图11.H5印度尼西亚(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序刮(SEQIDNO:11)、DNA序列(SEQIDNO:29)。图12.H5印度尼西亚(mutA)(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序列(SEQIDNO:12)、DNA序列(SEQIDNO:30)。图13.H5(印度尼西亚)(mut.A)(短)/Foldon(E190D/K193S/G225D)。蛋白质序列(SEQIDNO:13)、DNA序列(SEQIDNO:31)。图14.VRC9151(SEQIDNO:14)。图15.VRC9152(SEQIDNO:15)。图16.VRC9153(SEQIDNO:16)。图17.H5(Kan-l)(S137A)。蛋白质序歹'J(SEQIDNO:17)、DNA序列(SEQIDNO:32)。图18.H5(Kan曙l)(mut.A)(S137A)。蛋白质序列(SEQIDNO:18)、DNA序列(SEQIDNO:33)。图19.H5(Kan-l)(mut.A)(短)/Foldon(S137A)。蛋白质序列(SEQIDNO:19)、DNA序列(SEQIDNO:34)。图20.H5(Kan-l)(T1921)。蛋白质序列(SEQIDNO:20)、DNA序列(SEQIDNO:35)。图21.H5(Kan-l)(mut.A)(T192I)。蛋白质序列(SEQIDNO:21)、DNA序列(SEQIDNO:36)。图22.H5(Kan-l)(mut.A)01)/Foldon(T192I)。蛋白质序歹寸(SEQIDNO:22)、DNA序列(SEQIDNO:37)。图23.H5(Kan-l)(S137A/T192I)。蛋白质序列(SEQIDNO:23)、DNA序列(SEQIDNO:38)。图24.H5(Kan-l)(mut.A)(S137A/T192I)。蛋白质序列(SEQIDNO:24)、DNA序列(SEQIDNO:39)。图25.H5(Kan-l)(mut,A)(短)IFoldon(S137A/T192I)。蛋白质序列(SEQIDNO:25)、DNA序列(SEQIDNO:40)。图26.曱型流感病毒(A/印度尼西亚/5/05(H5Nl))血凝素(HA);GenBank登录号ISDN125873;野生型；多肽序列是SEQIDNO:82;并且多核苷酸序列是SEQIDNO:81。图27.曱型流感病毒(A/Anhui/1/2005(H5N1))血凝素(HA);GenBank登录号ABD28180;野生型；多肽序列是SEQIDNO:84;并且多核苷#列是SEQIDNO:83。以下生物材料已经根据布达佩斯条约条款在所示日期保藏于弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(ATCC):<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>生物材料10D10的保藏D10小鼠B细胞杂交瘤在2006年10月10日作为ATCC登录号PTA-7916保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209,马纳萨斯，Blvd大学,10801,美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的条款产生。这确保维持此保藏物有活力的培养物自保藏日期起持续30年。ATCC将根据布达佩斯条约的条款使该保藏物可获得并且该保藏物遵循申请人与ATCC之间的合同，其中所述的合同确保在相关的美国专利发布时或在任何美国申请或外国申请对公众公开时，无论谁在先，公众可永久且不受限制地获得该保藏物的培养物的子代，并且确保由美国专利商标局委员根据35USC§122和根据其的行政规章(Commissioner'srulespursuantthereto)(包括375CFR§1.14)决定对其授权的个人可获得所述利法授予的权力相抵触地许可实施本发明。生物材料9B11的保藏9B11小鼠B细胞杂交瘤在2007年4月2日作为ATCC登录号PTA-8306保藏于美国弗吉尼亚州20110-2209,马纳萨斯，Blvd大学，10801,美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所述保藏物根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(布达佩斯条约)的条款产生。这确保维持此保藏物有活力的培养物自保藏日期起持续30年。ATCC将根据布达佩斯条约的条款使该保藏物可获得并且该保藏物遵循申请人与ATCC之间的合同，其中所述的合同确保在相关的美国专利发布时或在任何美国申请或外国申请对公众^Hf时，无论谁在先，公众可永久且不受限制地获得该保藏物的培养物的子代，并且确保由美国专利商标局委员根据35USC§122和根据其的行政规章(包括375CFR§1.14)决定对其授权的个人可获得所述子代。所保藏的生物材^h的可获得性不得解释为与任何政府权利机关根据其专利法授予的权力相抵触地许可实施本发明。含有CDR和FR区的9E8抗体序列I.人源化序列蛋白质序列人源化9E8重链V区FR1:VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG(SEQIDNO:41)FR2:WVRQAPGQGLEWMGW(SEQIDNO:42)FR3:TMTADTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR(SEQIDNO:43)FR4:WGQGTMVTVSS(SEQIDNO:44)CDR1:YIFSEYIIN(SEQIDNO:45)CDR2:FYPGSGSVKYNEKFNDKA(SEQIDNO:46)CDR3:HERDGYYVY(SEQIDNO:47)人源化9E8K链V区FR1:EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAS(SEQIDNO:48)FR2:MHWYQQKPGQAPRLLIY(SEQIDNO:49)FR3:NLETGIPARFSGSGSGTDFTLTIDPLEAEDVATYYC(SEQIDNO:50)FR4:FGQGTKVEIK(SEQIDNO:51)CDRl:ESVDSFGNSF(SEQIDNO:52)CDR2:LAS(SEQIDNO:53)CDR3:QQNNEDPYT(SEQIDNO:54)人源化9E8重链(SEQIDNO:55)mdwtwrilflvaaatgahsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgyifseyiinwvrqa卿glewmgwfypgsgsvkynekfndkatmtadtsistaymelsrlrsddtavyycarherdgyyvywgqgtmvtvssastlcgpsv^lapsskstsggtaaigclvkdyQ>epvtvswnsgaHsgvhtfpavlqssg1yslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsMkvdkkvepkscdkthtcppcpapelggpsvf!fppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhq(lwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqi)i-q)qvytlpi)srdeltknqvsItclvI、'gfypsHave、vesngqpennykttpp、'kls(lgsfflyskltv他snvqqgm'ftcs、TiiheaHmiiytql"'Msi)gk人源化9E8轻链(SEQIDNO:56)me，qllfHllwipclrtgeivltqspatlskpgeraUscrasesvds%isfiiihwyqq.kpgqaprlUylasnletgiparfsgsgsgtdftltidp〗eaedvatyycqqnnedpytfgqgtkvdkrtva汰psvfifppsdeqHcsgtasvvdlimfypreakvqw]cvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsst!tlskadyekhkvyacevth(jglsspvtksfhrgecDNA序列人源化9E8重链(SEQIDNO:57)atggattggacatggagaatcctgt〖cctggtggctgctgctocag伊gctcatagccaggtgcagctggigcagagcggagctgaagtgaagaagcctggagctegcgtgaaggtgtcctgtaaggcctccggatacatcttcagcgagtacatcatcaactgggtgagacaggctcctggacagggactggaatggatgggatggttctoccctggaagcggaagcgtgaagtacaacgagaagttcaacgacaaggctacaatgacagctgacacaagcatctocacagcttacatggaactgtccagactgagaagcgatgatacagctgtgtactactgtgccagacacgaaagagacggatactacgtgtactggggacagggaacaatggtgaccgtgtcctccgcctcc线ceaagggcccatcggtettccccctggcaGCCtectccaag3gcacctot卿ggcac3gcggccctgggctgcctggtca鄉actacttccccg抑cc敏gaeggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccgg卿cctacagtcctcaggactctactcccte3gcagcgtggtgacc狗ccctceagcagcttgggcaccc3g3cctacatctgcaacgtgaatc3caagcccagc3acacc的ggtggacaagaaagttgagcccaaatettgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcUccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccct'gaggtcaagtteaactggtacgtggacggcgtggaggtgca〖aatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacglaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctocaacaaagccctcccagcccccatcgag3aaaccatctccsia3gcca3agggcagccccgaga3ccac鄉tgtacaccctgcccccatcccgggatgagc〖gaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgcfcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgca伊，gcctctcccfgtctccgggt嫌言ga人源化9E8轻链(SEQIDNO:58)AtggaagcccctgctcagctcctgUtctgcl,gctgctgtggctgcctgatacaacaggagaaatcgtgctgacacagagccctgccacact鹏cclgagccctggagaaagagccacactgagctgcaga忌cctcc,agcgtggattccttcggaaacagcttcatgcactggtaccagcag餘gcctggacaggcceccagactgctgatctacctggcctecaacctggaaacaggaatccc〖gccagattttccgg抑gcggMgcgg幼cag池tcacactgac组cgaccctctggaagctgaagatgtggctacMactectgtcagcaga織acgaagatccttacacatttggacagggaacaaaggtggagatcaagagaacagtggccgccccttccgtgttcatcttccctccttecgacgaacagctgaaaagcggaacagccagcgtggtgtgtctgctgaacaacttctaccccagagaagccaaagtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcgga朋oigccaggaaagcgtgacagagcaggattccaaggattcaicatecagcctgagcagcacadgacactgtc'omggccgactacgaga3gcaccmggt.gtacgcctgcgaagtgacacaccagggactgtcctcccctgtgaII.小鼠序列蛋白质序列小鼠抗H5(Kan-l)单克隆抗体，9E8VH(SEQIDNO:59):mgwswiflfllsvtagvhskvqqqsgaelvkpgasvklsckasgyifs巧iinwvkqksgcjg化wiawfypgsgsvkynekfndkatlsadtssrrtvymdirvtsedsavyjfcarherdgyyvywgqgttltvss小鼠抗H5(Kan-l)单克隆抗体，9E8VL(SEQJDNO:60):sgsgsrtdftltidpveaddvatyycqqnnedpytfgggtkleikDNA序列小鼠抗H5(Kan-l)单克隆抗体，9E8VH(SEQIDNO:61):atgggatggagctggatctttctcttcctcctgtcagtaactgcaggtgtccactccaaggtccagctgcaacagtctggagctgagct:ggtgaaaeccggggcttcagl'gaagctgtcctgcaaggcttctggctacatcttcagtgaatatattataaattgggtpaagcagaaatctggacagggtcttgagtggattgcgtggttttaecctggaagtggtagtgtaaagtacaatgagaaattcaacgacaaggccacattgagtgcggacacgtcctccaacacagtctatatggagcttattagagtgacatctgaagactctgcggtctatttctgtgcaagacacga3鄉gMggttactecgtetoctggggccii郷cacc3ctctcEic3gtctcctca小鼠抗H5(Kan-l)单克隆抗体，9E8VL(SEQIDNO:62):atggagacagacacactcctgctatgggtgetgctgclctgggttccaggt袭ccacaggtaacattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctaggacagagggccaccatatcctgcagaaccagtgaaagtgttgatagttttggcaatagttttetgcactggtaccagcagaaaecaggacagccacccaaactcctcatctotctfgcatecaficctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagt卿tct鄉acagacttcaccctcaccattgatcctgtgg鄉ctgatgatgttgcaacctattactgtcagcaaaataatgaagatccgtacacgttcg賊鹏绍gace鄉etg:g細taaaa含有CDR和FR区的11H12抗体序列蛋白质序列鼠类11H12重链V区FRl:VQLQQSGAVLMKPGASVKISCKATG(SEQIDNO:63)FR2:WVKQRPGHGLEWIG(SEQIDNO:64)FR3:AFTADTSSNTANIQLTSLTSEDSAVYYCAR(SEQIDNO:65)FR4:WGAGTTVTVSS(SEQIDNO:66)CDR1:YTFSSYWIE(SEQIDNO:67)CDR2:EILPGSGSINYNEIFKDKA(SEQIDNO:68)CDR3:GGYGYDPLYWSFDV(SEQIDNO:69)鼠类11H12K《连V区FRl:DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRAS(SEQIDNO:70)FR2:IHWYQQRTNGSPRLLIQ(SEQIDNO:71)FR3:ESISGIPSRFSGSGSGTNFTLTINSVESEDIADYYC(SEQIDNO:72)FR4:FGGGTKLEIK(SEQIDNO:73),CDR1:QSIGTN(SEQIDNO:74)CDR2:SAS(SEQIDNO:75)CDR3:QLTNTWPMT(SEQIDNO:76)11H12重链(SEQIDNO:77):mgwswiflfUsvtagvhsqvqlqqsgavlmkpgasvkisckatgytfssywiewkqi'pghglewigeUpgsgsiiiyneifkfJkaaftadtssntaiiiqltsltsedsavyycarggygydplywsfdvwgagttvtvssalcttppsvypIapgsaaqtnsOTVtlgdvfc-epvtvtwiisgsksgvhtfpavlqsdiytlsssvtvpsstwpsetvtettvfihpasstkvdkfcivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltithpkvlcvw出skddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfhstfrsvsdpimhqdwbgkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkcqmakdkvsltanitdffpe(litvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyiVysklnvqksnweagntfksv!heglhnhhtekslshspgk11H12轻链(SEQIDNO:78):mesqsqvfvfllftvipasrgcMUtqspailsvsi3gervsfecrasqsigtoiliwycicir1iigspriliqsasesisgipsrfsgsgsgtn组tiiw敏edia柳c:qltatMpR询ggtkleikradaaptvg;ifppaseqlts靜,flimfypldirw1wlddg鹏rqngvlnswtdqds]ccIstysinsst:lt!tkdeyCTlinsytceathktstspivksfmTiecDNA序列11H12重链(SEQIDNO:79):atgggatggagcl名galctttctcttcclcctgtcagtaactgctggtgtccactcccaggttcagctgcagCMtctggagdgtactgatgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgcaaggctactggctacacattcagtagctac;tggatagaglgggtgaagcagaggcctggacatggccHgaglgga"ggagagat很acctggaagl.ggtagtattaattacaatgagatcttcaaggacaaggccgeattcactgc3g站織tcctcc職gcc咖3ta,ctc8ccagcctg職tctg鄉3ctctgccgtc敏flctgtgc船ggggaggctatggUacgacccactctactggfcctregatgtccagccaaaacgacacecccatctgtetet(xactggcecclggatcl'gctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgaectggaadct经gttccctgtecagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaat〖gtgcccagggattgtggttgt肌gccttgcat欲gtacagtcccagaagtetcatctgtctteatettecccccaaagccxaaggatgtgctcaca"tactdgactcefaaggto3cgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttc鄉t敏ttgtag8tg卿gg鄉tgcac織gctcagacgcaaccccgggagg绍cagttc油c鄉adttccgcteagtcagtgaacttoceatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggteaacagtgcagctttccctgcccccatcg3ga鄉ccatctecaaaaccggc曰gaccgaa卿tecacaggtgtacaccattccacctecc卿g3gcag购gcc8鄉ataaagtcagtdgaectgeatgataacagacttettcectgaagacattectgtggagtggcagtggaat绍gcagccagcggagaactacaagaaeactcageccatcatggacacagatggctcttocttcgtetacagcaagctcaatgtgcag腿gagcaadgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggaaatga11H12轻链(SEQIDNO:80):atggagtcacagtctcaggtctugtatmtgcmtctggattccagcctccagaggtgacatcttgctgactcagtctccagccatcctgtctgtgagtccaggagaaagagtcagtuctcctgca鹏ccagtcagagcattggcacaaacatacactggtatcagcaaagaacaaatggttctccaaggcttctcatacagtctgcttctgagtctatuctgggatcccgtccaggtttagtggcagtggatcagggacaaattttactctaaccatcaacaglgtggagtctgaagatattgcagattattactgtcaacttactaatacctggccaatgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctc.agtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcetgaacagttggactgateaggac汰gcaaagaeagcacctecagcatgageagcacceteacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctalacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttgatga表l曱型病毒HA序列和质粒构建<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>具体实施例方式流感病毒进入由其刺突蛋白-血凝素(HA)的受体结合结构域(RBD)介导。禽病毒对人的适应性与HA针对a2，6-连接而非a2，3-连接唾液酸(SA)受体的特异性有关。本文中，我们定义了曱型流感病毒亚型H5N1(禽)HA中的如此突变，其通过减少a2,3-或增加a2，6-SA识别作用而改变所述HA对SA的特异性。使用RBD突变体来开发疫苗和中和新变体的单克隆抗体。基于结构对HA特异性的修饰可以指导开发可在人适应性H5N1抹出现之前进行评价的优选疫苗和治疗性单克隆抗体。定义除非另外定义，本文中所用的技术术语和科学术语具有如本发明所述领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。参见例如，SingletonP和SainsburyD.，微生物学与分子生物学词典第三版(DictionarvofMicrobiology和MolecularBiology.3rded.),J.Wiley&Son、奇切斯特(Chichester)，纽约(NewYork)，2001和费氏病毒学第四版(TieldsVirology.4thEd.)编者KnipeD.M.和HowleyP.M.,LippincottWilliams&Wilkin、费城(Philadelphia),PA，2001。过渡态术语"包含"是与"包括"、"含有"或"特征在于"同义的，是包含性或开放的，并且不排除额外的、未提及的要素或方法步骤。过渡态短语"由......组成"排除了未在权利要求中详述的任意要素、步骤或组分，但是不排除与本发明不相关的额外组分或步骤，如通常与本发明相关的杂质。过渡态短语"基本上由……组成"将权利要求的范围限于指定的材料或步骤和这样的材料或步骤，其实际上不影响所要求专利的发明的基本和新颖性特征。如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式"一个(a)"、"一种(an)"和"该(the)"包括复数指称，除非上下文清楚地声明。因此，例如对"一种病毒"的指称包括多种病毒；对一种"宿主细胞"的指称包括宿主细胞的混合物等。术语"核酸"、"多核苦酸"、"多核苷酸序列"和"核S交序列"，才艮据上下文，指单链或双链脱氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物、其嵌合物或类似物，或代表此类对象的字符串。如本文中所用，该术语任选地包括天然存在性核苷酸的类似物的聚合物，所述的聚合物具有天然核苷酸的本质特性，从而它们以类似于天然存在性核苦酸的方式与单链核酸杂交(例如聚酰胺核酸)。除非另外说明，本发明的具体核S吏序列除清楚说明的序列之外任选地包括互补序列。从任意的所述多核苷酸序列，可以确定给定的核酸或互补性多核苷S吏序列(例如互^M亥酉臾)。术语"核酸"或"多核苷酸"也包括单体单元的任意实体串列，所述的串列可以对应于一串核苦酸，包括核苷酸聚合物(例如常见的DNA或RNA聚合物)、PNA、修饰的寡核普酸(例如包含对于溶液中的生物RNA或DNA是不常见的碱基的寡核苦酸，如2'-0-曱基化寡核苷酸)等。核酸例如可以是单t连或双链的。"亚序列，，是全长的任意部分，脂质并且包括整个序列。通常，亚序列包含小于全长的序列。在两种核酸或多肽(例如编码HA分子的DNA或HA分子的氨基酸序列)的上下文中，短语"基本上相同"指两个或更多个序列或亚序列，在为最大对应性进行比较和比对时，如使用序列比较算法或通过目视检查测量，所述序列具有至少约90%、优选91%、最优选92°/。、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、599.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核香酸残基同一性或氨基酸残基同一性。术语"变体"就多肽而言，指相对于参考序列氨因一个或多个氨基酸而改变的氨基酸序列。所述变体可以具有"保守性，，变化，其中置换的氨基酸具有相似的结构或化学属性，例如用异亮氨酸替换亮氨酸。或者，变体可以"非保守性"变化，例如用色氨酸替换甘氨酸。类似的细微变异也可以包括氨基酸缺失或；插入或这两种情况。使用i本领域众所周知的计算机程序例如软件DNASTAR,可以找到决定哪种氨基酸残基可被置换、插入或缺失而不消除生物学活性或免疫学活性的原则。本文中也描述保守性置换的实例。术语"基因"广泛地用来于生物学功能相关的任意核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。术语"基因"适用于特定基因组序列，以及适用于由该基因组序列编码的cDNA或mRNA。基因也包括不表达的核酸节段，其例如形成其它蛋白质的识别序列。不表达的调节序列包括"启动子"和"增强子"，其中调节蛋白如转录因子与所述启动子和增强子结合，从而导致转录相邻或附近的序列。"组织特异性"启动子或增强子是调节特定组织类型或细胞类型中转录的那种启动子或增强子。"基因的表达"或"核酸的表达"通常意指DNA转录成RNA(任选地包括修饰所述RNA，例如剪接)或RNA转录成mRNA、RNA翻译成多肽(可能包括对所述多肽的后续修饰，例如翻译后修饰)或意指转录和翻译，如上下文所示。"开放阅读框"或"ORF'是DNA或RNA(例如基因)中可能翻译的开放阅读框，所述的开放阅读框能够翻译成多肽。也就是说，所述开放阅读框不由终止密码子截断。然而，应当指出术语ORF不必表示所述多核香酸实际上被翻译成多肽。术语"载体"指核酸可以藉此而增殖和/或在生物、细胞或细胞组分之间转移的手段。载体包括自主复制或可以整合至宿主细胞染色体的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是无法自主复制的棵RNA多核苷酸、棵DNA多核苷酸、在同一条链中由DNA和RNA组成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA或其它。在众多但非全部的常见实施方式中，本发明的载体是质粒。"表达载体，，是能够促进整合于其中的核酸表达以及复制的载体，如质粒。通常，待表达的核酸与启动子和/或增强子"可操作地连接(operablylinked)",并且接受所述启动子和/或增强子的转录性调节控制。"双向表达载体"以两个这样的备选启动子为特征，其中所述两个启动子相对于在这两个启动子之间存在的核酸具有对立方向，从而表达可以在两个方向上启动，导致例如正链(+)或有义链RNA和负链(-)或反义链RNA的转录。根据上下文，"氨基S交序列"是氨基酸残基的聚合物(蛋白质、多肽等。)或代表tt酸聚合物的字符串。"多肽"是包含两个或更多个氨基酸残基的聚合物(例如多肽或蛋白质)。所述聚合物可以任选地包含修饰，如糖基化或其它等。所述多肽的氨基酸残基可以是天然或非天然的并且可以是非取代的、非修饰的、取代的或修饰的。在本发明的上下文中，术语"分离"指这样的生物材冲牛，如病毒、核酸或蛋白质，所述生物材料基本上没有在其天然存在环境中通常与之相伴或相互作用的组分。分离的生物材料任选地包含在其天然环境中找不到伴随所述生物材料的额外材料，例如细胞或野生型病毒。例如，若所述材料处于其天然环境如细胞中，则该材料可以位于该细胞中的如此位置(例如基因组或遗传元件)内，其中所述的位置对在此环境中存在的此材料而言不是天生的。例如，天然存在性核酸(例如编码序列、启动子、增强子等)变成分离的，若此核酸通过非天然存在性工具(例如载体，如质粒或病毒载体或扩增子)导入基因组中对于该核酸而言是非天生的基因座。此类核酸也称作'异源性"核酸。分离的病毒例如处在并非是野生型病毒天然环境(例如感染个体的肠道或呼吸道)的环境中(例如细胞培养系统或从细胞培养中纯化)。术语"重组"表示所述材料(例如核酸或蛋白质)已经因人工干预而受到人工或合成(非天性)改变。所述改变可以对位于其天然环境或状态下或从其中取出的材料进行。具体而言，例如当通过表达重组核酸产生流感病毒时，该流感病毒是重组的。例如，"重组核酸，，是通过(例如克隆期间)使核酸重组或其它方法，或通过化学诱变法或其它诱变法所产生的核酸；并且"重组多肽"或"重组蛋白，，是通过表达重组核酸而产生的多肽或蛋白质。当指异源性或分离的核酸时，术语"导入"指将核酸并入真核细胞或原核细胞，其中所述核酸可以并入该细胞的基因组(例如染色体、质粒或线粒体DNA)、转化成自主复制子或瞬时表达(例如转染的mRNA)。该术语包括此类方法如"转染"、"转化"和"转导""。在本发明的上下文中，可以使用多种方法将核酸导入细胞，所述方法包括电穿孔法、磷酸钙沉淀法、脂质介导转染法(lipofection)等。术语"宿主细胞"意指含有异源性核酸如载体或病毒并支持所述核酸复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物、禽类或哺乳动物细胞，包括人细胞。示例性宿主细胞可以包括例如Vero(非洲绿猴肾细胞)细胞、BHK(乳仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、Madin画Darby犬肾(MDCK)细胞、Madin画Darby牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如293T细胞)和COS细胞(例如COSl、COS7细胞)等。流感病毒的"免疫学有效量"是足以增强个体(例如人)在暴露于流感病毒后自身免疫应答的量。诱导免疫的水平可以通过测量中和性分泌抗体和/或血清抗体的量，例如通过蚀斑中和测定法、补体结合测定法、酶联免疫吸附测定法或微量中和测定法加以监测。抗流感病毒的"保护性免疫应答，，指个体(例如人)表现的如此免疫应答，该免疫应答在该个体随后暴露于野生型流感病毒和/或受其感染时保护其不受疾病影响。在一些情况下，野生型(例如天然循环型)流感病毒可以仍造成感染，不过它不能造成严重感染。一般，所述保护性免疫应答产生可检测水平的宿主产生的血清抗体和分泌型抗体，所述的抗体能够在体外和体内中和相同抹和/或亚群的病毒(并也可能中和不同的非疫苗林和/或亚群)。如本文中所用，"抗体"是包含基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码一条或多条多肽的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包括k、？ua、y、5、s和ji恒定区基因，以及繁多的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为K或X。重链分类为y、p、a、5或s，它们转而分别定义免疫球蛋白类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。常见免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每种四聚体由相同的两对多肽链，每对多肽链具有一条"轻"链(约25kD)和一条"重，，链(约50-70kD)。每条链的氨基端定义主要负责抗原识別的含约IOO个至110个或更多个氨基酸的一个可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)指分别这些轻链和重链。抗体作为完整免疫球蛋白或作为众多充分表征的片段存在，其中所述的片段用多种肽酶消化而产生。因此，例如胃蛋白酶消化铰链区中二辟"建以下的抗体以产生作为Fab二聚体的F(ab)'2，其中所述的Fab本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)'2可以在温和环境下被还原以破坏铰链区中的二硫键，因而将所述(Fab')2二聚体转化成Fab'单体。所述Fab'单体基本上是具有部分铰链区的Fab(对其它抗体片段的更详细描述，见《基础免疫学》(FundamentalImmunology)，W.E.Paul编辑，RavenPress,N.Y.(1999))。尽管就消化完整抗体而言定义了多种抗体片段，技术人员将理解此类Fab'片段可以按照化学方式或通过使用重组DNA方法学从头合成。因此，术语"抗体"如本文中所用，包括抗体或通过修饰完整抗体而产生或使用重组DNA方法学从头合成的片段。抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、多链或单链抗体，所述单链抗体包括其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起以形成连续多肽的单链Fv(sFv或scFv)抗体和人源化或嵌合抗体。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>流感病毒曱型流感病毒是感染类型广泛的禽类和哺乳动物种的有包膜负股单链RNA病毒。曱型流感病毒分成血凝素(HA)和神经氨酸酶5(NA)主要表面糖蛋白的血清学定义抗原亚型(WHO备忘录1980BullWHO58:585-591)。该命名法满足了对可由全部国家使用的简单系统的要求并且其从1980年以来一直有效。此命名法以源自包含血凝素和神经氨酸酶抗原的双向免疫扩散(DID)反应的数据为基础。双向免疫扩散(DID)试验如先前所述(Schild,GC等1980病毒学文献(ArchVirol)63:171-184)进行。简而言之，试验在琼脂糖凝胶上实施(HGT琼脂糖、1%磷酸盐緩冲盐水、pH7.2,含有0.01%叠氮钠)。含有每毫升5-15mg病毒蛋白(或鸡红细胞的HA滴度为每0.25ml1055-1065血凝素单位)的纯化病毒颗粒的制品以5-10|il体积添加至凝胶的孔内。病毒颗粒在孔内通过添加1%终浓度的去垢剂十二烷基肌氨酸钠NL97加以破坏。将沉淀反应照相而不染色，或将凝胶干燥并用考马斯亮兰染色。当使用对一种或另一种所述抗原为特异的超高免血清开展DID试验时，该试验提供用于比较抗原关系的有价值方法。抗原之间的相似性检测为共同沉淀素线，其中当使不同抗原^L射状地对单种血清向内扩散时，抗原之间变异的存在由毛刺状沉淀素揭示。基于对源自全部物种的甲型流感病毒的DID试验的结果，H抗原可以分成如表2中所示的16个亚型。表2从人、低等哺乳动物和鸟类分离的甲型流感病毒的血凝素亚型<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>显示流感病毒参考株或来自该物种的首个分离株。b目前亚型命名。来自WHO备忘录1980BullWHO58:585-591。曱型流感病毒基因组由8条单链负义RNA(single-strandnegative-senseRNA)分子组成(图1)。三种膜整合蛋白-血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)和少量M2离子通道蛋白-插入贯穿病毒包膜的脂质双层。认为病毒粒子基质蛋白Ml位于脂质双层下面，还与螺旋状核糖核蛋白(RNPs)相互作用。在包膜内存在以RNP形式包含的8节段单链基因组RNA(长度范围从2341至890核苷酸)。与RNP结合的少量由PB1、PB2和PA蛋白质组成的转录酶复合体。所述8个RNA节段的编码功能也在图1中显示。HA和NA由独立的RNA分子编码。HA参与病毒与宿主细胞糖蛋白上的末端唾液酸残基和糖脂结合。在病毒进入细胞的酸性内吞体区室后，HA也参与同细胞膜的融合，这种融合导致病毒粒子内容物释放至胞内。HA作为HAo前体合成，其中HAo前体形成病毒表面上非共价结合的同三聚体。所述HAo前体由宿主蛋白酶在保守的精胺酸残基处切割以产生两个由单个二碌L键连接的亚基HAi和HA2(图2)。该切割事件是生产型感染所需要的。NA切割曱型流感病毒细胞受体的末端唾液酸残基并参与成熟病毒粒子的释放散播；它也可能对病毒初始进入有贡献。抗原转变和漂移曱型流感病毒基因组的节段化有利于毒抹之间在两种或多种毒抹感染相同细胞时的重配。重配可以产生重大遗传变化，称作抗原转变。相反，抗原漂移是具有细微遗传性变化的病毒抹的累积，其中所述的细微遗传性变化主要是HA和NA蛋白中的氨基酸置换。由病毒编码的RNA依赖性RNA聚合酶复合体进行的曱型流感病毒核酸复制是相对易出错的，并且RNA基因组中的这些点突变(每个复制循环-l/104)是漂变的主要遗传性变异源。选择作用有利于具有涉及HA和NA蛋白的抗原转变和漂移的人曱型流感病毒毒林，因为这些毒林能够逃避来自先前感染和接种的中和抗体。这种选择作用造成辛亚型(转变)或相同病毒亚型(漂移)的病毒性再感染。抗原转变造成二十世纪三次主要曱型流感病毒大流行，包括1918H1N1(西班牙流感)、1957H2N2(亚洲流感)和1968H3N2(香港流感)暴发。抗原漂移是流感流行的年度特征。这还解释了基于中和抗体的曱型流感病毒接种效力降低对于特定亚型，若接种中所用的HA蛋白的氨基酸序列不匹配流行期间遭遇的HA蛋白的氨基酸序列，抗体中和作用可能是无效的。组织嗜性的决定子甲型流感病毒HA对宿主细胞表面上整合型糖蛋白或糖脂的结合特异性似乎是特定曱型流感病毒亚型是否可以感染人的关键决定因素。禽流感病毒，如H5N1亚型，偏好性地结合至细胞表面受体，其中所述的细胞表面受体由与糖蛋白或糖脂的倒数第二个半乳糖残基以2-3连接(NeurAc(a2-3)Gal)的末端唾液酸组成。相反，人系病毒，包括从1918年、1957年和1968年大流行早期分离的人系病毒，结合至其中这些末端唾液酸-半乳糖残基具有2-6连接(NeurAc(a2-6)Gal)的受体。鸟和人的呼吸道上皮分别主要表达具有唾液酸的2-3连接和2-6连接的曱型流感病毒受体。载体启动子和表达系统本发明包括并入一个或多个在本文中所述核酸序列的重组构建体。此类构建体任选地包括其中已经以正方向或反方向插入例如包含禽H5框架或其亚序列等的本发明一个或多个多核苷酸序列的载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等，其中所述的多核苷酸序列例如包含禽H5框架，所述的禽H5框架包含了改变如本文中所述受体特异性的至少一种突变。例如，插入的核酸可以包含病毒染色体序列或cDNA，所述的病毒染色体序列或cDNA包括本发明的至少一种多核苷酸序列的全部或部分。在一个实施方式中，所述构建体还包含与所述序列有效连接的调节序列，包括例如启动子。种类众多的合适载体和启动子是本领域技术人员已知的并且是市售的。可以在适于产生有义或反义RNA和任选地产生多肽(或肽)表达产物(例如本发明的血凝素分子或其片段)的多种载体之任一者中包含本发明的多核苷酸。此类载体载体包括染色体、非染色体和合成性DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA;杆状病毒；酵母质粒；从质粒与噬菌体DNA的组合中衍生的载体、病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病毒、腺病毒、腺联病毒、逆转录病毒和众多其它载体(例如pCMV/R)(Barouch等2005病毒学杂志(JVirol)79:8828-8834)。可以使用能够将遗传材料导入细胞并且若需要复制则可在相关宿主内复制的任意载体。在表达载体中，目的HA多核苷酸序列以物理方式在距离和方向上与合适转录控制序列(例如启动子和任选地一个或多个增强子,)排列以指导mRNA合成。也就是说，目的多核苷酸序列有效地与适宜的转录控制序列连接。此类启动子的实例包括LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体XPj^启动子和已知可控制基因在原核或真核细或其病毒中表达的其它启动子。多种启动子适用于表达载体中以调节流感病毒基因组节,爻序列的转录。在某些实施方式中，使用细胞巨化病毒(CMV)DNA依赖性RNA聚合酶II(PolII)启动子。根据需要，例如为调节条件表达，可以取代以在指定条件下或在指定组织或细胞中诱导RNA转录的其它启动子。众多病毒启动子和哺乳动物启动子例如人启动子，是可获得的或可以根据构思的具体应用加以分离。例如，从动物和人病毒的基因组中获得的备选启动子包括此类启动子，如腺病毒(如腺病毒2)、乳头瘤病毒、乙型肝炎病毒、多瘤病毒和猴病毒40(SV40)以及多种逆转录病毒的启动子。哺乳动物启动子包括其中所属的肌动蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、热休克启动子等。转录任选地通过包含增强子序列而增加。增强子一般是同启动子协调发挥作用以增加转录的短的(例如10-500bp)、顺式作用DNA元件。众多增强子序列已经从哺乳动物基因(血红蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰岛素)和真核细胞,病毒中分离。增强子可以被剪接至载体内位于异源性编码序列的5'或3'，但是通常插入启动子的5'部位。通常，选择启动子和根据需要选择额外的转录增强序列以优化在待导入所述异源性DNA的宿主细胞类型中的表达。任选地，所述扩增子也可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点或内部核糖体进入位点(IRES)。本发明的载体也有利地包含终止转录和为稳定mRNA所必需的序列，如聚腺苷酸化位点或终止子序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的3'非翻译区及偶尔5'非翻译区获得。在一个实施方式中，牛生长激素终止子可以提供聚腺苷酸化信号序列。此外，如上所述，所述表达载体任选地包含一个或多个选择标记基因以提供用于选择已转化宿主细胞的表型性状，除了先前所列的基因之外，标记如如二氢叶酸还原酶或卡那霉素抗性适用于真核细胞培养中的选择。含有如上所述适宜核酸序列以及适宜启动子或控制序列的载体可以用来转化可允许所述蛋白质表达的宿主细胞。尽管本发明的载体可以在细菌细胞中复制，然而常常需要将它们导入哺乳动物细胞，例如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞、COS细胞，或用于表达目的的其它细胞等。额外表达元件最常见地，编码流感病毒HA蛋白的基因组节段包括对其表达(包括翻译成功能性病毒蛋白)必需的任意额外序列。在其它情况下，可以使用编码病毒蛋白例如HA蛋白的微型基因或其它人工构建体。在如此情况下，再次地，常常需要包含辅助所述异源性编码序列高效翻译的特定起始信号。这些信号可以包括例如ATG起始密码子及邻近序列。为确保完整插入物的翻译，将起始密码子相对于病毒蛋白插在正确的开放阅读框内。外源性转录性元件和起始密码子可以具有多种来源，无论是天然的或合成的。表达效率可以通过包含适宜于所用细胞系统的增强子予以增强。根据需要，编码额外表达的元件如信号序列、分泌或定位序列等的多核苷酸序列可以并入载体，通常符合于目的多核苷酸的开放阅读框，例如其目的是将多肽表达靶向所需的细胞区室或细胞器或指导多肽分泌至周质间隙或进入细胞培养基。此类序列是技术人员已知的，并且包括分泌前导肽、细胞器定向序列(例如核定位序列、ER停留信号、线粒体转移序列)、膜定位/锚定序列(例如终止转运序列、GPI锚定序列)等。在需要翻译由本发明核酸序列编码的多肽时，额外的特异性翻译起始信号可以改善翻译效率。这些信号可以包括例如ATG起始密码子和邻近序列、IRES区等。在一些情况下，例如，将包含编码序列的全长cDNA分子或染色体节段、翻译起始密码子和相关序列元件插入同时具有目的多核苷酸序列的适宜表达载体，其中所述的编码序列并入例如本发明的多核香酸序列(例如在本文的序列中)。在这类情况下，往往不需要额外的翻译控制信号。然而在其中仅插入多肽编码序列或其部分的情况下，经常提供例如包括ATG起始密码子在内的外源性翻译控制信号以表勤目关序列。所述起始密码子置于正确的开放阅读框中以确保目的多核苦酸序列的转录。外源性转录性元件和起始密码子可以具有多种来源，无论是天然的或合成的。表达效率可以通过包含适宜于所用细胞系统的增强子予以增强。细胞培养和表达宿主本发明也涉及以本发明载体导入(转导、转化或转染)的宿主细胞并涉及通过重组技术产生本发明的多肽。宿主细胞用载体如本发明的表达载体进行基因改造(即转导、转化或转染)。如上所述，所述载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。适宜表达宿主的实例包括细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyce)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium);真菌细胞如酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴#々德、毕赤酵母(Pichiapastoris)和链孑包霉(Neurosporacrassa);或昆虫纟田月包i口果虫龟(Drosophila)和草i也贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)。通常使用哺乳动物细胞来培养本发明的HA分子。用于复制本文中HA序列的合适宿主细胞包括例如Vero细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞和COS细胞、包括ing293T细胞、COS7细胞等。细胞一般在补充有血清(例如10%胎牛血清)的标准商业培养基如Dulbecco改良Eagle培养基或无血清培养基中，在适用于维持中性緩冲pH(在7.0-7.2之间的pH上)的受控湿度和C02浓度下培养，任选地，所述培养基含有防止细菌生长的抗生素(例如青霉素、链霉素等)和/或额外的营养物(如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸)、促进有利的生长特征的额外补充物，例如胰蛋白酶、P-巯基乙醇等。工程化的宿主细胞可以在常规营养培养基中培养，其中所述的常规营养培养基根据需要进行改良以激活启动子、选择转化体或扩增所插入的多核苷S^f列。培养条件如温度、pH等一般是先前随所选用于表达的特定宿主细胞使用员而言和在本文中引用的参考文献中是显而易见的，所述的参考文献Sambrook等，《分子克,隆实验手册第三版》(MolecularCloning-ALaboratoryManual(3rdEd.))，第1-3巻，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory),冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约(NewYork)，2001("Sambrook")和F.M.Ausubel等编辑《分子生物学最新方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),才各4木出片反十办会公司(GreenePublishingAssociates,Inc.)和约翰威利国际出版公司(JohnWiley&Sons,Inc.)间的合资公司CurrentProtocols("Ausubel")。此外，此类方法中适应于本发明的变体通过例行实验可轻易确定并且是本领域技术人员所熟悉的。在哺乳动物宿主细胞中，可以使用众多的表达系统如基于病毒的系统。在其中使用腺病毒作为表达载体的情况下，编码序列任选地连接至由晚期启动子和三联体前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合体。在该病毒基因组的非必需性El或E3区内的插入将产生能够在感染的宿主细胞中表达目的多肽的活病毒。此外，可以使用转录增强子如罗氏肉瘤病毒(RSV)增强子，来提高在哺乳动物宿主细胞中的表达。任选地因其调节插入序列的表达或以想要的方式加工所表达蛋白质的能力而选择宿主细胞抹。对蛋白质的此类修饰包括，但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。将蛋白质的前体形式切割至成熟形式的翻译后加工有时对于正确插入、折叠和/或功能是重要的。此外，在宿主细胞中的正确定位(例如在细胞表面上)也是重要的。不同宿主细胞如COS、CHO、BHK、MDCK、293、293T、COS7等具有特定细胞装置和特征性机制用于此类后加工活性，并且可以进行选择以确保当前导入的外来蛋白质的正确修饰和加工。任选地，使用稳定表达系统以长期高率地产生重组蛋白，其中所述的重组蛋白由本发明的多核苷酸编码或具有由所述多核苦酸序列编码的亚序列。例如，稳定表达本发明多肽的细胞系使用含有病毒复制起点或内源表达元件以及选择标记基因的表达载体转染。例如，在导入载体后，使细胞在丰富培养基中生长1-2日，随后将它们转移至选择性培养基内。选择性标记的目的是赋予选择抗性，并且选择标记的存在允许培育及回收成功表达所导入序列的细胞。因此，稳定转化的细胞(例如从单一细胞类型衍生)的抗性团簇可以使用适于所述细胞类型的组织培养^t支术增殖。用编码本发明多肽的核香酸序列转化的宿主细胞任选地在适于表达并从细胞培养中回收所编码蛋白质的条件下培养。可以分选、分离和/或纯化表达所述蛋白质的细胞。由重组细胞产生的蛋白质或其片段可以是分泌的、膜结合的或在细胞内停留，这取决于所用的序列(例如取决于编码膜停留信号或其它等的融合蛋白)和/或载体。对应于本发明核酸的表达产物也可以在非动物细胞如植物、酵母、真菌、细菌等中产生。参考上述的Sarnbrook和Ausubel。在细菌系统中，根据所表达产物的预期用途，可以选择多种表达载体。例如，当需要大量多肽或其片段以产生抗体时，有利地使用指导可轻易纯化的融合蛋白高水平表达的载体。此类载体包括，但不限于多功能大肠杆菌克隆及表达载体，如BLUESCRIPT(美国斯特瑞塔基因(Stmtagene));pIN载体；pET载体等，其中在所述BLUESCRIPT内的目的编码序列(例如包含本文中找到的那些序列等的序列)可以连接至该载体内与用于氨基端翻译的序列处于同一个开放阅读框，其中所述的氨基端翻译始自曱硫氨酸和P-半乳糖苷酶的后续7个残基，从而产生具有催化活性的(3半乳糖苷酶融合蛋白。类似地，在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，含有组成型或诱导型启动子如a因子、醇核酸杂交可以使用比较杂交法来鉴定本发明的核酸，包括本发明核酸的保守性变异。这种比较杂交法是区别本发明核酸的优选方法。此外，在高、超高和超超高严格性条件下与由序列代表的核酸杂交的靶核酸是本发明的特征。此类核酸的实例包括与给定核酸序列相比具有一个或数个沉默性或保守性核酸置换的那些核酸。声称试验輩巴核酸与探针核酸特异性杂交，此时所述靶核酸如杂交至完全匹配性互补靶那样，以如此信噪比与所述探针充分杂交至少50%,其中所述的信噪比是所述探针在这样的条件下与所述靶杂交时的信噪比的至少一半，其中在所述的条件下前述完全匹配性探针以这样的信噪比与所述完全匹配性互补靶结合，该信噪比是对杂交至任意非匹配性靶核酸时所观察到的信噪比的至少约5倍-10倍。核酸在其结合时通常在溶液中"杂交"。核酸因多种充分表征的物理化学力如氢键结合作用、溶剂排斥作用、碱基推叠作用等杂交。用于核酸杂交的多种方法是本领域众所周知的。在上述的Sambrook和Ausubel中存在针对核酸杂交的一般指导。用于具有100个互补残基的互补性核酸在DNA印迹法或RNA印迹法中的滤膜上杂交的严格杂交条件实例是在42。C于含有1mg肝素的50%福尔马林内过夜实施杂交。严格洗涤条件的实例包括用0.2xSSC在65'C洗涤15分钟。低严格性洗涤往往先于高严格性洗涤以出去背景探测信号。低严格性洗涤的实例是2xSSC在4(TC持续15分钟。通常，在特定杂交测定法中比对于不相关探针所观察到的信噪比高5倍(或更高)的信噪比表示^r测到特异性杂交。在杂交后，不杂交的核酸可以通过一系列洗液去除，所述洗液的严格性可以根据想要的结果进行调节。低严格性洗涤条件(例如使用更高的盐浓度和更低的温度)提高敏感性，但可以产生非特异性杂交信号和高背景信号。更高的严格性条件(例如使用更低的盐浓度和与Tm更接近的更高温度)降低所述背景信号，而一般主要留下特异性信号。"严格性杂交洗涤条件"在核酸杂交实验如DNA印迹杂交和RNA印迹杂交的上下文中是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。严格性杂交条件和洗涤条件可以对任意试验核酸以实验方式容易地确定。例如，在确定高度严格性杂交条件和洗涤条件中，逐步提高杂交条件和洗涤条件(例如在杂交或洗涤中通过提高温度、降低盐浓度、提高去垢剂浓度和/或提高有机溶剂(如福尔马林)的浓度)，直至满足所选的一组标准。例如，逐步提高杂交条件和洗涤条件直至探针以这样的信噪比与完全匹配性互补靶结合，其中所述的信噪比是对前述探针杂交至非匹配性靶时所观察到的信噪比的至少5倍。通常，在特定杂交测定法中比对于不相关探针所观察到的信噪比高至少2倍(或更高，例如至少5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多倍)的信噪比表示检测到特异性杂交。在本发明的上下文中检测到两个序列之间的至少严格性杂交表示与例如本发明核酸的相对强的结构相似性。选择"极严格，，条件以等同于特定探针的解链温度(Tm)。Tm是(在定义的离子强度和pH下)50%试验序列与完全匹配性探针杂交的温度。出于本发明的目的，通常，选择"高度严格"杂交条件和洗涤条件以低于所述具体序列在定义的离子强度和pH上(如下文所述，高度严格性条件也可以以比较性术语提及)的Tm约5°C。可以在严格条件或高度严格性条件下鉴定与目的核苷酸序列(例如"探针")密切相关或相同的靶序列。更低严格性条件适用于互补性较低的序列。"超高严格性"杂交条件和洗涤条件是这样的条件，其中提高杂交条件和杂交至任意非匹配性靶核酸时所观察到M/信噪比的至少10倍。将此类条件下以这样的信噪比与探针杂交的靶核酸称作在超高严格性条件下与所述探针杂交，其中所迷的信噪比是完全匹配性互补靶核酸的信噪比的至少50%。在严格性或高度严格性杂交(或甚至更严格性杂交)条件和洗涤条件中，逐步提高杂交条件和洗涤条件(例如在杂交或洗涤中通过提高温度、降低盐浓度、提高去垢剂浓度和/或提高有机溶剂(如福尔马林)的浓度)，直至满足所选的一组标准。例如，根据需要，逐步提高杂交条件和洗涤条件，直至包含本发明的一个或多个多核苷酸序列(例如选自本文所给出那些多核苷酸序列的序列或亚序列和/或其互补性多核苷酸序列)的探针以这样的信噪比与完全匹配性互补耙(再次，所述的耙是包含一种或多种核酸序列或选自本文所给出那些多核苷酸序列中的亚序列和/或其互补性多核苷酸序列)结合，其中所述的信噪比是对前述探针杂交至非匹配性靶(例如包含选自在提交时于公共数据库如GenBank内存在的已知流感病毒序列当中的一个或多个序列或亚序列的多核苷酸序列，和/或其互补性多核苷酸序列)时所观察到的信噪比的至少2倍(和任选5倍、10倍、100倍或更多倍)。类似地，甚至更高水平的严格性可以通过逐步提高相关性杂交测定法的杂交条件和/或洗涤条件而确定，例如这样的杂交测定法，其中提高杂交条件和洗涤条件的严格性，直至揮:针与完全匹配性互补靶核酸结合的信噪是对杂交至任意非匹配性把核酸时所观察到的信噪比的至少至少10倍、20倍、50倍、100倍，或500倍或更多倍。具体的信号将取决于相关性测定法中所用的标记物，例如荧光标记物、比色标记物、放射性标记物等。将此类条件下以这样的信噪比与探针杂交的靶核酸称作在超超高严格性条件下与所述探针杂交，其中所述的信噪比是完全匹配性互补靶核酸的信噪比的至少二分之一。目的生物分子的克隆、诱变和表达适用于本发明的分子生物学技术如克隆\突变\细胞培养等的通用教材描述包括上文的Sambrook和Ausubel。这些教材描述诱变、载体用途、启动子和例如涉及产生HA分子等的众多其它相关主题。在本发明中任选使用多种类型的诱变，例如旨在产生和/或分离例如新的或新分离的HA分子和/或旨在进一步修饰/突变本发明的多肽(例如HA分子)。所述诱变包括但不限于位点定向诱变、随机点突变、使用含尿嗜啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的修饰的DNA诱变、使用带缺口的双链体DNA的诱变等。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌抹的诱变、限制作用-选择作用和限制作用-纯化作用、缺失诱变、通过基因总合成的诱变、双链断裂修复等。在一个实施方式中，可以通过天然存在分子或改变或突变的天然存在分子的已知信息例如序列、序列比较结果、物理属性、晶体结构等指导诱变。寡核苦酸，例如用于本发明诱变(例如致本发明HA分子突变或改变本发明HA分子的诱变)中的寡核苷酸,如Needham-VanDevanter等在1984《核酸研究》(NucleicAcidsRes)12:6159-6168中所述，一般根据Beaucage和Caruthers1981四面体快报(TetrahedronLetts)22:1859-1862描述的固相亚磷酰胺三酯方法，例如使用自动合成仪化学地合成。此外，基本上任意的核酸可以从任意的多种商业来源自行订购或以标准方式订购。本发明也涉及包含本发明的HA分子或其它多肽和/或核酸或在多种载体等当中的此类HA或其它序列的宿主细胞和生物。宿主细胞用本发明的载体进行基因改造(例如转化、转导或转染)，所述载体例如可以是克隆载体或表达载体。所述载体可以例如处于质粒、细菌、病毒、棵多核苷酸或缀合的多核苷酸形式。载体通过标准方法导入细胞和/或微生物，所述标准方法包括电穿孔法、病毒载体感染法、在小珠或颗粒的基质内部或表面携带核酸的小颗粒高速射弹穿透法。上述的Sambrook和Ausubel提供了多种适宜的转化方法。几种将靶核酸导入细菌细胞的熟知方法是可获得的，其中任意者可以在本发明中使用。这些方法包括受者细胞与含有DNA的细菌原生质体融合法、电穿孔法、抛射体轰击法和病毒载体感染法等。细菌细胞可以用来放大含有本发明DNA构建体的质粒数目。所述细菌培育致对数期并且该细菌内的质粒可以通过本领域已知的多种方法(例如参见Sambrook)分。此外，用于从细菌中纯化质粒的多种试剂盒是市售的。随后进一步操作分离和纯化的质粒以产生其它质粒，后者用来转染细胞或引入相关载体以感染生物。常见载体含有转录及翻译终止子、，转录和翻译起始序列和用于调节特定靶核酸表达的启动子。所述载体任选地包含类属性表达盒，该表达盒含有至少一个独立的终止子序列、允许该表达盒在真核生物或原核生物或者两类生物中复制的序列(例如穿梭载体)和用于原核及真核系统的选择标记。载体适用于在原核生物或真核生物或者优选这两类生物中复制和整合。见，Sambrook和Ausubel(上文)。例如在互联网网址ATCC.org处，提供用于克隆的细菌和噬菌体目录。用于测序、克隆的其它基础方法和分子生物学其它方面以及基础性理论考虑也存在于Watson等(1992)重组D萌Re隱bi腿tDNA)第二版科学美国出版社(ScientificAmericanBooks),纽约(NY)。多肽的产生和回收在一些实施方式中，在转导合适的宿主细胞系或菌抹并且将所述宿主细胞培育至适宜细胞密度后，所选择的启动子通过合适方法(例如温度转变或化学诱导)诱导并且将细胞培养额外一段时间。在一些实施方式中，随后从培养基中回收分泌型多肽产物，例如作为分泌型融合蛋白形式的HA多肽等。或者，细胞可以通过离心法收获、通过物理或化学方法破碎，并且留下所得的粗提物用于进一步纯化。用于表达蛋白质的真核细胞或微生物细胞可以由任意的常规方法破碎，所述的常规方法冻融循环法、超声波处理法、机械破碎法或使用细胞裂解剂或本领域技术人员熟知的其它方法。此外，表达本发明HA多肽产物的细胞可以在不从细胞中分离所述多肽的情况下使用。在这种情况下，本发明检验(例如因具有HA分子或其片段，例如包括融合蛋白或其它等)。此类细胞也是本发明的特征。表达的多肽可以通过本领域众所周知的众多方法之任意者从重组细胞培养中回收和纯化，所述方法包括硫S交铵或乙醇沉淀法、酸提取法、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析(例如使用本领域技术人员已知的任意标签系统)、羟基磷灰石层析和凝集素层析。蛋白质再折叠步骤可以根据需要在完成成熟蛋白质的构象中使用。高效液相色谱层析(HPLC)也可以在最终纯化步骤中使用。或者，可以使用无细胞转录/翻译系统来产生包含本发明氨基酸序列或亚序列的多肽。众多合适的体外转录和翻译系统是市售的。体外转录和翻译方法的一般指南存在于Tymms(1995)分子生物学方法第37巻体外转录和翻译操作(InvitroTranscriptionandTranslation'Protocols:MethodsinMolecularBiologyVolume37),花环出版社(GarlandPublishing),纽约(NY)。此外，多肽或其亚序列(例如包含抗原肽的亚序列)可以手工方式产生或通过使用自动化系统，使用固相合成技术通过直接肽合成法产生(见,MerrifieldJ1963美国化学协会杂志(JAmChemSoc)85:2149-2154)。示例性自动化系统包括应用生物系统(AppliedBiosystems')431A肽合成仪(珀金埃尔默(PerkinElmer),福斯特市(FosterCity),加利福尼亚(CA))。根据需要，亚序列可以单独修饰的氨基酸本发明表达的多肽可以含有一个或多个修饰的氨基酸。存在修饰的氨基酸可能是有利的，例如在于(a)增加多肽的血清半寿期、(b)降低/增加多肽的抗原性、(c)提高多肽的储藏稳定性等。氨基酸在重组产生期间例如以共翻译或翻译后方式受到修饰(例如在哺乳动物细胞期间在N-X-S/T基序处的N-连接糖基化)或通过人工方法修饰(例如通过PEG化)。修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化氨基酸、硫酸化氨基酸、异戊烯化(例如法尼基化、雜牛儿基維牛儿基化)氨基酸、乙酰化氨基酸、酰化氨基酸、PEG化氨基酸、生物素化氨基酸、羧化氨基酸、磷酸化氨基酸等，以及通过与例如脂质部分或其它有机衍生化剂缀合加以修饰的一元酸。足以指导修饰氨基酸的参考文献见于诸多文献。实例方法存在于Walker(1998)光盘版《蛋白质方法》(蛋白质ProtocolsonCD-ROM)人类出版社(HumanPress)，妥华达Towata,新泽西(NJ)。融合蛋白本发明也提供融合蛋白，其包含本发明(例如编码HA多肽)的序列或其片段与例如免疫球蛋白(或其部分)、编码例如GFP(绿色荧光蛋白)或其它类似标记的序列等的融合物。编码此类融合蛋白的核苷^f列是本发明的另一个方面。本发明的融合蛋白任选用于例如与本发明的非融合蛋白相似的应用(包括如本文中所述的例如治疗性、预防性、诊断性、实验性等应用)。除了与免疫球蛋白序列和标记序列融合之外，本发明的蛋白质还任选地例如与将所述融合蛋白靶向特定细胞类型、区域等的序列融合。抗体本发明的多肽可以用来产生对本文中所给出多肽或由本发明的多核苷酸编码的多肽具有特异性的抗体，如本文中所示的那些抗体，及其保守性变体。对上述多肽特异的抗体例如用于诊断性和治疗性目的，例如涉及靶多肽的活性、分布和表达。例如，此类抗体可以任选地用来在与本文HA序列相同的毒抹中定义其它病毒。对本发明多肽特异的抗体可以通过本领域众所周知的方法产生。此类抗体可以包括，但不限于多克隆、单克隆、嵌合、人源化、单链、Fab片段和由Fab表达文库产生的片段。对于产生抗体而言多肽不需要具有生物学活性(例如不需要全长有功能的血凝素)。然而，多肽或寡肽必须是抗原肽。用来诱导特异性抗体的肽一般具有含至少约4个氨基酸且往往含至少5个或10个氨基酸的氨基酸序列。多肽短段可以与另一种蛋白质(如匙孔血蓝蛋白)和针对所述嵌合分子产生的抗体融合。用于产生多克隆和单克隆抗体众多多方法是本领域技术人员已知的，和可以加以调整以产生对本发明的和/或本发明多核苦酸序列编码的多肽具有特异性的抗体。见，例如Harlow和Lane(1988)《抗体实'睑手册》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，纽约(ColdSpringHarborPress,NY);和Kohler及Milstein(1975)自然(Nature)256:495-497。用于抗体制备的其它适用技术包括选择噬菌体或相似载体中的重组抗体文库。见，Huse等1989科学(Science)246:1275-1281;和Ward,等1989自然(Nature)341:544-546。特异性单克隆和多克隆抗体以及抗血清通常将以例如至少约O，l|lM、至少约0.01fiM或更佳并且一般至少约0.001或更佳的KD结合。对于特定治疗性应用，需要人源化抗体。用于制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可以在美国专利5,482,856中找到。关于人源化和其它抗体产生法的额外细节以及工程化技术可以在专利和科学文献中找到。通过免疫反应性定义多肽因为本发明的多肽提供多种新多肽序列(例如包含HA分子，)，故所述多肽也产生可以识别、例如在免疫学测定中可识别的新结构特征。产生特异性结合本发明多肽的抗血清和由此类抗血清结合的多肽是本发明的特征。例如，本发明包括特异性地结合于或特异性地与抗体或抗血清发生免疫反应的多肽(例如HA分子)，所述的抗体或抗血清针对包含选自本文所给出一个或多个序列中的氨基酸序列等的免疫原产生。为消除与其它同系物的交叉反应性，以提交时在公共数据库中存在的HA分子如"对照"多肽扣减所述抗体或抗血清。在其余对照序列对应于核酸的情况下，产生由该核酸编码的多肽并用于抗体/抗血清扣减目的。在一种常见形式下，所述免疫测定法使用了针对一种或多种多肽所产生的多克隆抗血清，其中所述的多肽包含与本文序列等相对应的一个或多个序列或其绝大部分亚序列(即所提供全长序列的至少约30。/。)。得自本发明序列的成套多种多肽免疫原在下文中整体地称作"免疫原性多肽"。任选地选择所得抗血清以与对照血凝素类似物具有低交叉反应性，并且任何此类交叉反应性在所述免疫测定法中使用多克隆抗血清之前例如通过免疫吸附加以消除。为了产生用于免疫测定法中的抗血清，如本文所述产生并纯化一种或多种所述免疫原性多肽。例如，可以在重组细胞中产生重组蛋白。将小鼠近交系(在本测定法中使用，原因是结果由于小鼠的虚拟遗传同一性而具有更多可重复性)免疫以与标准佐剂如弗氏佐剂联合的免疫原性蛋白和小鼠标准免疫程序(对于抗体产生、免疫测定模式和可以用来确定特异免疫反应性的条件的标准描述，见例如Harlow和Lane(1988)《抗体实验手册》(Antibodies:ALaboratoryManual)冷泉港出版社，纽约(ColdSpringHarborPress,NewYork))。其它参考文献和对抗者，从本文公开的序列中衍生的一种或多种合成多肽或重组多肽与载体蛋白缀合并且用作免疫原。将多克隆血清收集并在免疫测定法(例如具有固定在固相支持物上的一种或多种所述免疫原性蛋白的固相免疫测定法)中针对所述免疫原性多肽进^f亍滴定。将具有106或更高滴度的多克隆抗血清选出、汇集并用对照血凝素多肽扣减以产生扣减的汇集滴定的多克隆抗血清。所述扣减的汇集滴定的多克隆抗血清在比较性免疫测定法中测试针对所述对照同系物的交叉反应性。在这种比较测定法中，对所述扣减滴定的多克隆抗血清确定区分性结合条件，所述的区分性结合条件产生与结合至所述对照同系物时的信噪比相比，至少约5-10倍更高的所述滴定多克隆抗血清与所述免疫原性多肽结合的信噪比。即，结合反应的严格性通过添加非特异性竟争物如白蛋白或脱脂乳和/或通过调节盐条件、温度和/或其它因素等进行调节。这些结合条件在后续测定法中使用以确定试验多肽(与所述免疫原性多肽和/或所述对照多肽比较的多肽)是否特异性地被所述汇集的扣减多克隆抗血清结合。尤其，与对照等相比，如此试验多肽与所述免疫原性多肽共有明显的结构相似性并且因此是本发明的多肽，其中所述的试验多肽在区分性结合条件下显示比对照同系物高至少2-5倍的信噪比，和与所述免疫原性多肽相比至少约1/2的信噪比。在另一个实例中，使用竟争性结合模式下的免疫测定法以检测试验多肽。例如，如所述，将交叉反应性抗体用对照多肽通过免疫吸附作用从汇集的抗血清混合物中除去。所述免疫原性多肽随后固定至固相支持物，所述固相支持物暴露于所述扣减汇集的抗血清。将试验蛋白添加至测定法，以竟争对所述扣减汇集的抗血清的结合作用。所述试验蛋白与所述固定蛋白质相比而竟争对所述扣减汇集抗血清结合的能力同添加至测定法中的免疫原性多肽竟争结合作用的能力进行比较(所述免疫原性多肽有效地同固定的免疫原性多肽竟争对汇集抗血清的结合作用)。使用标准计算法计算所述试验蛋白的交叉反应性百分数。在平行测定法中，与所述免疫原性多肽竟争对所述抗血清结合的能力相比较，任选地测定所述对照蛋白质竟争对所述扣减汇集抗血清结合的能力。再次地，使用标准计算法计算所述对照多肽的交叉反应性百分数。在所述试验多肽的交叉反应性百分数比对照多肽高至少5-10倍并且所述试验多肽的结合作用大致处在所述免疫原性多肽的结合作用范围内时，则称所述试验多肽与所述汇集扣减的抗血清特异性结合。通常，免疫吸附且汇集的抗血清可以在如本文中所述的竟争性结合免疫测定法中使用以将任意试验多肽与所述免疫原性多肽和/或对照多肽比较。为了开展这种比较，所述免疫原性多肽、试验多肽和对照多肽分别在广泛浓度范围内进行分析，并且使用标准技术确定每种多肽的如此量，其是抑制所述扣减抗血清对例如固定的对照蛋白、试验蛋白或免疫原性蛋白的50%结合作用所需要的。若该试验多肽对于在所述竟争性测定法中结合所需的量比所述免疫原性多肽所需的量少两倍，则称所述试验多肽特异性地与针对所述免疫原性蛋白所产生的抗体结合，前提是所述的量比对照多肽的量高至少约5-10倍。作为特异性的额外测定，汇集的抗血清任选地用所述免疫原性多肽(而非所述对照多肽)充分地免疫吸附，直至很少检测到或检测不到所得的经免疫原性多肽扣减的汇集抗血清对免疫吸附中所用免疫原性多肽的结合作用。随后用所述试验多肽测试这种充分免疫吸附的抗血清的反应性。若观察到很少反应性或观察不到反应性(即对这种充分免疫吸附的抗血清与所述免疫原性多肽的结合作用观察到不超过2倍的信噪比)，则所述试验多肽被所述免疫原性蛋白激发的抗血清特异性结合。核酸和多肽序列变体如本文中所述，本发明为核酸提供多核香S吏序列并且对多肽提供氨基酸序列，例如血凝素序列，以及例如包含所述序列的组合物和方法。所述序列的实例在本文中披露。然而，本领域技术人员将理解本发明实际上不限于本文中披露的那些序列并且本发明也提供具有如本文中所述功能(例如编码HA分子)的众多相关和不相关序列。技术人员将理解众本发明中包括所披露序列的多种变体。例如，发明中包括所披露序列的保守性变异，其中所述的保守性变异产生功能相同的序列。认为本发明中包括核酸多核苷酸序列的如此变体，其中所述变体与至少一种所披露序列杂交。本发明中也包括本文所披露序列的亚序列沉默变异因遗传密码子的筒并性，任选地产生任意的编码本发明多肽的多种核酸序列，其中某些核酸序列可以对本文中的HA核酸序列和多肽序列具有更低水平的序列同一性。指示遗传密码子的密码子表存在于多种生物学和生物化学教材中。此类密码子表显示多种氨基酸由多于一种密码子编码。例如，密码子AGA、AGG、CGA、CGC、CGG和CGU均编码精氨酸。因此，在本发明核酸中由密码子指定精氨酸的每个位置内，该密码子可以变更为任意的上文所述相应密码子，而不改变所编码的多肽。应当理解RNA序列中的U对应于DNA序列中的T。此类"沉默变异"是下文讨论的"保守性修饰变异"的一个类型。技术人员知道核酸中的每种密码子(通常仅作为甲硫氨酸的密码子的ATG和通常仅作为色氨酸的密码子的TTG例外)可以通过标准技术加以修饰，以编码功能相同的多肽。因此，在任意所述序列中内在地包括编码多肽的核酸的每种沉默变异。因而，本发明毫无疑问地提供编码本发明多肽的核酸序列的每种和各种可能的变异，其中可以通过选择基于密码子可能选项(包括人偏好性密码子)的组合而产生所述变异。这些组合根据如适用于编码本发明血凝素多肽的核酸序列的标准三联密码子而产生。通过考虑与遗传密码子相结合的序列，具体地提供和描述本文每种核酸的全部此类变异。使用本文中的方法，技术人员完全能够使用本文方法产生这些沉默型置换。保守性变异鉴于遗传密码子的简并性，"沉默型置换"(即核酸序列中不导致所编码多肽中变更的置换)是编码氨基酸的本发明每种核酸序列的暗含特征。类似地，在氨基酸序列中的一个或几个氨基酸内，"保守性氨基酸置换"以具有高度相似属性的不同氨基酸取代，也因极其相似于披露的构建体如本文中的那些构建体而轻易地得以鉴定。所披露的每种序列的此类保守性变异是本发明的特征。特定核酸序列的"保守性变异"指编码相同或基本上相同氨基酸序列的那些核酸，或在所述核酸不编码氨基酸序列的情况下，指基本上相同的序列，见下表3。技术人员会知道变更、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或小百分比(通常小于5%，更通常小于4%、3%、2%或1%)氨基酸的各个置换、缺失或添加是"保守性修饰变异"，其中所述改变导致缺失氨基酸、以化学相似的氨基酸添加氨基酸或置换氨基酸。因此，本发明所列多肽序列的"保守性变异"包括以相同保守性置换组中保守性选择的氨基酸置换多肽序列中小百分数的、通常小于5%，更通常小于4%、3%、2%或1%的氨基酸。最终，添加不改变核酸分子编码活性的序列如添加非功能性序列，是所述基础核酸的保守性变异。表3.保守性置换组<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>序列比较、同一性和同源性术语"相同"或"同一性"百分数，在两个或更多个核酸序列或多肽序列的上下文中，指这样的两个或更多个序列或亚序列，它们在就最大对应性进行比较时是相同的或具有具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸，所述的最大对应性如使用下文所述的序列比较算法之一(或术人员可获得的其它算法)或通过目视检查进行测量。短语"明显相同"，在两种核酸或多肽(例如编码HA分子的DNA或HA分子的氨基酸序列)的上下文中，指这样的两个或更多个序列或亚序列，它们在就最大对应性进行比较时具有至少约90%、优选91%、最优选92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、98.5%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%或更大的核苷酸或氨基酸残基同一化生，所述的最大对应性如使用序列比较算法或通过目视检查进行测量。此类"基本上相同的"序列一般^L为"同源的"，而不涉及实际的祖先。优选地，"明显同一性，，存在于长度至少约200个残基的氨基酸序列区域内，更优选地存在于于长度至少约250个残基的区域内，并且最优选地，所述序列在至少约300个残基、350个残基、400个残基、425个残基、450个残基、475个残基、480个残基、490个残基、495个残基、499残基或500残基范围内是明显相同的，或当所述氨基酸是血凝素或血凝素片段时在两个待比较的序列的全长范围内是明显相同的。对于序列比较和同源性确定，一个序列通常充当试验序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，试验序列和参考序列输入计算机，根据需要指定名亚序列坐标，并且指定序列算法程序参数。所述序列比较算法随后基于指定的程序参数而计算试验序列相对于参考序列的序列同一性百分数。对于比较的序列最佳比对可以例如通过Sm他和Waterman应用数学进展(AdvApplMath)2:482(1981)的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(JMolBiol)48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman，美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算机执行算法如在维斯康辛遗传软件包-遗传计算机群(WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup),575科学(Science)Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA或通过目视力全查进行。适于确定序列同一性百分数和序列相似性的一个算法实例是BLAST算法，该算法在Altschul等，分子生物学杂志(JMolBiol)215:403-410(1990)中描述。用于开展BLAST分析的软件可通过互联网上在ncbi.nlm.nih.gov处的美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)公开地获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字而确定高记分序满足某些阳性e-值化阈值记分T。T称作相邻字记分阈值。这些初始相邻字命中充当种子用于启动搜索以找到含有它们的HSP。所述的字命中随后沿每个序列的两个方向扩展，只要可以提高累积比对记分。对于核苷酸序列而言，使用参数M(—对匹配残基的奖励分；总是X))和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积记分。对于氨基S吏序列而言，使用一种记分矩阵来计算所述累积记分。当所述累积比对记分从已实现的最大值跌落达量X;所述累积比对记分因积累一个或多个负向记分的残基比对结果而至零或以下，或抵达任何一个序列的末尾时，所述字命中在每个方向上的扩展终止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长度(W)11、期望(E)10、截值IOO、M=5、N;4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长度(W)3、期望(E)11和BLOSUM62记分矩阵(见，Henikoff和Henikoff(1989)美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915)。除了计算序列同一性百分数之外，BLAST算法还开展两个序列之间相似性的统计分析(见，例如Karlin和Altschul，美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)90:5873-5787(1993))。对BLAST算法产生的相似性的一种度量是最小总和概率(P(N)),其提供两个序列之间的匹配原本偶尔发生的概率说明。例如，若试验核酸与所述参考核酸比较的最小总和概率小于约0.1、更优选小于约0.01并且最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。有用序列比对算法的另一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进配对比对法从一组相关序列中产生多重序列比对结果。它也可以绘制显示聚类关系的树状图，后者用来产生所述比对结果。PILEUP使用Feng和Doolittle(1987)分子进化杂志(J.Mol.Evol.)35:351-360的渐进比对法的简化形式。所用方法与Higgins和Sharp(1989)CABIOS5:151-153描述的方法相似。该程序可以比对例如至多达300个最大长度5000字母的序列。这种多重比对方法始于两个最相似序列的配对比对，这产生两个比对序列的簇。这种蔟随后可以与下一个最相关的序列或比对序列的簇比较。所述序列的两个蔟的可以通过配对比对各自两个序列的简单延伸加以比对。最终比对通过一系列渐进配对比对而实现。此程序也可以用来绘制聚类关系的树状图或树状显示图。此程序通过指定特定序列和其相对于序列比较区域的氨基酸或核苷酸坐标而运行。适于多重DNA序列或氨基酸序列比对的额外算法实例是CLUSTALW程序(Thompson,J.D.等(1994)核酸研究(NuclAcidsRes)22:4673-4680)。CLUSTALW执行成组序列之间的多重配对比较并且基于同源性将它们装配成多重比对结果。空位开口罚分和空位延伸罚分可以例如分别是10和0.05。对于氨基酸比对，可以使用BLOSUM算法作为蛋白质加权矩阵。见，例如Henikoff和Henikoff(1992)美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)89:10915-10919.用于预防性施用疫苗的方法和组合物通常，本发明的实施方式可以按照免疫学有效量并在适宜载体或赋形剂中预防性地施用，以刺激针对如HA序列所决定的一种或多种流感病毒毒抹为特异的免疫应答。通常，所述载体或赋形剂是药学上可接受的载体或赋形剂，如无菌水、盐水溶液、緩冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或其组合。制备保证无菌、pH、等张性和稳定性的此类溶液根据本领域建立的方法进行。一般而言，选择载体或赋形剂旨在使过敏效应和其它不良效应最小化，并且旨在适合特定施用途径，例如皮下、肌内、鼻内等。本发明的相关方面提供用于刺激个体免疫系统产生针对流感病毒的保护性免疫应答的方法。在所述方法种，免疫学有效量的本发明实施方式例如本发明的HA分子)、免疫学有效量的本发明多肽和/或免疫学有效量的本发明核酸在生理可用的载体中施用至所述个体。通常，本发明的实施方式以这样的量施用，所述的量足以刺激针对一种或多种流感病毒毒株(即针对本发明的HA毒抹)为特异的免疫应答。优选地，施用本发明的实施方式激发了针对此类毒抹的保护性免疫应答。用于激发针对一种或多种流感病毒毒株的保护性免疫应答的剂量和方法是本领域技术人员已知的。一般，所述剂量将基于例如年龄、身体条件、体重、性别、施用时间和其它临床因素在一定范围内调节。预防性疫苗制剂以全身方式施用，例如使用针头和注射器或无针头注射装置通过皮下或肌内施用。或者，该疫苗制剂以鼻内方式通过滴剂、大颗粒气雾剂(大于约IO微米)或喷雾剂施用至上呼吸道。尽管上述任意送递途径产生全身性保护免疫应答，然而鼻内施用在流感病毒进入部位赋予激发粘膜免疫的额外益处。尽管优选以单次给药刺激保护性免疫应答，不过可以通过相同或不同突途径施用额外的剂量以实现想要的预防效果。在新生儿和婴儿，例如，可以需要多次施用以激发足够水平的免疫。施用可以在整个儿童期根据需要间隔地不断进行，旨在维持足够水平的抗野生型流感感染的保护作用。类似地，特别容易遭受反复或严重流感感染的成人，例如护工、日间护理员、幼童的家庭成员、老年人和心肺功能不足的个体，可能需要多次兔疫以建立和/或维持保护性免疫应答。诱导免疫水平可以例如通过测量中和性分泌抗体和血清抗体的量进行监测，并且根据需要调节剂量或反复接种以激发和维持所需水平的保护作用。任选地，用于预防性施用本发明实施方式的制剂也含有一种或多种佐剂以增强针对流感病毒抗原的免疫应答。合适的佐剂包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝,和表面活性物质如溶血磷脂、复合多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油或烃乳液、卡介苗(BCG)、短小棒状杆菌(CorynebacteriumParvum)以及合成佐剂QS-21和MF59。根据需要，本发明实施方式的预防性疫苗施用可以与施用一种或多种免疫刺激分子一起进行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激活性、免疫沉淀活性和促炎活性的多种细胞因子、淋巴因子和趋化因子，如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生长因子(例如粒细胞-巨噬细胞(GM)-集落刺激因子(CSF))和其它免疫刺激分子如巨噬细胞炎性因子、Flt3配体、B7.1;B7.2施用。可以施用蛋白质(例如本发明的HA多肽)或编码所述蛋白质的表达载体以产生免疫刺激作用。上文所述的方法用于通过将本发明的载体以体外、离体或体内方式导入靶细胞群而治疗性和/或预防性地治疗疾病或病症，通常是流感，其中所述的载体包含编码有治疗或预防活性的HA多肽(或肽)或HARNA(例如反义RNA或核酶)的异源性多核苷酸。通常，编码所述多肽(或肽)或RNA的目的多核苷酸有效地连接至适宜的调节序列，例如本文中所述的调节序列。任选地，多于一种异源性编码序列并入单一载体或病毒。例如，除了编码有治疗或预防活性的HA多肽或RNA的多核香酸之外，所述载体也可以包括额外的治疗性或预防性多肽，例如抗原、共刺激分子、细胞因子、抗体等和/或标记等。可以将禽H5HA转换成人受体特异性的突变禽病毒结合至肠道中具有a2-3连接的唾液酸糖苷，而人适应性病毒对呼吸道中的a2-6连接呈特异性。从a2-3至a2-6受体特异性的转变是禽病毒适应人宿主过程中的关键步骤并且似乎是绝大多数禽流感病毒(包括当前禽H5毒抹)在禽至人感染后不容易从人传播至人的原因之一。受体结合结构域的结合位点包含三个结构性元件，即a-螺旋(190-螺旋、HA1第190至第197位)和两个环(130-环，HA1第135-138位和220-环，HA1第221-228位)。众多保守残基参与受体结合，这些残基包括第136、l卯、193、194、216、221、222、225、226、227和228位氨基酸。因此，产生如此问题，即现有H5病毒如何能够使其HA适应结合至人受体。先前研究已经在Hl、H2和H3血清型中确定参与禽至人受体特异性转变的众多关键性受体结合结构域突变。例如，发现1918Hl可能仅通过两个突变(D190E和D225G)而从a2-6受体特异性转变成经典的禽a2-3特异性。反过来，具有a2-3特异性的禽Hl病毒通过E190D和G225D突变转变成a2-6特异性(StevensJ等2006科学(Science)312:404-410)。然而，哪种突变有可能调节H5血清型中的受体特异性不是很清楚。在本研究中，我们通过在受体结合结构域中或其周围产生一系列突变体以探究H5HA是否可能通过突变轻易地适应于人而4企验了H5病毒的结合和进入条件，其中已知所述的突变在改变Hl血清型中的受体特异性。我们在HA分子中涉及受体特异性的位置处鉴定了氨基酸差异性。分析了Hl血清型和H5血清型之间的结构差异性和遗传差异性，因为它们似乎比H3HA在结构上更密切地相关。我们的结论是在H1框架上造成禽型转变至人型特异性的突变也可以在H5禽框架上造成特异性的转变，从而导致进入人细胞。参考表4，本发明的实施方式是包含至少一种突变的H5禽流感框架，其中所述的突变选自由S136T、E190D、E190N、E190G、K/R193S、K/R193A、K/R193T、K/R193N、L194I、L194F、R216E、S221P、K222W、G225D、G225N、Q226R、Q226L、S227A、S227H、S227P、S227E、S227N和G228S所组成的组中。因此，此类突变提供了一种可能途径，通过该途径H5病毒能在人群体中贏得立足点。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>aA/越南/CL01/2004例外，第190位置是D。bA/Dk/HN/303/2004例外，第193位置是S。三重突变体HA流感病毒进入由其刺突糖蛋白即病毒血凝素(HA)介导，血凝素也是由预防性疫苗激发的保护性中和抗体的靶。H5N1禽流感病毒在结合细胞受体-唾液酸(SA)后进入细胞，其中所述的唾液酸在禽宿主中表现与半乳糖的a-2，3连接。相反，人适应型病毒偏好地利用增加上呼吸道中细胞感染的具有a-2，6连接的SA，这促进人传播。这里，我们定义了禽H5N1HA中提高其对人受体的亲和力的突变，并且证明这些变化改变了HA对中和抗体的敏感性。结构性和分子遗传信息允许鉴定到受体结合结构域中增强人细胞进入作用超过IOO倍的位点，并且凝集素抑制法揭示了受体特异性的转变。限于所述受体结合结构域内的3个点突变，偏好人的HA对抗H5中和抗体具有约10倍的更高抗性。这些突变使得所述HA对H5中和性单克隆抗体不敏感；然而，鉴定到另一种可以中和前述两种HA的单克隆抗体。H5HA对利用人受体的适应因此改变抗体敏感性，同时它改变受体特异性。这些研究结果提示禽流感病毒的适应性突变可能使得现有疫苗效力更低。然而，这类修饰的HA为治疗性抗体以及为新型预防性疫苗提供免疫原，其中所述的预防性疫苗预期在天然人适应型H5N1抹出现之前开发出来。由具有改变的受体结合特异性的禽H5流感病毒血凝素突变体进行免疫HA中的受体结合结构域(RBD)由位于病毒刺突蛋白顶端外表面上的少于300个氨基酸组成(Gamblin，S丄等2004科学(Science)303:1838;Skehel，JJ.和Wiley,D.C.2000生物化学年度评论(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科学(Science)303:1866;Steven、J.等2006科学(Science)312:404;Wilson，LA.等1981自然(Nature)289:366)。SA结合作用由以两条脊作为边界的腔体(图4A)介导，所述的腔体由环220(第221位至第228位氨基酸)、环130(第135位至第138位氨基酸)和在第190位至第197位氨基酸处的螺旋状结构域(编号基于H3A/Aichi/2/68)(Wilson，I.A.等1981自然(Nature)289:366)组成。先前已经描述了Hl、H5和H3HA的结构(Gambling,S丄等2004科学(Science)303:1838;Shekel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化学年度评论(AnnuRevBiochem)69:531;Steven、J.等2004科学(Science)303:1866;Steven、J.等2006科学(Science)312:404;Wilson,I.A.等1981自然(Nature)289:366),并且Hl和H5RBD彼此显示的结构和遗传相似性高于与H3的结构和遗传相似性(图4A)。为定义改变受体识别作用的突变，我们着眼于识别a2，6-SA连接的H5和Hl(A/南加利福尼亚/l/18)之间的差异，尤其第190、193和225位氨基酸(图4B)。产生了创造假病毒的单个或组合突变，其中在特定位置上由氨基酸的单字母代码描述的氨基酸被替换，如在位置190内的天冬氨酸被谷氨酸替换置换(E190D)。我们也使用先前提示增加a2，6识別的突变Q226L，G228S(Steven、J.等2006科学(Science)312:404)。这些HA的表面表达通过流式细胞术证实(图5A),和假型慢病毒载体在神经氨酸酶(NA)共转染后产生。用萤光素E190D、K193、G225D三重突变体病毒显示类似于野生型HA的进入(图5C),证实该突变体病毒的功能完整性；然而，受体特异性不可能通过这种方式定义。不同HA的SA特异性由改良聚糖微阵列法(Steven、J.等2006NatRevMicrobiol4:857)和再唾液酸化HA测定法(Paulson,J.C.和Roger、G.N.1987酶学方法《MethodsEnzymol》138:162)分析。对于聚糖阵列，HA随NA共表达并加以纯化(Steven、J.等2004科学(Science)303:1866)。与野生型蛋白相比，E190D、K193S、G225D突变取消了对绝大多数a2,3-连接的底物的识别(图6,A与B)。再唾液酸化HA测定法证实所述三重突变体中a2,3-SA识别作用的丧失和ot2，6结合作用的缺乏(表5A),该情况也在Q226L、G228S中见到。对先前所述突变体的分析(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)也显示无a2,6-SA识别作用(表5B)。最后，我们鉴定到提高a2，6-SA识别作用的突变(表5C),尤其改变了130环和190螺旋的S137A/T192I变体。这种改变的特异性在聚糖微阵列中得到证实(表6)。这些突变代表HA可以藉此调节其底物识别作用的替代形式；在最后提到的例子中，所述突变提高2，6-SA结合作用至与人适应型流感病毒更相似(尽管不相同)的程度。具有改变的受体特异性的HA之间的免疫原性及抗原性差异通过用野生型或三重突变体HA接种小鼠并产生单克隆抗体(mAbs)进行分析。每种mAb以差异的特异性识别与NA共表达的突变HA或野生型HA(图7A)。一抹有效的H5特异性mAb9E8中和野生型H5,但是显出针对三重突变体假病毒的显著降低活性(图7B，左侧)。与之相对，第二主这种单克隆10D10以最大抑制浓度同等地中和突变HA或野生型HA，尽管在中间浓度上观察到较小差异(图7B,中间)。在用三重突变体表达载体免疫后分离的第三mAb9Bll显示相反的特异性，抑制所述三重突变体，但不影响野生型H5假病毒(图7,B和C,右边)。最终，尽管9E8中和野生型HA的效力比中和S137A/T192I变体的效力更高，另一种抗体11H12显示对这两者的可比较活性(图7D)，从而证实该突变体的差异抗原性。对SA结合特异性的修饰因此改变中和敏感性并促进可激发有效中和性mAb的疫苗的产生。在本报告中，我们鉴定到禽H5血凝素中改变其SA受体特异性的突变并中和敏感性用先前证实可定义众多病毒进入机制的慢病毒进入测定法确定，其中所述的众多病毒包括HIV、严重急性呼吸综合症(SARS)病毒、埃博拉和马尔堡出血热病毒和最近包括流感病毒(Li，W.等2003自然(Nature)426:450;Yang,Z.等1998科学(Science)279:1034;Yang,Z,Y.等2004病毒学杂志(JVirol)78:5642)。抗体抑制作用决定中和敏感性(实施例1;Kong，W.-R等2006美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)并与血凝抑制作用(免疫保护作用的一种传统标志)(表7)(Kong,W.P.等2006美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。用这种方法，无需为产生可复制性病毒所要求的分子适应过程，4企验了所述HA的特异性，这可以鉴定到具有改变的SA特异性的几种突变体。最近已经定义了恶其它突变体，它们的识别作用以特异性更低的测定法评价(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)，并且我们发现这些突变体在HA测定法中没有获得a2,6-SA识别作用(表5B;N186K,Q196R)。先前报道的Q226L，G228S突变体(Steven、J.等2006科学(Science)312:404)也不显示a2,6-SA结合作用(表5A)。因此先前报道的HA突变体不太可能是人适应性的，尽管本文的S137A，T192I可以代表该途径中的一个步骤。仍未知a2,6-SA特异性的获得是否将增加H5Nl传染性。最近，证实1918病毒中导致人SA识别的HA突变增强在雪貂中的传染作用(Tumpey,T.M.等2007科学(Science)315:655)，这支持这种观念并且提供了评价此类H5突变体的模型。合理设计人适应型H5特异性疫苗的方法促进了此类分析，以及促进开发先期对抗手段以对抗流感暴发。HA的五个主要抗原位点位于靠近RBD的可接近表面(Skehel,J丄和Wiley，D.C.2000生物化学年度评论(AnnuRevBiochem)69:531;Wiley，D.C.等1981自然(Nature)289:373;Kaverin,N.V.等2002普通病毒学杂志(JGenVirol)83:2497)。尽管针对该区域的抗体可以影响RBD特异性和中和敏感性(Skehel，J丄和Wiley,D.C.2000生物化学年度评论(AnnuRevBiochem)69:531,Laeeq,S.等1997病毒学杂志(JVirol)71:2600;Ilyushina，N.等2004病毒学月刊(Virology)329:33;Bizebarb，T.等1995自然(Nature)376:92;Fleury,D.等1999天然结构生物学(NatStructBiol)6:530)，不过仅在RBD中的变化还未证实可改变免疫原性。这里，基于结构对RBD特异性的修饰促进mAb的产生，而不依赖于所述主要抗原位点。针对功能性约束结构域的这些抗体可以较不容易地发生抗性并且充当这样的疫苗原型，其中所述疫苗原型拟在人适应兴毒抹出现之前进行开发。单克隆抗体9B11、10D10、9E8和11H12在历经长期有关多克隆抗体的科学研究后，1975年发展的单克隆抗体产生方法当然是巨大的技术跃进。单克隆抗体对于众多任务而言是极有价值的，这些任务包括分析、表征和纯化其对应抗原。单克隆抗体对靶标的敏锐特异性使它们成为药物用途的突出候选物。然而，杂交瘤必须在实验动物而非人中产生的事实使得杂交瘤产生的单克隆抗体作为人治疗物具有限用途。得自小鼠的抗体具有被人免疫系统识别为外来物的序列，并且因此在施用至人时产生强烈且潜在破坏性的免疫应答。对抗体结构的常年仔细研究导致这个方面的明显进展。在1983,嵌合抗体的改变变成现实。在嵌合抗体中，使用重组DNA技术将小鼠单克隆抗体或其它非人类单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区("供体")连接至人抗体的重链恒定区和轻链恒定区。这极大地降低了抗体在人中的潜在免疫原性，同时保留其特异性。稍后几年出现下一代技术突破一一"人源化"。在"人源化，，抗体中，仅3个CDR(互补决定区)和有时来自每个供体抗体可变区的几个仔细选择的"框架区"残基(可变区的非CDR部分)重组地黏附至人抗体序列的对应框架区和恒定区。最近，该领域已经发展多种方法来产生"完全人"抗体例如通过产生来自经遗传修饰仅具有人员抗体基因的小鼠的杂交瘤或通过从人衍生抗体基因的噬菌体展示文库中选择而产生。然而，另一种变体结构时单《连Fv或"scFv，，，其中单克隆抗体的轻链可变区通过接头序列重组地融合于抗体重链可变区。如本文中所用，"特异性结合，，指单克隆抗体结合对应抗原的属性，其中任意的单克隆抗体9B11、IODIO、9E8或11H12以如此亲和力与所述对应抗原结合，所述的亲和力比该克隆抗体对除所述对应抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少2倍、50倍、100倍、1000倍或更高倍。如本文中所用，术语"抗体"指包含至少一种和优选两种重(H)链可变区(本文中缩写为VH)以及至少一种及优选两种轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)的蛋白质。所述VH和VL区可以进一步再分成称作"互补决定区"("CDR")的超变区，该超变区间插以称作"框架区域"(FR)的更保守区域。所述框架区域和CDR的范围已经精确定义(见Kabat,E.A.,等(1991)免疫学目的蛋白质的序列，第五版，美国卫生与福利署，NIH出版编号91-3242(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanService、NIHPublicationNo.91-3242)和Chothia，C等(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196:901-917)。优选地，每个VH和VL由从氨基端至羧基端以如下顺序排列的三个CDR和四个FR组成FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。抗体的VH或VL链可以还包括全部或部分的重链或轻链恒定区。在一个实施方式，所述抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中所述免疫球蛋白重链和轻链由例如二硫键彼此连接。所述重链恒定区由三个结构域Cffl、CH2和CH3组成。所述轻链恒定区由一个结构域CL组成。所述重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区一般介导该抗体对宿主组织或因子的结合，所述的宿主组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞)及经典补体系统的第一成分(Clq)。术语"抗体"包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(以及其亚型)型完整免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的轻链可以是K或X型。如本文中所用，术语"免疫球蛋白，'指由基本上免疫球蛋白基因所编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。已识别的人免疫球蛋白基因包括K、la(IgAl和lgA2)、y(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、5、s和ii恒定区基因，以及繁多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白"轻链"(约25Kd或214个氨基酸)在氨基端处由可变区基因编码(约110个氨基酸)并且在氣基端处由K或人恒定区基因编码。全长免疫球蛋白"重链"(约50Kd或446个氨基酸)类似地由一个可变区基因(约116个氨基酸)和前述其余恒定区基因之一例如y(编码约330个氨基酸)编码。术语"免疫球蛋白"包括这样的免疫球蛋白，其具有CDR,其来自非人类来源，例如来自非人类抗体，例如非人类抗体，例如小鼠免疫球蛋白或另一种非人类免疫球蛋白，来自共有序列或来自通过噬菌体展示法或产生多样性的任何其它方法所产生的序列；并具有这样的框架，其在人中比非人类框架区具有更少抗原性，例如在来自非人免疫球蛋白的CDR的情况下，比来自所述非人类CDR从中取得的非人类框架具有更少的抗原性。所述免疫球蛋白的框架可以是人、人源化非人类(例如小鼠)框架，其中将所述的框架修饰以减少在人中的抗原性，或合成性框架区，例如共有序列。这些抗体在本文中有时称作修饰的免疫球蛋白。修饰的抗体或其抗原结合片段包括至少一条、两条、三条或四条修饰的免疫球蛋白链，例如至少一条或两条修饰的免疫球蛋白轻链和/或至少一条或两条修饰的重链。在一个实施方式，所述修饰的抗体是两条修饰的免疫球蛋白重链和两条修饰的免疫球蛋白轻链的四聚体。如本文中所用、"同种型"指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgGl)。术语抗体的"抗原结合片段"(或筒单称作"抗体部分"或"片段")，如本文中所用、指特异性地与目的抗原结合的抗体部分，例如这样的分子，其中一条个或多条免疫球蛋白链不是全长的，但是特异性地与目的抗原结合。在术语抗体的"抗原结合片段"中包含的结合片段实例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)Fv片段，其由抗体的单条臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb片段(Ward等、(1989)自然(Nature)341:544-546)，其由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR),具有足够框架以特异性结合例如可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，例如，Fv片段的两个结构域VL和VH可以使用重组方法例如通过合成接头加以联接，其中所述的合成接头能够使所述两个结构域作为单一蛋白链产生，其中VL区和VH配对以形成单价分子(称作单链Fv(scFv);见，例如Bird等(1988)科学(Science)242:423-426;和Huston等(1988)美国科学院院报(ProcNatl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。术语抗体的"抗原结合片段，，意图包食此类单链抗体。使用本领域技术人员抑制的常规技术获得这些抗体片段，并且对所述片段如完整抗体那样相同的方式筛选用途。术语"单特异性抗体"指对特定靶如表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。本术语包括"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"，其如本文中所用，指单一分子组合物的抗体或其片段的制备物。术语"重组"抗体，如本文中所用，指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体、从对人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或通过任何其它方法制备、表达、产生或分离的抗体，其中所述的任何其它方法涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列。此类重组抗体包括人源化、CDR接枝、嵌合、(例如通过噬菌体展示)体外产生的抗体，并且可以任选地包含源自人种系免疫球蛋白序列的恒定区。在优选的实施方式中，我们提供单特异性抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合片段。所述抗体(例如重组或修饰的抗体)可以是全长的(例如IgG(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(例如IgAl、IgA2)、IgD和IgE,不过优选IgG)或可以仅包括抗原结合片段(例如Fab、F(ab')2或scFv片段、或一个或多个CDR)。抗体或其抗原结合片段可以包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链，或可以是单链抗体。所述抗体可以任选地包含选自的恒定区k、人、a、y、S、s或ii恒定区基因。优选的抗体包括基本上来自人抗体例如人IgGl恒定区或其部分的重链和轻链恒定区。在一些实施方式中，所述抗体是人抗体。抗体(或其片段)可以是鼠类或人抗体。可以使用的优选单克隆抗体的实例包括9B11、IODIO、9E8和11H12抗体。本发明的范围也包括使用如此抗体或其抗原结合片段的方法和组合物，其中所述的抗体结合本文所披露抗体的重叠表位或竟争性地抑制本文所披露抗体与对应抗原的结合，例如这样的抗体，其结合单克隆抗体9B11、IODIO、9E8或11H12的重叠表位或竟争性抑制所述单克隆抗体与对应抗原的结合。可以使用任意的抗体组合，例如结合至对应抗原不同区域的两种或更多种抗体，例如结合至对应抗原的两种不同表位的抗体。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合至本文所述抗体例如9B11、IODIO、9E8和11H12的全部或部分表位。所述抗体可以抑制，例如竟争性地抑制本文所述抗体例如9B11、IODIO、9E8和11H12抗体与对应抗原的结合。抗体可以结合至这样的表位，例如空间表位或线性表位，其中所述表位在被结合时阻止本文所述的抗体如抗体9B11、IODIO、9E8和11H12的结合。所述表位可以在空间上非常接近于或在功能上相关于或在构象上非常接近于抗体9B11、IODIO、9E8和11H12识别的一个表位，例如线性序列中的重叠或相邻表位。在其它实施方式中，抗体(或其片段)是重组或修饰的抗体，所述抗体选自例如嵌合、人源化、或体外产生的抗体。如本文中所讨论，修饰的抗体可以是CDR接枝抗体、人源化抗体或更一般地是具有来自非人类抗体的CDR和如此框架的抗体，其中所述的框架因在人中较低的免疫原性而选择，例如其免疫原性比其中天然存在鼠类CDR的鼠类框架更低。在一个实施方式中，修饰的抗体是抗体9B11、IODIO、9E8或11H12的人源化形式。在另一个方面，本发明以用于预防或治疗流感病毒感染的组合物为特征。所述组合物包含如本文中所述的抗体或其抗原结合片段。本发明的组合物还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。如本文中所述的抗体或其抗原结合片段可以全身地施用至受试者(例如静脉内、肌内、通过输注(例如使用输注装置)、皮下、经皮或通过吸入)。在抗体或其抗原结合片段是小分子的那些实施方式中，可以口服地施用抗体。在其它实施方式，将抗体或其抗原结合片段局限地(例如局部)施用至受累区域，例^口p乎吸道。受试者可以是哺乳动物，例如灵长类，优选高级灵长类，例如人(例如患有流感病毒感染或有此风险的患者)。在另一方面，本发明以用于体外检测样品(例如生物样品，如血浆、组织活抬r样品)中对应抗原存在性的方法为特征。所述组合物包含如本文中所述的抗体或其抗原结合片段。本发明的组合物还可以包含药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。所述主题方法可以用来评价例如流感病毒感染的诊断或阶段。该方法包括(i)使所述样品(和任选地，参考，例如对照样品)与抗体或其触；并且(ii)检测复合物在所述抗体或其抗原结合片段与该样品(和任选地，参考，例如对照样品)之间的形成。所述复合物的形成表示存在对应抗原，和可以指示本文中所述治疗的适用性和需要。例如，相对于对照样品，样品中所述复合物形成的统计显著变化表示该样品中存在所述对应抗原。在又一个方面，本发明提供用于体内检测受试者对应抗原存在性的方法(例如受试者中体内成像)。所述主题方法可以用来评价受试者例如哺乳动物，例如灵长类例如人中流感病毒感染的诊断或阶段。该方法包括(i)将抗体下施用至受试者(和任选地，参考，例如对照受试者)；并且(ii)检测复合物在所述抗体或其抗原结合片段与对应抗原之间的形成。相对于所述参考例如对照受试者或受试者的基线，该受试者中所述复合物形成的统计显著变化表示存在所述对应抗原。'优选地，抗体或其抗原结合片段直接或间接地用可检测物质标记以促进检测结合及未结合的物质。合适的可检测物质包括多种有生物活性的酶、辅基、荧光材料、发黄材料、顺磁性(例如核磁共振活性)材料和放射性材料。在一些实施方式中，抗体或其片段偶联于放射性离子，例如铟(11In)、碘(1311或1251)、钇(90Y)、镥(177Lu)、僻(225Ac)、铋。2Bi或犯Bi)、硫(35S)、碳("C)、氚(3H)、铑(188Rh)、锝("mTc)、镨或磷(32P)。实施例1所用的Genbank登录号是AY651364、AY555150、DQ868374和DQ868375。免疫原和质粒构建编码H5N1(KAN-l)(Genbank登录号AY555150)血凝素的质粒先前已经描述(W.-RKong等2006美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)l03:15987)并且使用人偏好性密码子加以合成(GeneArt，德国雷根斯堡)。该序列已经提交至GenBank，登录号DQ868374。使用如文中所述的快速变化(QuickChange)试剂盒(Stratagene,拉荷亚(LaJolla)，加利福尼亚(CA))通过位点定向诱变制备突变的HA。蛋白质表达通过蛋白质印迹分析法证实(W.P.Kong等2003病毒学杂志(JVirol)77:12764)。DNA接种中所用的免疫原含有如前所述(W.-P.Kong等2006美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA):15987)(Genbank登录号DQ868375)变成PQRETRG(SEQIDNO:4)的裂解位点突变(PQRERRRKKRG(SEQIDNO:3)。该修饰也称作"mut.A"。表达分泌型三聚体形式HA和三重突变体HA(E190D/K193S/G225D)的质粒通过将含有如上所述述切割位点突变的HA的第1-518位氨基酸与如所述的IDNO:5)融合而产生(J.Stevens等2006科学(Science)312:404)。该修饰也称作"短"和"折叠子"，因为它不仅含有三聚化位点，并且此融合导入HA蛋白在跨膜结构域上游羧基末端10个氨基酸的截短。质粒编码Nl(KAN-l)(Genbank登录号AY555150)也使用人偏好性密码子合成(基因技术(GeneArt)，德国雷根斯堡)。接种6-8周龄雌性BALB/c小鼠(杰克森实验室(JacksonLabs))如前述进行免疫(Z,Y.Yang等2004自然(Nature)428:561)。简而言之，小鼠用100|ilPBS(pH7.4)中的15吗质粒DNA以肌内方式在第0、3、6周免疫三次，仅用于DNA免疫或用于初免-加强接种以产生中和性单克隆抗体，随后用表达相同抗原的101()个重组腺病毒(rAd)颗粒在第8-10周进行额外加强免疫。血清在最后接种10日后收集。雪貂类似地进行免疫，除了使用200昭质粒DNA以外。细胞系、抗体、凝集素和唾液酸类似物-人胚肾细胞系293T、293A和293F从英杰(Invitrogen)(卡尔斯巴德(Carlsbad),CA)购买，分别作为病毒生产者和作为感染的靶细胞或用于蛋白质产生。它们先前已经得到描述(Z,Y.Yang等2004病毒学杂志(JVirol)78:5642)。兔抗HA(H5N1)IgG,人免疫4支术(ImmuneTechnology)(纽约皇后区(Queens,NY))购买。兔抗p24(HIV-l)抗血清从ABI(Columbia,MD)获得。山槐(Maackiaamurensis)凝集素II(MAA)、紫云接骨木(Sambucusnigra)凝集素(SNA)、生物素化MAA或SNA以及FITC标记链霉抗生物素蛋白来自载体实验室(VectorLaboratories)(伯4木盖姆(Burlingame)，力口利一畐尼亚(CA))。抗H5小鼠单克隆抗体的产生雌性BALB/c小鼠用质粒DNA免疫三次，随后用表达相同抗原的1010个颗粒加强免疫。加强免疫后3日，将脾脏从所述小鼠中收获，匀浆成单个细胞混悬液，使用聚乙二醇与作为伴侣的骨髓瘤融合，并且在洛夫斯特瑞德实验室(LofstrandLabs)(盖塞斯堡(Ga他ersburg),马里兰州(MD))于如前所述含HAT的培养基中选择杂交瘤(G.Kohler和CMilstein1976欧洲免疫学杂志(EurJImmunol)6:511;S.N.Iyer等1998高血压(Hypertension)31:699)。产生目的抗体的杂交体用ELISA进行篩选，并且假型中和测定法如前所述进行(W.-P.Kong等2006美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)103:15987)。分离到显示强烈中和作用的三个克隆10D10、9E8和9B11,并且随后使它们适应于乌发血清培养基。具有中和活性的另一个克隆克隆11H12从后续融合中分离并且也用来表征S137A,T1921突变体。使用HiTrap蛋白G亲和柱(阿莫仙(Amersham)，皮斯卡塔韦(Piscataway),新泽西(NJ))从无血清细胞培养基纯化小鼠单克隆抗体。三聚体HA蛋白的产生和纯化使用含有或不含有1/10比例NA(KAN-1)表达载体(重量:重量)的293转染试剂(fectin)(Invitrogen，Carlsbad,CA),将表达分泌型三聚体HA和HA(E190D/K193S/G225D)的质粒转染至293F细胞。在转染72-96小时后，将细胞培养上清液收集、通过离心澄清、过滤并使用Ni琼脂糖(Sepharose)TM高效亲和柱(通用电气医疗集团(GEHealthcare),Piscataway,新泽西(NJ))纯化，如前所述(J.Stevens等2006科学(Science)312:404)。将级分合并并进行离子交换层析(单-Q(mono-Q)HR10/10，通用电气医疗集团(GEHealthcare),皮斯卡塔韦(Piscataway,NJ))和凝胶过滤层析(Hiload16/60Superdex200pg，GEHealthcare,Piscataway，NJ)。将含有三聚体的级分合并，并对PBS透析。HA和a2，3及a2，6唾液酸的表面染色使用脂质体转染试剂Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)，以表达野生型和H5突变体的质粒共转染293T细胞。转染24小时后，将细胞使用含2mMEDTA的PBS取出、收集和并以PBS洗涤。细胞用小鼠抗HA[H5N1(KAN-1)]血清(图5A;黑色线，1:200)或免疫前血清对照(图5A,灰色线，1:200)染色。或者，以O.lw/w比的NA(KAN-l)共转染的细胞与单克隆抗体(9E8、IODIO、9B11)(图7A;黑色线，5pg/ml或同种型对照(图7A，灰色线，5|ig/ml)在冰上孵育30分钟、洗涤并且与AlexaFluor488-山羊抗小鼠IgG(Invitrogen,Carlsbad,CA)(1:2000)在冰上孵育。将样品洗涤并使用FACSCalibur流式细胞仪(FlowCytometer)(碧迪公司(BD)，弗兰克林湖(FranklinLakes),NJ)进行分析。对于a2,3-和a2,6-SA的表面染色(图5B),如上所述收集和分析293A细胞。与生物素化MAA(10|ig/ml)或生物素化SNA(10pg/ml)在冰上孵育30分钟后，将细胞洗涤并与FITC标记链霉抗生物素蛋白(10吗/ml)在水上孵育30分钟。假型慢病毒载体的产生表达萤光素酶报道基因的重组慢病每载体如前所述产生(L.Naldini等1996美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382)。简而言之，使用磷酸钓转染试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA),将10cm培养皿中的293T细胞用400ng的H5HA或HA突变体、50ng的NANA(H5N1/KAN-1)表达载体、7ng的pCMVAR8.2和7吗的pHR/CMV-Luc质粒共转染过夜，随后用新鲜培养基恢复。48小时后，将上清液收获、经过滤0.45pm注射式滤器过滤，等份贮存并立即使用或冻存在-80。C。病毒输入量通过所述病毒制备物中p24的量加以标准化。使用HIV-1p24抗原测定试剂盒(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter),富尔敦(Fullerton),CA)测量来自不同病毒原液的p24水平。在浮力密度离心后，使用蛋白质印迹分析法证实对这些制备物中HA表达的分析，并且水平变化不超过l-2倍。用假型慢病毒载体感染细胞将总计30,000个293A细胞在感染前一日铺种在48孔培养皿的每孔内。细胞以三复孔lOOjxl病毒上清液/孔与HANA假型病毒聘育14-16小时病毒上清液在此时间结束时更换为新鲜培养基，并且使用"哺乳动物细胞裂解緩冲液"和"萤光素酶测定试剂"(普洛麦格(Promega)，麦迪逊市(Madison)，威斯康辛(WI))根据制造商方案，在48小时后如前所述测量萤光素酶活性(Z.-Y.Yang等2004病毒学杂志(JVirol)78:5642)。通过小鼠抗血清和单克隆抗体抑制HANA假病毒进入首先通过连续稀释法滴定编码萤光素酶的HANA假型慢病毒载体。随后将相似量的病毒(p246.25ng/ml)与所示量的小鼠抗血清或单克隆抗体在室温孵育20分钟并且添加至293A细胞(10,000个细胞/孔在96孔培^m)(50pl/孔，三复孔)。将平板洗涤并在6小时候更换为新鲜培养基。24小时候，测量荄光素酶活性。血凝素的聚糖阵列分析通过将15(ilHA和7figAlexaFluor488标记小鼠抗5xHis(凯杰(Qiagen),目录号1019199)以2:1摩尔比在总体积50^1中混合而制备HA-抗体复合物，并将该混合物在水上孵育15分钟。所述预复合物随后用含有3%(w/v)牛血清白蛋白和0.05%吐温(Tween)20的50微升PBS稀释。等份的所述稀释预复合物施加至盖玻片下的微阵列(version3.0)并在黑暗、湿化室内在室温孵育1小时。将盖玻片柔和地取下并且此盖玻片随后在含0.05。/oTween-20的PBS、PBS和去离子水中连续淋洗。为除去过多的水，此盖玻片在盖玻片微型离心机中离心30秒，并且结合图像在微阵列扫描仪(ProScanArray，珀金埃尔默(PerkinElmer))内读取。使用Imaenev.6软件(生物探索(BioDiscovery),埃尔塞贡多(ElSegundo),CA)开展图像分析，并且结果文件以Excel格式生成，其中在消除最高值或最低值后，将源于每种聚糖(表8)6个重复的相对荧光(RFU)报道为n=4的平均数。数据上载至互联网上网址fimctionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp处的功能'l"生外唐类协会组数据库(ConsortiumforFunctionalGlycomicsDatabase)。H5N1和测量受体特异性的其它假病毒的血凝作用鸡RBC(CRBC)和酶修饰CRBC的血清作用如前所述进行(L.Naldini等1996美国科学院院报(ProcNatlAcadSciUSA)93:11382;LGlaser等2005病毒学杂志(JVirol)79:11533;T.GKsiazek等2003新英格兰医学杂志(NEnglJMed)348:1953;J.CPaulson和G.N.Rogers1987酶学方法《MethodsEnzymol》138:162)。为产生SAa2,3Gal或a2，6Gal再唾液酸化的CRBC,将0.6ml的10%(v/v)新鲜制备的CRBC(创新研究(InnovativeResearch),南田(Southfield),密歇根州(MI))用10mlPBS(pH7.4)洗涤三次并且用处理200mU霍乱弧菌(vibviocholerae)神经氨酸酶(罗氏(Roche),印第安纳波利斯(Indianapolis),印第安纳州(IN))在37。C处理1小时。用1mlPBS洗涤三次后，将细胞重悬于1mlPBS中，与20mU的a2,3(N)-唾液酸转移酶(卡尔生物化学(Calbiochem),LaJolla，CA)在37。C孵育30分钟；或在1.5mlPBS中与Dr.JamesPaulson博士(斯克瑞普斯研究机构(ScrippsResearchInstitute))友好提供的4.5mU的a2，6(N)-唾液酸转移酶外加1.5mMCMP-SA(西格玛(Sigma)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(MO))在37。C將育45分钟。再唾液酸化的CRBC在用PBS洗涤3次后以0.5%(v/v)重悬于PBS中。神经氨酸酶处理的CRBC也在再唾液酸化之前与假型病毒载体孵育并且均匀地显示《1:2的滴度。为通过血凝作用测量假病毒的结合活性，将PBS中的5(^11:5稀释的H5N1假病毒添加至96孔圓底平板，并且进行2倍连续稀释。分别添加50pi10.5%CRBC、a2，3或a2,6再唾液酸化CRBC,并将它们与病毒混合。60分钟后通过目视检查法确定HA滴度。表5.野生型和突变体HA的聚糖识别作用的特异性和进入效率<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如实施例1中所述使用来自泰国的H5突变体KAN-1或来自越南的VN1203和VN1194。通过再唾液酸化血凝试-险(实施例1)对(A)丧失a2,3HA活性的KAN-1突变体和相关对照、(B)VN1203和先前描述的VN1194突变体(Yamada，S.等2006自然(Nature)444:378)和(C)a2，6-SA结合作用提高的KAN-1突变体测定所示HA结合a2,3-或a2，6-SA的能力。野生型和突变布支型慢病毒载体的病毒进入过程如所述进行测量(实施例1)。进入程度如下+，<WT的25%;++,WT的25-50%;+++，WT的50-75%;++++，>WT的75%。本文的H5(KAN-l)与所述GenBank序列相同，并且与源自Yamada和合作者(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)的序列在第186位氨基酸(N/K)处不同于，并且VN1194突变体根据替代性编号习惯与N182K和Q192R(Yamada,S.等2006自然(Nature)444:378)相同。表6通过聚糖微阵列分析，与野生型相比S137A、T192I的聚糖结合作用差异的汇总表<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>上表显示如聚糖微阵列测定法确定的S137A，T192I相对于野生型(wt)的化学结构、连接和结合作用。聚糖阵列如图6中所述进行，从而对于绝大多1^物观察到在线性范围内的结合作用(50%最大结合作用)。通过将S137A,T1921突变体的相对荧光单位(RFU)从对照的RFU中扣减而进行差异分析。所述差异除以对照并且乘以100以获得代表相对于对照数据的阳性或阴性变化的百分比。针对三个群体呈现结果，包括含有Neu5Aca2-6GalNAc(31-4的9种不同结构，与对照相比，其中7种结构显示因突变所致的结合作用明显阳性增加；带有与聚乳糖胺连接的岩藻糖的四种化合物，它们显示明显更高的S137A,T192I结合作用；并且6种a2-3和a2-6SA,其相对于S137A，T1921,显示更高的野生型结合作用。总之，这些分析证实了与野生型H5KAN-1HA相比，S137A,T192I增强的a2-6识别作用和改变的受体结合结构域(RBD)特异性。表7:通过不同测定法测定的接种动物的中和性抗体应答KAN-1VN(1203)VN(1203)KAN-1慢病毒动物免疫原载体血凝抑制微量中和法抑制作用(IC80)雪貂1HA3xDNA+rAd40404202HA3xDNA+rAd160201557HA3xDNA+rAd>2560>2560198794HA3xDNA+rAd804012515HA3xDNA+rAd>2560>2560171866HA3xDNA+rAd160805627对照载体3xDNA+rAd101008对照载体3xDNA+rAd10100小鼠1HA蛋白质320NDl卯42HA蛋白质640ND13673HA蛋白质640ND3457<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>通过多种方法评1介源自个体雪貂或小鼠组的血清，其中所述的雪貂和小鼠用由单独DNA编码的H5KAN-IHA、DNA加rAd(重组腺病毒)或纯化的KAN-IHA蛋白免疫。血凝抑制和微量中和试验用如前所述的rgA/越南A203/2004xA/PR8/34重组4朱病毒VN(12(B)(J.J.Treanor等2006新英格兰医学杂志(NEnglJMed)354:1343)(南方研究院，伯明翰，阿拉巴马州(SouthernResearchInstitute,Birmingham,AL))进行。在上表中显示终点稀释度。使用A/泰国/KAN-112004HA慢病毒载体的慢病毒抑制试验如实施例1中所述进行。显示了具有IC80活性的血清的稀释度。Mab指图7中所述的小鼠单克隆抗体。所述单克隆抗体的IC80基于纯化IgG的浓度进行计算。ND表示样品没有进行测定。200780041962.X转溢齿被62/685x表8由微阵列分析的聚糖的化学结构和命名<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>化学结构和连接、命名以及如前所述(J.Stevens等人.2006科学(5We"")312:404)表明的参考毒抹的结合得到显示，为图6中所示的野生型(wt)和三重突变HA提供了参考。符号象征是白色圆形(Gal)、黑色圆形(Glc)、黑色三角形(Fuc)、白色方形(GalNAc)、黑色方形(GlcNAc)、黑色菱形(唾液酸)、灰色圆形(人)以及白色菱形(N-乙醇酰基唾液酸(N-glycolylsialicacid))。承**应当理解本文中所述的实施例和实施方式仅出于说明目的并且在其影响下作出的多种修改和改变将对本领域技术人员存在提示，并且应当包括在本申请的精神及范围和所附带任意权利要求的范围内。本文中提及的全部图、表和附录以及出版物、专利和专利申请因而通过引用的方式并入用于全部目的。权利要求1.分离或重组的血凝素(HA)多肽、所述多肽选自由以下项所组成的组中(a)具有SEQIDNO2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列编码的多肽，其中，所述的多核苷酸在高度严格性条件下与编码(a)、(b)或(c)的多核苷酸序列的基本上全长杂交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含与所述(a)、(b)或(c)中连续的至少约350个氨基酸、连续的至少约400个氨基酸、连续的至少约450个氨基酸或连续的至少约500个氨基酸基本上相同的氨基酸序列；和(f)H5HA多肽；其中所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突变，并任选包含T192除T之外的氨基酸的又一个突变。2.多肽，包含这样的序列，所述的序列对权利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少98%序列同一性、对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少98.5%序列同一性、对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99%序列同一性、对权利要求l中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.2%序列同一性、对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.4%序列同一性、对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.6%序列同一性、对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.8%序列同一性或对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.9%序列同一性。3.多肽，包含这样的序列，所述的序列对权利要求1中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少95%序列同一性。4.根据权利要求1所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。5.组合物，其包含权利要求1的一种或多种多肽。6.多肽，其特异性地由针对至少一种抗原产生的多克隆抗血清结合，所述抗原包含权利要求1的至少一种氨基酸序列。7.对权利要求1的多肽特异的抗体。8.免疫原性组合物，其包含免疫学有效量的权利要求1的多肽。9.根据权利要求1所述的多肽，其还包含至SEQIDNO:4的裂解位点的修饰。10.根据权利要求1所述的多肽，其还包含替代跨膜结构域的SEQIDNO:5的外部三聚区的氛基末端的修饰。11.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苦酸序列，并且所述多核苷酸序列选自由以下项所组成的组中(a)编码具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；(b)编码具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核香酸序列，或其互补多核苷S臾序列；(c)编码具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽的多核香酸序列，或其互补多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度严格性条件下与多核苷酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全长杂交；(e)编码多肽序列的多核苷酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)编码的多肽的片段，所述多肽包含这样的氨基,列，所述氨基酸序列与由(a)、(b)或(c)编码的所述多肽中连续的至少约350个氨基酸、连续的至少约400个氨基酸、连续的至少约450个氨基酸或连续的至少约500个氨基酸基本上相同；和(f)编码H5HA多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苦酸序列编码这样的多肽，所述多肽包含S137除S之外的氨基酸的突变，并任选包含T192除T之外的氨基酸的又一个突变。12.根据权利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。13.根据权利要求11所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。14.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苷酸序歹'J,并且所述多核苷I^f列对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少98%同一性、对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少98.5%同一性、对权利要求ll中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99%同一性、对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.2%同一性、对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.4%同一性、对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.6%同一性、对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核香酸具有至少99.8%同一性或对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.9%同一性。15.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷S^f列对权利要求11中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少95%同一性。16.根据权利要求11所述的核酸，其中，所述的多核香酸编码免疫原性多肽。17.组合物，其包含权利要求11的一种或多种核酸。18.免疫原性组合物，其包含免疫学有效量的权利要求11的核酸。19.载体，其包含权利要求11中所述的一种或多种核酸。20.根据权利要求19所述的载体，其中，所述载体包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。21.根据权利要求19所述的载体，其中，所述载体包括表达载体。22.细胞，其被权利要求19的载体所转导。23.用于在细胞培养中产生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括将权利要求19的载体导入宿主细胞；培养该宿主细胞；并且回收所述血凝素(HA)多肽。24.免疫原性组合物，其包含权利要求l的多肽。25.免疫原性组合物，其包含权利要求11的核酸。26.根据权利要求24或25所述的组合物，该组合物还包含赋形剂。27.根据权利要求26所述的组合物，其中，所述赋形剂是药学上可接受的赋形剂。28.预防性或治疗性治疗受试者中流感感染的方法，所述方法包括以产生针对所述流感感染的免疫原性应答的有效量，施用包含权利要求1的多肽的免疫原性组合物或包含权利要求11的核酸的免疫原性组合物至所述受试者。29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述组合物以有效预防性或治疗性治疗所述流感感染的量施用至该受试者。32.分离或重组的血凝素(HA)多肽，所述多肽选自由以下多肽所组成的组中(a)具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽；(b)具有SEQIDNO:82的氨基酸序列的多肽；(c)具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽；(d)由多核苷酸序列编码的多肽，其中所述的多核苷酸序列在高度严格性条件下与编码(a)、(b)或(c)的多核香酸序列的基本上全长杂交；(e)包含(a)、(b)或(c)的片段的多肽序列，所述多肽包含与所述(a)、(b)或(c)中连续的至少约350个氨基酸、连续的至少约400个氨基酸、连续的至少约450个氨基酸、或连续的至少约500个氨基酸基本上相同的氨基酸序列；(f)H5HA多肽；其中，所述多肽包含K/R193除K或R之外的氨基酸的突变和选自由以下突变所组成的组中的至少一种突变S136除S之外的氨基酸的突变、El卯除E之外的氨基酸的突变、L194除L之外的氨基酸的突变、R216除R之外的氨基酸的突变、S221除S之外的氨基酸的突变、K222除K之外的氛基酸的突变、G225除G之外的氨基酸的突变、Q226除Q之外的氨基酸的突变、S227除S之外氨基酸的突变和G228除G之外的氨基酸的突变。33.多肽，包含这样的序列，所述的序列对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少98%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少98.5%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.2%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.4%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.6%序列同一性、对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.8%序列同一性或对权利要求32中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多肽具有至少99.9%序列同一性。34.多肽，包含这样的序列，所述的序列对权利要求32中所述的(a)、(b)或'(c)的至少一种多肽具有至少95%序列同一性。35.根据权利要求32所述的多肽，其中，所述的多肽具有免疫原性。36.组合物，其包含权利要求32的一种或多种多肽。37.多肽，其特异性地由针对至少一种抗原产生的多克隆抗血清结合，所述抗原包含权利要求32的至少一种氨基酸序列。38.对权利要求32的多肽特异的抗体。39.免疫原性组合物，其包含免疫学有效量的权利要求32的多肽。40.根据权利要求32所述的多肽，其还包含至SEQIDNO:4的裂解位点的修饰。41.根据权利要求32所述的多肽，其还包含替代跨膜结构域的SEQIDNO:5的外部三聚区的羧基末端的修饰。42.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列选自由以下项所组成的组中(a)编码具有SEQIDNO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷S交序列；(b)编码具有SEQIDNO:82的氨基S吏序列的多肽的多核苦酸序列，或其互补多核香酸序列；(c)编码具有SEQIDNO:84的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；(d)多核苷酸序列，其在高度严格性条件下与多核苦酸序列(a)、(b)或(c)的基本上全长杂交；(e)编码多肽序列的多核香酸序列，所述多肽序列包含由(a)、(b)或(c)编码的多肽的片段，所述多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与由(a)、(b)或(c)编码的所述多肽中连续的至少约350个氨基酸、连续的至少约400个氨基酸、连续的至少约450个氨基酸或连续的至少约500个氨基酸基本上相同；和(f)编码H5HA多肽的多核香酸序列；其中，所述多核苷酸序列编码这样的多肽，所述多肽包含K/R193除K或R之外的氨基酸的突变和选自由以下突变所组成的组中的至少一种突变S136除S之外的氨基酸的突变、E190除E之外的氨基酸的突变、L194除L之外的氨基酸的突变、R216除R之外的氨基酸的突变、S221除S之外的氨基酸的突变、K222除K之外的氨基酸的突变、G225除G之外的氨基酸的突变、Q226除Q之外的氨基酸的突变、S227除S之外氨基酸的突变和G228除G之外的氨基酸的突变。43.根据权利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是DNA。44.根据权利要求42所述的核酸，其中，所述核酸是RNA。45.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷S臾序列对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少98%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少98.5%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.2%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苦酸具有至少99.4%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.6%同一性、对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.8%同一性或对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苷酸具有至少99.9%同一性。46.分离或重组的核酸，其包含编码血凝素(HA)多肽的多核苷酸序列，并且所述多核苷酸序列对权利要求42中所述的(a)、(b)或(c)的至少一种多核苦酸具有至少95%同一性。47.根据权利要求42所述的多肽，其中，所述多核苦酸编码免疫原性多肽。48.组合物，其包含权利要求42的一种或多种核酸。49.免疫原性组合物，其包含免疫学有效量的权利要求42的核酸。50.载体，其包含权利要求42的一种或多种核酸。51.根据权利要求50所述的载体，其中，所述载体包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒或人工染色体。52.根据权利要求50所述的载体，其中，所述载体包括表达载体。53.细胞，其被权利要求50的载体所转导。54.用于在细胞培养中产生血凝素(HA)多肽的方法，所述方法包括将权利要求50的载体导入宿主细胞；培养该宿主细胞；并且回收所述血凝素(HA)多肽。55.免疫原性组合物，其包含权利要求32的多肽。56.免疫原性组合物，其包含权利要求42的核酸。57.根据权利要求55或56所述的组合物，其还包含赋形剂。58.根据权利要求57所述的组合物，其中，所述赋形剂是药学上可接受的赋形剂。59.预防性或治疗性治疗受试者中流感感染的方法，所述方法包括以产生针对所述流感感染的免疫原性应答的有效量，施用包含权利要求32的多肽的免疫原性组合物或包含权利要求42的核酸的免疫原性组合物至所述受试者。60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。61.根据权利要求59所述的方法，其中，所述哺乳动物是人。62.根据权利要求59所述的方法，其中，所述组合物以有效预防性或治疗性治疗所述流感感染的量施用至该受试者。63.抗体或其抗原结合片段，其竟争性抑制选自由9B11、IODIO、9E8和11H12所组成的组中的单克隆抗体结合。64.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体.瘤细胞系产生。65.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体66.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含这样的轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由9E8的CDR的氨基酸序列所组成组中的至少一种CDR。67.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含这样的轻链可变区，所述轻链可变区包含选自由11H12的CDR的氨基S^列所组成组中的至少一种CDR。68.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含这样的重链可变区，所述重链可变区包含选自由9E8的CDR的氨基酸序列所组成组中的至少一种CDR。69.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含这样的重链可变区，所述重链可变区包含选自由11H12的CDR的氨基酸序列所组成组中的至少一种CDR。70.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含来自9E8的全部6个CDR。71.根据权利要求63所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述的抗体或其抗原结合片段包含来自11H12的全部6个CDR。72.特异性地结合对应抗原的抗体或其抗原结合片段，所述的对应抗原特异性地由选自由9B11、IODIO、9E8和11H12所组成的组中的单克隆抗体结合。全文摘要本发明提供因突变而适应于人的H5血凝素(HA)多肽和相关多核苷酸、方法、组合物和疫苗，其中所述的突变改变H1血清型的受体特异性。文档编号C07K14/11GK101627050SQ200780041962公开日2010年1月13日申请日期2007年10月10日优先权日2006年10月10日发明者加里·J.·纳贝尔,岚吴,杨志勇,江永佩,魏智仁申请人:美国国有健康与人类服务部(马里兰州)