TGF-β拮抗物治疗具有罹患支气管肺发育不良风险的婴儿的用途的制作方法

专利名称：TGF-β拮抗物治疗具有罹患支气管肺发育不良风险的婴儿的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及TGF-P拮抗物治疗具有罹患支气管肺发育不良风险的婴 儿(包括早产儿)的用途。
背景技术：
在发育非常早期的阶段出生的婴儿由于其发育不全的肺、简单的呼吸 驱动(primitive respiratory drive )和容易受感染，而通常患有呼吸衰竭。 支气管肺发育不良(BPD)，是一种早产儿慢性肺病，最早在近40年前得到 表征(Northway， N. Engl. J. Med. 276:357-368 (1967); Jobe等人，Am. J. Resp. Crit. Card. Med. 163:1723-1729 (2001))。如同最初所描述的，BPD 是主要发生在婴儿身上的病症，这些婴儿的大小和成熟程度令他们足以在 长时间暴露于高氧和正压通气所造成的损伤下存活下来。这主要是在妊娠 28到32周之间诞下的嬰儿，以及出生时体重在1,000到1，500克之间的婴 儿。其临床过程和肺病理学反映了严重的肺型氧中毒和肺过度膨胀的后果。 BPD的最初病理描述记录了气道损伤、发炎、间质性纤维化、平滑肌细胞 增生和远端气道的鳞状化生。这些婴儿的死亡率高，且在幸存者中经常出 现长期呼吸4几依赖性呼吸衰竭(Bland, Biol. Neonate 88:181-191 (2005))。
随着表面活性剂治疗的出现、产前类固醇治疗的广泛应用、先进的呼 吸机和营养治疗的使用，BPD的流行病学和病理生理学有了可观的变化。 现在，几乎三分之二罹患BPD的婴儿体重低于l，OOO克，在妊娠28周之前出生(Martinez等人，Chronic Lung Disease in Early Infancy, 21-39页； New York, Marcel Dekker (2000); Bancalori等人编，41-64页)。与以往 经验不同，当时肺型氧中毒和肺过度膨胀被认为是产生慢性肺损伤的主要 原因，而现在罹患BPD的早产儿暴露于较低水平的氧和机械通气。
此外，这些患有BPD的极为不成熟的嬰儿的肺病理学与"经典型，，BPD 不同。有时此疾病被称为"新型BPD"，其现在主要与末端肺发育中断相关。 对死于BPD的嬰儿的肺的显孩吏观察显示了远端(distal)肺发育部分至完 全的中止(Husain等人，Hum. Pathol. 29:710-717 (1998))。这致使患有BPD 的嬰儿的周边肺单元的肺泡产生(alveologenesis )减少，及孩吏脉管系统发 育减少和异形。
肺气嚢发育对于子宫外存活是至关重要的。肺发育可以分为5个重叠 的阶段胚胎早期(妊娠3-7周)、假腺体期(妊娠5-17周)、小管期(妊娠16-26 周)、囊状期(妊娠24-38周)和肺泡期(妊娠36周至出生后2年)(Burri， Lung Growth and Development, J. McDonald编,1-35页；New York, Marcel Dekker (1997); Kotecha， Paediatr. Respir. Rev. 1:308-13 (2000); Coalson， Sem.， Neonatology 8:73-81 (2003))。对于在妊娠26周出生的嬰儿，嚢状 期和肺泡期还未完成。在嚢状期过程中，肺球嚢(lung saccules )壁薄，壁 中的次级嵴(secondary crest)形成。预期呼吸空间的极大扩展使得球嚢 形成，间质组织量显著减少。肺看起来越来越"充气"，尽管充满着来自肺 和胎儿周围的羊水的液体。在肺泡期过程中，肺泡的形成由次级嵴的伸展 和变薄开始，而后其成熟为肺泡壁。因此，肺泡产生(alveologenesis)在 多数早产儿出生后开始。
尽管并未完全知晓导致BPD的机制，但是间接证据表明BPD是由细 胞因子对发育中的肺的影响所致(Groneck等人，Arch, Dis. Child Fetal Neonatal. Ed. 73:F1隱3 (1995); Jobe等人，Early Hum. Dev. 53:81-94 (1998); Jobe等人，Curr.Opin.Pediatr. 13:124-129(2001))。例如，已观察到子宫 内感染令早产新生儿肺中的细胞因子水平升高，且该子宫内感染与BPD风 险增加相关。此外，早产儿肺对氧和呼吸机治疗的暴露与肺流出物中细胞因子水平升高以及罹患BPD的风险升高相关。而且，BPD可能有直接的 遗传原因。由于有若干基因禎:认为对于末端肺发育有决定性作用(Bourbon 等人，Pediatric Research 57:38R-46R (2005))，其中一个或多个基因的异 常可能直接抑制正常的肺成熟并导致BPD。此外，也有可能遗传异常可以 通过导致早产而间接令BPD发病率升高。
近期的有限间接证据表明TGF-p可能是BPD中参与抑制末端肺发育 的众多细胞因子之一。例如，在早产儿末端气道和肺流出物中鉴定出了 TGF画p(Kotecha等人，J. Pediatr. 128:464-469 (1996); Toti等人，Pediatr. Pulmon. 24:22-28 (1997); Lecart等人，Biol. Neonate 77:217-223 (2000); Saito等人，Pediatr. Res. 55:960-965(2004))， TGF-(51水平在罹患BPD的 早产儿中最高(Kotecha， 1996)，且与疾病的严重性相关(Lecart， 2000)。 然而，此报道的TGF-p水平提高仅仅是对该疾病起主要作用的其他因子作 用的结果，还是TGF-p在BPD的发生中起更直接的作用，对于这点仍不 知晓。例如，除了 TGF-p之外，到目前为止已有约20个备选基因被鉴定 为可能控制末端肺发育。在这些基因之中，已报道有13个在动物模型或患 有BPD的婴儿中受到调节(Bourbon等人，Pediatr. Res. 57:38R-46R (2005))。使用基因表达i普技术，Perkowski及其同事报道了在成年小鼠的 高氧肺损伤中受到调节的385个基因(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 28:682-696 (2003))。
至少有两项研究检测了 TGF-pi在发育中的肺中异位it^达的影响。 例如，Vicencio等人^L道了具生物活性的TGF-(31在新生小鼠的肺上皮细 胞中的过表达与末端肺发育的抑制相关(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31:650-656 (2004))， Gauldie等人报道了用编码TGF-|31的腺病毒感染新生 大鼠肺会影响新生的肺结构，包括产生纤维化的斑片状区域(未在新型 BPD中见到)。(Am.丄Pathol. 163:2575-2584 (2003))。然而，并不清楚在 后一模型中所观察到的变化是否直接与TGF-pi的活性相关，因为接触腺 病毒(无TGF-p)的对照肺显示显著的远端气道水肿，这表明腺病毒栽体本 身诱导炎症。此外，两项研究均包含TGF-p的被动异位表达，因此不能模拟患有BPD的早产儿发育中的肺中发生的状况。因此，这些研究对于阐明 TGF-p在BPD中的作用并无帮助。
同时，其他研究已表明TGF-(5调控肺发育中的早期事件，所述早期事 件包括分支形态发生(Zhao等人，Am.丄Physiol. 273:L355-362 (1997); Zhao等人，Am. J. Physiol. 21 :L412-422 (1999))。然而，影响近端传导气 道(conducting)数量的胎儿肺分支形态发生在肺发育的嚢状期之前即告 完成(McMurty， Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 282:L341-344 (2002))。因此，分支形态发生的缺陷与早期肺发育的疾病相关，如肺发育 不全和先天性膈疝，而与抑制或中断肺发育的嚢状期和肺泡期的疾病BPD 无关。由于患有BPD的婴儿的肺中没有观察到分支形态发生异常，其近端 传导气道数量正常，这些研究对于阐明TGF-p是否在BPD发病机制中起 作用也没有帮助。
最后，已在儿科肺病而不是BPD的某些模型中研究了 TGF-p中和对 肺发育的影响。在这些情况中，TGF-p活性的提高在正常肺中通过改变 TGF-p与细胞外基质的结合得到实现(Nephme等人，Nat. Genet 33:407-411 (2003)和Massaro等人，Am . J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278:L955-60 (2000))，或在培养的生长的胎儿肺中通过提供过量水平 TGF-p实现(Zhang等人，E-PASS2006 59:5166.6 (2006))。对受损的发育中 肺中产生的过量TGF-p的中和是否抑制BPD的发生则没有进行研究。由 于病因学、病理学和病程的差异，这些对TGF-p进行了中和的研究对我们 理解TGF-p在BPD中的作用并无贡献。见例如Neptune等人，Nat. Genet. 33:407-411 (2003)和Massaro等人，Am . J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278:L955-60 (2000),其中报道了异常TGF-卩信号传导在马方氏症小鼠模 型中的作用；以及Zhang等人，E-PASS2006 59:5166.6 (2006)中报道了 TGF-p在作为与在高海拔生活相关的先天性心脏病或肺血管疾病模型的低 氧小鼠中的作用。
总而言之，尽管一些研究表明TGF-p能够影响末端肺发育，其他研究 则表明TGF-p在早得多的阶段(在分支形态发生过程)中起作用，却从没有研究直接指出在具有罹患BPD风险的早产儿的受损的肺中，TGF-P是 否在末端肺发育的调节起了致病作用，或者在这样的嬰儿中中和TGF-p是 否对病程有任何影响。
BPD是嬰儿发病率和死亡率极为重要的原因。排在哮喘之后，BPD是 对于儿科患者花费最昂贵的疾病。表面活性剂治疗和其他先进治疗的利用 改善了新生儿存活率，但没有伴随BPD发病率的减少。因此，对于治疗具 有罹患BPD风险的早产儿的改良的方法仍存在重大需求。
发明简述
本发明部分基于这样的发现和证实在支气管肺发育不良的高氧小鼠 模型中，在围产期中施用抗TGF-p抗体能够保护受损的发育中的肺的肺泡 产生和血管发生不被抑制。本发明提供了治疗具有,限患支气管肺发育不良 (BPD)风险的婴儿(包括早产儿)的方法。
本发明提供了通过在围产期(包括产前期和/或产后期)中施用TGF-p 拮抗物治疗嬰儿的方法。对于在产前期施用，TGF-(5拮抗物可以直接对在 子宫内的婴儿施用，或对母亲间接施用。
在一个实施方案中，本发明的方法包括治疗具有罹患支气管肺发育不 良风险的早产儿，其中婴儿的年龄为约妊娠24周至约产后6个月。在一个 实施方案中，待治疗的婴儿为出生于约妊娠32周或更早的早产儿。在一个 实施方案中，待治疗的嬰儿为出生于约妊娠28周或更早的早产儿。在一个 实施方案中，婴儿出生时的重量为约1500克或更少。在另一实施方案中， 婴儿出生时的重量为约1000克或更少。
在另一实施方案中，本发明的方法包括使用TGF-p中和剂减轻疾病的 严重性来治疗具有肺损伤和支气管肺发育不良的早产新生儿和嬰儿，其中 嬰儿的年龄至约产后6个月。
在一些实施方案中，TGF-p拮抗物为TGF-p的直接拮抗物，例如抗 TGF-p抗体、抗TGF-(3受体抗体或可溶性TGF-j5受体。在具体实施方案 中，TGF-p拮抗物为人或人源化形式的抗TGF-p抗体lDll。在非限制性实施方案中，TGF-p拮抗物为人泛特异性(pan-specific)抗体，如PCT 申请WO 06/086469中公开的PET1073G12, PET1074B9或PET1287A10。
TGF-p拮抗物可以全身性施用，包括肌内、静脉内或皮下。TGF-p拮 抗物还可以以气化形式直接对肺施用，以小滴或粉末形式、或与表面活性 载体一起包括通过吸入器或喷雾器施用。
在一些实施方案中，TGF-p拮抗物可以用于制备治疗支气管肺发育不 良的药物。此外，在一些实施方案中，药物可以包括TGF-P拮抗物和另一 治疗物质，包括例如类固醇、维生素A、高卡路里营养制剂、利尿药和/ 或支气管扩张药。
在其他实施方案中，TGF-p拮抗物可以增加嬰儿发育中的肺的肺泡产 生。在一些实施方案中，增加的肺泡产生和/或血管发生可以发生在肺周边。 在一些实施方案中，可以施用TGF-p拮抗物以使嬰儿肺的平均弦长(chord length)降低至少约10%、至少约20%、至少约30%或至少约40%。在 其他实施方案中，可以施用TGF-p拮抗物以使肺泡的体积密度降低至少约 20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%或至少约60%。此外，在 一个实施方案中，可以施用TGF-P拮抗物以使次级隔(secondary septal) 密度提高至少约20%、至少约30%、至少约40%或至少约50%。
在一些实施方案中，可以施用TGF-P拮抗物以产生更正常的肺结构。 例如，在一个实施方案中，可以施用TGF-P拮抗物以降低弹性蛋白的体积 密度。此外，在其他实施方案中，可以施用TGF-p拮抗物以增加婴儿发育 中的肺的血管发生。例如，在一个实施方案中，可以施用TGF-p拮抗物以 增加肺周边组织中弹性蛋白和/或aSMA的表达。
在另一实施方案中，可以施用TGF-p拮抗物以治疗或预防由于补加氧 造成的损伤。例如，在一个实施方案中，TGF-p拮抗物可以在补加氧之前 施用或同时施用，以预防或治疗由于慢性暴露于氧和/或肺过度膨胀造成的 肺发育异常。在一个实施方案中，TGF-(5拮抗物可以在子宫内或婴儿产后 不久施用，氧治疗可以在产后施用。此外，在另一实施方案中，可以施用 TGF-p拮抗物以促进婴儿产后的正常生长。


图1A-1D为显微照片，显示TGF-p同种型在小鼠幼崽发育中的肺中 的表达。在10日龄小鼠幼崽肺的支气管上皮中(图1A;箭头)、末端和呼 吸性细支气管中(图IB;分别为TB和RB)和末端气道中(图1C和图ID) 检测到不同的TGF-p免疫反应性(暗斑)。此外，在末端气道壁中，相对于 TGF-(32和TGF-P3， TGF-pi显示有更高的免疫反应性。所有的图均用苏 木精复染。实心比例尺50nm;空心比例尺lOOjun;交叉阴影线比例尺
图2A-2F为显微照片，显示TGF-p中和抗体在10日龄小鼠幼崽肺中 检测到TGF-P表达。图2A-2C中，用泛特异性单克隆抗TGF-p抗体1D11 在10日龄的小鼠幼患的肺中检测到TGF-P免疫反应性(暗斑)。图2D-2F 中，用非免疫血清代替1D11与肺共同孵育。如图2A所示，在大气道(*) 和血管(**)的壁中及细胞外基质(箭头)中的细胞鉴定出了 TGF-p免疫反应 性。并且在幼崽肺远端气道中鉴定出了 TGF-p免疫反应性(图2B和2C)。 所有的图均用苏木精复染。实心比例尺20nm;空心比例尺50nm。
图3A-3D为显微照片，显示用抗TGF-p抗体的治疗降低受损的新生 肺中的TGF-p信号传导。用免疫组织化学检测经过以下处理的10日龄幼 崽肺中的p-Smad2(暗斑)PBS和空气(图3A)、 PBS和85% 02(图3B)、 11)11和空气(图3C)以及1D11和85% 02(图3D)。与暴露于空气的肺相比， 用PBS处理并暴露于85% 0210天的肺在远端气道的细胞核中检测到更丰 富的p-Smad2(箭头指示代表性的细胞核p-Smad2免疫反应性)。相反，用 1D11处理、暴露于02的肺中，具有p-Smad2反应性的细胞核比用PBS 处理并暴露于02的肺中具有p-Smad2反应性的细胞核的少。用1D11处理、 暴露于02的肺中的p-Smad2染色的细胞核还与用PBS和1D11处理并暴 露于空气的肺中的p-Smad2染色的细胞核数量相似。所有的图均用苏木精 复染。比例尺50nm。
图4A-4D为显微照片，显示暴露于抗TGF-P抗体与受损的新生肺中远端气道发育的改善相关。用甲苯胺蓝染色经过以下处理的io日龄幼崽肺
切片PBS和空气(图4A)、 PBS和85% 02(图4B)， 1D11和空气(图4C) 以及1D11和85% 02(图4D)。与暴露于空气的幼崽肺相比，用PBS处理 并暴露于85% 02与远端气腔面积增加和次级隔数量减少(箭头)相关。用 1D11处理改善了暴露于02的幼崽肺的远端气it^育；在这些肺中显示有 更多的肺泡形成。比例尺200nm。
图5A-5C为实验图示，显示在受损的肺中，用抗TGF-P抗体进行处 理改善肺泡发育的客观量化指征。在PBS处理的小鼠肺中，在周边肺中慢 性暴露于85。/。的氧与平均弦长(Lm)和气腔体积密度(。/。AVD)(图5B)的增加 相关(图5A)，而这些与周边肺发育和气道表面积成反比，慢性暴露于85% 的氧还与发育中的肺中的次级隔密度降低相关(图5C)。在慢性暴露于高水 平02的肺中，用1D11处理抑制Lm和。/。AVD的异常增加，并提高次级 隔的密度。每组N二12; *P<0.05。
图6A-6C为显微照片，显示在用抗TGF-(5抗体处理的受损新生肺中， 弹性蛋白的表达提高。显示了经下列处理的10日龄小鼠幼崽周边肺的弹性 蛋白米勒染色(黑)PBS和空气(图6A)、 PBS和85。/。02(图6B)以及1D11 和85%02(图6<:)。弹性蛋白在对照的幼崽周边肺中表达，在次级隔(箭头) 顶部观察到高水平表达。慢性暴露于高水平02与定位于隔片(spetae)中的 弹性蛋白减少和其与球嚢壁关联的增加相关(箭头头部；图6B)。用抗 TGF-P抗体处理与弹性蛋白在肺泡隔顶部的沉积增加相关。实心比例尺 100pm;空心比例尺20nm。
图7A为显孩￡照片，图7B为实验图示，显示用抗TGF-p抗体处理受 损的发育中的肺提高周边肺实质中的弹性蛋白体积密度。/。(。/。EVD)，其为 细胞外基质发育的客观量化指征。在PBS处理的小鼠肺中，慢性暴露于 85。/。氧与弹性蛋白的异常沉积相关，该异常沉积由。/。EVD的增加反映。用 1D11处理通过改善弹性蛋白在周边肺的分布来抑制。/。EVD的异常增加。 每组N-4; *P<0.05。
图8A-8C为显孩t照片，显示在用抗TGF-P抗体处理的受损肺中，肺孩l血管内皮细胞形态(pattern )发生显著改善。显示了经下列处理的10 曰龄小鼠幼崽周边肺中，内皮细胞a-D-半乳糖苷的西非单叶豆(Gn)5^w/" )凝集素染色PBS和空气(图8A)、 PBS和85% 02(图8B)以 及lDll和85。/。02(图8C)。暴露于85%02的幼崽肺隔壁增厚，且内皮细 胞染色呈错综复杂的形态。相反，用1D11和高水平氧处理的肺则具有更 有条理的内皮细胞形态。所有的图均用苏木精复染。实心比例尺100nm; 空心比例尺20nm。
图9A-9B为实验图示，显示用抗TGF-p抗体处理的受损肺中的肺微 血管发育具有改善的客观量化指征。用分别与凝集素和aSMA抗体反应的 幼崽肺检测周边肺中内皮细胞的％荧光体积密度(。/。FVD)(图9A)和 SMC(图9B)。发育中肺的损伤与凝集素增加和aSMA的。/。FVD减少相关。 相反，暴露于TGF-p中和抗体则提高这些肺微血管细胞标记物的体积密 度。每组N-7; 、 P<0.05。
图10A-10C显示用抗TGF-p抗体处理的受损的新生肺中，肺微血管 肌成纤维细胞的标准化。显示经下列处理的10日龄小鼠幼崽周边肺细胞中 的aSMA免疫反应性(暗斑)PBS和空气(图IOA)、 PBS和85% 02(图10B) 以及1D11和85% 02(图IOC)。与呼吸空气的小鼠幼崽的肺相比，暴露于 高水平02的肺在肺周边的aSMA免疫反应性较低。用1D11和高水平氧处 理的幼崽肺显示在远端气道壁具有更多的aSMA免疫反应性。所有的图均 用曱苯胺蓝复染。实心比例尺100nm;空心比例尺20nm。
发明详述
本发明提供了治疗具有罹患支气管肺发育不良风险的(BPD)或已经患 有BPD的婴儿(包括早产儿)的方法，其在围产期、包括产前期和产后期 期间的至少一个时间点，对处于围产期、包括产前期和产后期的嬰儿施用 治疗有效量的TGF-f5拮抗物。本文所使用的术语"嬰儿"包括约"^ 24周 至约产后6个月的在子宫内或产后的人。支气管肺发育不良
BPD的临床诊断是在妊娠36周时，对那些患有需要连续或持续补加 氧的肺病和那些胸腔X光检查异常的任何早产儿做出的。本文所使用的 "BPD，，还包括所有可选的临床诊断定义，如对那些出生超过四周，患有持 续肺病、需要连续补加氧的和那些胸腔X光检查异常的嬰儿做出的诊断。 BPD有时还在文献中和被儿科医护人员称为"慢性肺病，，(Jobe等人，Early Hum. Devd， 53:81-94 (1998))。
由于临床上BPD只有在早产儿出生一段时间后，例如妊娠36周才能 诊断，通常在正式诊断出该疾病之前即对有风险的婴儿施行治疗。在一些 方法中，对诊断患有BPD的婴儿施行治疗以减轻疾病的严重性。根据本发 明的方法，TGF-p拮抗物用于治疗围产期中的嬰儿。本文所使用的用本 发明的方法治疗的人"围产期"包括产前期(即出生前)和产后期(即出生后)， 从约妊娠26周开始，持续至约产后6个月。对于在产前期期间施用，TGF-|5 拮抗物可以可以直接对在子宫内的胎儿施用，或对母亲间接施用。
在本发明的某些方法中，以治疗有效量施用TGF-p拮抗物以治疗具有 罹患BPD风险的婴儿，从而减轻、最小化或预防BPD在嬰儿中的发生。 本文所使用的术语"治疗"意指用以减轻、最小化或预防与BPD相关的肺后 遗症及临床体征和症状。可以用本发明的方法治疗的婴儿包括具有罹患 BPD风险的任何婴儿。具有罹患BPD风险的婴儿包括早产儿、具有早产 风险的婴儿和由于其他原因具有罹患BPD风险的其他任何嬰儿。
待用本发明的方法治疗的嬰儿年龄为从约妊娠24周至约产后6个月。 妊娠周数(即孕龄)可以用许多常规方法中的任意方法确定。例如，孕龄可 以从最后一次月经的第一天开始计算。
在一个实施方案中，婴儿为早产儿。本文所使用的早产儿为在妊娠37 周前出生的婴儿；术语"早产(preterm delivery)"或"早产(premature delivery )，，指任何发生在妊娠37周之前的分娩。因此，在一个实施方案中，
生)。 ' ' ^ P 1患上BPD的婴儿有几乎三分之二出生时体重低于1,000克且出生时少 于妊娠28周。因此，在一个实施方案中，待用TGF-卩拮抗物治疗的婴儿 可以用其出生时的体重和/或年龄进行鉴定。在一个实施方案中，待治疗的 嬰儿为出生于约妊娠32周或更早的早产儿。在一个实施方案中，待治疗的 婴儿为出生于约妊娠28周或更早的早产儿。在一个实施方案中，待治疗的 婴儿出生时体重为约1500克或更少。在另一实施方案中，嬰儿出生时体重 为约1000克或更少。
具有罹患BPD风险的婴儿还包括未出生的具有早产风险(从而具有 BPD风险)的嬰儿(即胎儿)。通过在产前期期间对母亲施用或直接对在子宫 内的胎儿施用治疗此类婴儿。W^约23周或更久，具有临床上完整的胎膜 且有一个或多个早产危险因素或早产标志的任何怀孕妇女均可以成为治疗 候选人。
已知有许多因素与早产风险相关。这些因素包括但不限于多胎妊娠；
子宫颈功能不全；子宫异常；羊水过多；未经产；曾有胎膜早破或早产标 记；先兆子痫；伴随胎盘前置的阴道出血；少有或无产前护理；及诸如腹 痛、腰痛、排出宫颈粘液和(子宫)收缩的症状。
除了这些危险因素以外，许多早产标记已净皮鉴定。本文所使用的早产 标志为这样的标志，当其处于或超过阀值水平，则表明早产风险增加。早 产标志的例子包括但不限于限于胎儿的抗原如胎儿纤连蛋白和雌三醇(美 国专利申请公开号2004/0266025)、胰岛素样生长因子结合蛋白l(可能破水 的标志；见美国专利申请爿>开号2004/0053838)及MMP-8和MMP-9 (美国 专利申请/^开号2004/0029176)。检测早产标志水平的方法为本领域熟知， 在例如美国专利申请^Hf号2004/0266025中所描述的。
尽管BPD主要见于早产儿，它也可以发生在出生后的最初几天有呼吸 问题的足月婴儿身上。因此，本发明的方法也可以用于治疗这些婴儿。
TGF-P拮抗物
TGF-p是二硫键连接的二聚物，合成时为约400个氨基酸(aa)的前蛋白原，在分泌之前切割产生成熟TGF-p。称为"潜在相关肽"(LAP)的N端 切割片段可以保持与二聚物非共价结合，从而使TGF-(5失活。体内分离的 TGF-p，主要以这种无活性的"潜在，，形式，即与LAP结合的形式存在。可 以用若干方法活化TGF-(3潜在复合物，例如通过与称为非阳离子依赖型甘 露糖-6-磷^/胰岛素样生长因子II受体的细胞表面受体结合。结合通过附 着于LAP中的糖基化位点的甘露糖-6-磷酸残基实现。与受体结合后， TGF-P以其成熟形式释放。而后成熟的活性TGF-P可以与其受体自由结合 并发挥其生物学功能。II型TGF-(5受体中的主要TGF-p结合结构域已被 定位于一个19个氨基酸的序列中(Demetriou等人，J. Biol. Chem. 271:12755 (1996))。
本文所使用的术语"TGF-P"指TGF-p的任何一种或多种哺乳动物同种 型。同样，除非另有说明，术语"TGF-p受体"指与至少一种哺乳动物TGF-j5 同种型结合的任何受体。当前有五种已知的TGF-p同种型(TGF-pi到 TGF-P5)，彼此间均为同源(60-80%同一性)，都形成约25 kDa的同型二聚 体，并作用于共同的TGF-p受体(TpR-I、 T(3R-I1、 T卩R-IIB和TpR-III)。 在哺乳动物中见到TGF-pi、 TGF-(52和TGF-卩3。 TGF-p和TGF-(3受体的 结构和功能方面为本领域熟知(见例如Cytokine Reference, Oppenheim 等人编，Academic Press, San Diego， CA， 2001)。 TGF-卩在不同物种中 非常保守。例如，大鼠和人的成熟TGF-pi的M酸序列几乎相同。因此， 预期TGF-p拮抗物在物种间具有高交叉反应性。
术语"TGF-P拮抗物"及其同类词如"抑制剂"、"中和"和"下调，，指对 TGF-P的生物活性起拮抗作用的化合物(或适当情况下指其性质)或其他分 子。TGF-p拮抗物可以例如与TGF-p结合并中和其活性；降低TGF-p表 达水平；影响稳定性或影响前体分子向活性、成熟形式的转化；干扰TGF-p 与一种或多种受体的结合；或可以干扰TGF-p受体的胞内信号传导。术语 "TGF-p的直接拮抗物"通常指直接下调TGF-p生物活性的任何化合物。如 果一个分子通过与TGF-p基因、TGF-p转录物、TGF-p配体或TGF-p受 体相互作用而下调TGF-p的活性，则该分子"直接下调"TGF-p的生物活性。
评估TGF-P的生物活性的方法，包括中和TGF-p拮抗物的活性，为 本领域已知。 一些更常用的体外生物测定的例子包括下列方法
(1) 在EGF存在下，诱导NRK细胞在软琼脂中形成集落(Roberts 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5339-5343 (1981));
(2) 诱导原始间充质细胞分化以表达软骨表型(Seyedin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2267-2271 (1985));
(3) 抑制MvlLu貂肺上皮细胞(Danielpour等人(1989) J. Cell. Physiol., 138:79-86)和BBC-1猴肾细胞的生长(Holley等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5989-5992 (1980));
(4) 抑制C3H/HeJ小鼠胸腺细胞的有丝分裂发生(Wrann等人(1987) EMBO丄，6:1633-1636);
(5) 抑制大鼠L6成肌细胞的分化(Florini等人，J. Biol. Chem. 261:16509-16513 (1986》;
(6) 测量纤连蛋白的生产(Wrana等人，Cell 71:1003-1014 (1992));
(7) 诱导与萤光素酶才艮道基因融合的纤溶酶原激活物抑制剂I(PAI-l) 启动子(Abe等人(1994) Anal. Biochem.， 216:276-284);
(8) 测量肺组织或血清或血浆中的PAI-1水平；
(9) 夹心酶联免疫吸附测定(Danielpour等人，Growth Factors 2:61-71 (1989));和
(10) Singh等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 13(24):4355-4359 (2003)
中描述的细胞测定法。
可以用于评估体内TGF-p活性的方法的例子包括评估SMAD2磷酸化 和/或核定位。
可以使用的TGF-j5拮抗物的例子包括但不限于针对一种或多种 TGF-j3同种型的单克隆和多克隆抗体(美国专利号5,571,714; WO 97/13844; WO 00/66631; WO 05/097832; WO 05/101149; WO 06/086469); 显性失活的可溶性TGF-P受体或直接针对TGF-p受体的抗体(Flavell等人，Nat. Rev. Immunol. 2:46-53 (2002);美国专利号5,693,607;美国专利 号6,001,969;美国专利号6，008，011;美国专利号6,010,872; WO 92/00330; WO 93/09228; WO 95/10610;和WO 98/48024; LAP(WO 91/08291);结 合LAP的TGF-p(WO 94/09812);结合TGF-(3的糖蛋白/蛋白聚糖如胎球 蛋白(美国专利号5,821,227);饰胶蛋白聚糖、p聚糖、纤调蛋白、腔蛋白 聚糖和内皮糖蛋白(美国专利号5,583,103;美国专利号5,654,270;美国专 利号5,705,609;美国专利号5,726,149;美国专利号5,824,655;美国专利 号5,830,847;美国专利号6,015,693; WO 91/04748; WO 91/10727; WO 93/09800;和WO 94/10187);甘露糖-6-磷酸或甘露糖-l-磷酸(美国专利号 5,520,926);促乳素(WO 97/40848);胰岛素样生长因子II(WO 98/17304); 植物、真菌和细菌的提取物(EU 813875; JP 8119984;和美国专利号 5,693,610);反义寡核苷酸(美国专利号5,683,988;美国专利号5,772,995; 美国专利号5,821,234;美国专利号5,869,462;和WO 94/25588);以及保 留了抑制TGF-P的生物活性能力的上述分子的任何突变体、片段或衍生 物。许多可用的小分子TGF-P拮抗物也为本领域技术人员所熟知，包括但 不限于WO 02/62753; WO 02/62776; WO 02/62787; WO 02/62793; WO 02/62794; WO 02/66462; WO 02/94833; WO 03/87304; WO 03/97615; WO 03/97639; WO 04/10929; WO 04/21989; WO 04/22054; WO 04/24159; WO 04/26302; WO 04/26871;美国专利号6,184,226; WO 04/16606; WO 04/47818; WO 04/48381; WO 04/48382; WO 04/48930; WO 04/50659; WO 04/56352; WO 04/72033; WO 04/87056; WO 05/10049; WO 05/032481; WO 05/065691; WO 05/92894; WO 06/026305; WO 06/026306;和WO 06/052568中所描述的那些。
在一些实施方案中，TGF-p拮抗物为TGF-P的直接拮抗物，例如阻断 TGF-P与其受体结合的抗体。
本文所使用的术语"抗体"指免疫球蛋白或其部分，包括任何包含抗原 结合部位的多肽，而无论其来源、制备方法和其他特征。该术语包括但不 限于多克隆、单克隆、单一特异性、多特异性、人源化、人、单链、嵌合、合成、重组、杂合、突变和CDR移植抗体。术语"抗原结合结构域"指抗 体分子的部分，其包含与部分或整个抗原特异性结合或互补的区域。当抗 原很大时，抗体可能仅与抗原的特定部分结合。"表位"或"抗原决定簇"为 抗原分子的部分，其负责与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用。抗原
结合结构域可以包含抗体轻链可变区(ViJ和抗体重链可变区(VH)。抗原结
合结构域可以由一种或多种抗体可变结构域提供(例如Fd抗体片段由VH 结构域组成，Fv抗体片段由Vh結枸域和V^结构域组成，或scFv抗体片 段由接头连接的VH结构域和VL结构域组成)。术语"抗TGF-p抗体"或"针 对至少一种TGF-p同种型的抗体"指特异性结合至少一种tgf-p表位的任 何抗体。术语"TGF-P受体的抗体"和"针对TGF-p受体的抗体"指特异性结 合TGF-p受体(例如I型、II型、或III型)的至少一种表位的任何抗体。
用于本发明方法的抗体与至少一种TGF-j5同种型或至少一种TGF-p 受体的胞外结构域特异性结合。本文所使用的术语"特异性相互作用"或"特 异性结合"或其同类词指两种分子在生理条件下形成相对稳定的复合物。特 异性结合的特征在于高亲和力和低到中等的容量(capacity)。非特异性结合 通常具有低亲和力和中等到高的容量。通常，当亲和常数Ka高于1061^1， 或优选高于108 m—1时^L为特异性结合。
在其他一些实施方案中，抗TGF-P抗体特异性结合选自TGF-pl、 TGF-P2和TGF-P3的至少一种TGF-p同种型。在另一些实施方案中，抗 TGF-P抗体至少特异性结合(a) TGF-卩l、 TGF-卩2和TGF-卩3 ("泛中和 抗体")；(b) TGF-pl和TGF-(52; (c) TGF画pi和TGF-卩3;或(d) TGF-卩2和 TGF-(53。在不同实施方案中，TGF-(5抗体对于其特异性结合的至少一种 tgf-P同种型的亲和常数Ka优选高于106m—、 1()7m1， 1()8m1， 109m'， 1010 m—1， 1011 m"或1012 m—1。预期用于人的还有中和一种或多种哺乳动
物。制备此类抗体的方法为本领域才支术人员所熟知(见例如Antibody Engineering, Borrebaeck编，第二版，Oxford University Press (1995))。 在非限制性的示例性实施方案中，抗TGF-p抗体为由杂交瘤1D11.16(保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其位于10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110，美国，ATCC保藏号HB 9849，在美国专利 号第5,571,714号；第5,772,998号；和第5,783,185号中有所描述)产生的 鼠单克隆抗体1D11。 1D11重链可变区序列可用登录号AAB46787得到。 因此，在相关的实施方案中，抗TGF-(3抗体为1D11的衍生物，例如包含 与AAB46787中的重链CDR相同的CDR序列的抗体，如人源化抗体。在 其他实施方案中，抗TGF-(5抗体为人抗体，通过1D11定向选择从噬菌体 呈现文库中分离得到。
在非限制性实施方案中，抗TGF-p抗体为人泛特异性抗体，如PCT 申请WO 06/086469中公开的PET1073G12、 PET1074B9或PET1287A10。
施用方法
利用本文提供的教导和本领域中关于不同TGF-p拮抗物的特征，包括 其效价和亲和力的丰富信息，熟练的临床医生可以容易地确定对于任何给 定的TGF-p拮抗物应^f吏用的准确剂量和使用方案。例如，当TGF-p拮抗 物为抗体时，可以用选定的提供与1D11抗体相同的中和效价的剂量，以 0.1到10mg/kg患者体重的剂量施用。相似地，抗TGF-p受体抗体、可溶 性TGF-p受体或另一 TGF-p拮抗物的治疗有效量可以在提供相当中和效 价的范围内选择。 一般而言，可以对母亲施用较高的剂量以在胎儿得到有 效剂量的TGF-P拮抗物；直接对胎儿或婴儿肺递送时，可以施用较低剂量 的TGF-p拮抗物。
"施用"不限于任何特定的制剂、递送系统或路径，可以包括例如肠胃 外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌内或腹膜内注射)直肠、局部、 经皮或口服(例如胶嚢、混悬剂或片剂)。对个体施用可以为单剂量、快速 浓注剂量(bolus dose )或重复施用，以及以众多药物组合物中的任何一种 施用，所述药物组合物含有生理学上可接受的盐形式，和/或可药用载体和 /或添加剂作为药物组合物的部分。生理学上可接受的盐形式和标准的药物 配制才支术及赋形剂是已知的(见例如Physicians' Desk Reference 2003， 57版，Medical Economics Company, 2002;和Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Genu ado等人编,20版，Lippincott， Williams & Wilkins， 2000)。
在一个实施方案中，含TGF-p拮抗物的组合物可以通过肺途径施用， 包括以粉状或液体气溶胶形式的吸入剂施用。气溶胶化(aerosolized)制 剂可以是直径小于l(Him的小滴或粉状颗粒。例如，拮抗物可以溶于微:粒 化的疏水/亲水乳剂。这样的吸入剂可以通过喷雾器、吸入器、气管内路径、 口内或鼻内路径施用。用于对呼吸道递送治疗物质的气溶胶，包括空气动 力学上的轻颗粒，在例如美国专利申请/>开号2005/0244341中有所描述。
对婴儿施用拮抗物可以通过基因治疗的方法完成，其中对患者体内施 用编码拮抗物的核酸序列、或对体外细胞施用而后将所述体外细胞引入患 者，再以适当的核酸栽体序列表达拮抗物(例如反义RNA、 snRNA、可溶 性TGF-p受体)。基因治疗递送TGF-p拮抗物的方法在(见例如Fakhrai 等人，Proc. Nat. Acad. Sci.美国，93:2909-2914 (1996))和U.S. 5,824,655 中有所描述。TGF-(5拮抗物的施用是通过用包含编码拮抗物的cDNA的栽 体进行基因转移实现的，例如编码TGF-p II型(rsTGFBIIR)或III型受体 (rsTGFBIIIR)胞外结构域的cDNA在例如美国专利申请公开号 2003/0180301中有所描述。
TGF-p拮抗物可以与当前用于或将用于治疗具有罹患BPD风险或已 诊断患有BPD的早产儿的任何其他物质或治疗组合施用于婴儿。在出生后 的第一个月中缺乏维生素A会显著增加罹患BPD的风险。研究还发现地 塞米松可以增加维生素A的血浆水平；这可以帮助嬰儿摆脱氧治疗，从而 预防BPD。
通常使用支气管扩张药通过放松气道周围的肌肉打开肺的气道。在病 情更严重的婴儿中，只用支气管扩张药有时难以控制哞鸣和呼吸窘迫，则 使用抗炎药减轻气道肺胀。因此，可以与本发明的方法组合的BPD治疗包 括表面活性剂、氧治疗、呼吸机治疗、类固醇、维生素A、 一氧化氮吸入、 高卡路里营养制剂、静脉内饲、抗生素、液体限制和利尿药减少肺中的水囤积、及提高肌肉性能以帮助肺排出粘液的物理疗法。
下列实施例提供例示性实施方案。本领域技术人员会认识到，可以进 行许多修改和变更而不改变本发明的精神或范围。这样的修改和变更涵盖 在本发明的范围之中。实施例不以任何方式限制本发明。
实施例
在胚胎第17和19天，对标注时间(time-dated)的C57BL/6怀孕小 鼠(Charles River)腹腔注射含有或不含10 mg/kg泛特异性抗TGF-卩IgG, 抗体1Dll(Genzyme)的0.5 ml PBS pH 7.4，或是没有已知抗原的同种型配 对骨髓瘤蛋白(MOPC21; Sigma-Aldrich)。出生12小时以内，经相似处理 的成对母鼠的幼崽混合，随机分为两窝，随后与其母鼠一起接受连续的空 气或85%氧处理10天。每24小时，将成对两窝中的授乳母鼠根据不同的 ()2暴露水平进行交换，以减少呼吸高水平02造成的影响。医用级别的氧 和氮气(Airgas)用分别调控和校准的流量表进行混合。将气体混合物引入 680 L丙烯酸接触室(acrylic exposure chamber)。阻隔室(airlock)使得可 以交换母鼠及更新食物、水和寝具而不改变幼崽的氧暴露水平。接触室中 新鲜气流的流速超过计算得出的其内小鼠的氧消耗的10倍以上(Bartlett 等人，Respir. Physiol. 29:193-200 (1997))。
氧水平用顺磁反应法
(paramagnetic method)测定(Servomex model 572)。此暴露方法产生具 有稳定氧水平的气体氛围，且接触室中的相对湿度和温度分别为不超过 60%和70°C。所有方案均经过麻省综合医院动物研究小组委员会
(Subcommittee for Research Animal Studies of the Massachusetts General Hospital)批准。
组织制备
为得到分析用的肺和心脏，幼崽经称重，通过腹腔注射200 mg/kg戊 巴比妥钠处死。施行胸廓切开术令肺萎陷，通过颈中的横切口鉴定气管，将0.61 mm外径的聚乙埽管(PE10; Harvard Apparatus)固定在气管中。 用含3%低聚甲醛和0.1。/。戊二酪(gluteraldehyde)的PBS以22 cm的H20 压力令肺膨胀30分钟，而后当肺扩张时结扎气道。幼崽躯体于4。C浸于固 定剂中3天。从躯体中解剖心和肺，4。C储存于PBS中留待进一步分析。 为获得用于冷冻切片的肺组织，进行气管插管，用组织冷冻培养基(TFM; Triangle Biochemical Sciences)和含20%蔗糖的PBS (按1:1体积比稀释) 轻柔地令肺膨胀并取出。随后，用TFM将肺覆盖，在异戊烷中冷冻(保存 在干冰上)，储存在-80。C待用。
检测组织TGF-p。
用免疫组织化学检测幼崽肺中的TGF-p同种型免疫反应性。经过柠檬 酸抗原修复之后，封闭肺切片，暴露于兔抗TGF-pi(Santa Cruz， sc-146)、 TGF-p2(sc-卯)和TGF-(53(sc-82)抗体及预先免疫的兔血清(对照)。经充分洗 涤，切片暴露于生物素化的抗兔抗体、抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复 合物(Vector Labs)和二氨基联苯胺(DAB; Vector labs)，再用苏木精复染。 肺TGF-P也用泛特异性抗TGF-p抗体和间接免疫组织化学(Graham等人， Biol. Reprod. 46:561-572 (1992))以及对于使用小鼠组织中的鼠类抗体最优 化的市售试剂盒(M.O.M.免疫检测试剂盒；Vector Labs)进行检测。将石 蜡包埋的6pm厚的肺切片用二甲苯、醇梯度溶液处理，在PBST(含有0.1% 吐温20的PBS)中7JC合。在封闭试剂中孵育后，组织在4。C下暴露于1D11(在 封闭溶液中稀释)过夜。组织用PBST洗涤过后，用生物素化的抗小鼠抗体 孵育，用PBST洗涤，暴露于抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物 (Vector Labs)和二^i^联苯胺(DAB; Vector labs)，再用苏木精复染。
分析TGF-p信号传导
用间接免疫组织化学检测肺中的细胞核磷酸SMAD 2(p-Smad2)。将 6nm厚的冷冻肺切片置于Superfrost PlusTM载玻片(Fisher Scientific)上， 用含4%低聚曱醛的PBS固定2分钟，用100%甲醇透化处理10分钟。用含5。/。山羊血清的PBST封闭1小时，将切片在4。C下暴露于用封闭液稀 释的兔抗pSmad2(Ce11 Signaling)中过夜。切片用PBST洗涤后，与生物素 化的抗兔抗体孵育，用PBST洗涤，暴露于抗生物素蛋白-生物素过氧化物 酶复合物和DAB，再用苏木精复染。
肺结构的立体学分析
肺的病理生理学由确定肺体积，Lm(平均截线长度(mean linear intercept)或弦长)和。/。AVD(。/。气腔体积密度)表征。在肺充气固定之后， 用阿基米德原理测定肺体积。受损的发育中的肺的肺泡形成中断，停留在 类似嚢状期的发育阶段，远端气道直径增大。通过用立体学方法，以及测 定Lm(Massaro等人，Am.丄Physiol. 250:R51-55 (1986); Tomkeieff， Nature 155:24 (1945))、 ％AVD (Weibel， Stereological Methods. London: Academic Press (1979))和次级隔密度(Pierce等人Am J Physiol. 272: L452-60 (1997)) 量化这些变化。Lm与肺的内表面积成反比(Thurlbeck, Am. Rev. Respir. I)is. 95:752-764 (1967); Thurlbeck， Am. Rev. Respir. Dis. 95:765-773 (1967))。次级隔密度与肺泡的发育直接相关。
充气固定的幼崽肺包埋在异丁烯酸甲酯中，将2nm厚、甲苯胺蓝染色 的左肺切片用于结构研究。收集和处理肺图象数据的观察人员对治疗组的 組别和肺的暴露状况不知情。使用系统抽样法(与Tschanz和Burri， Exp. LungRes. 28:457-471 (2002)中的方法相似)，由不含大气道和血管结构，随 机定向的左肺横向切片中取4个0.60 mm2的视野，进行数字化以测定Lm; 在这些视野中，获取4个0.15 mm2切片以测定。/。 AVD。使用专门编辑的 macro和I戲geJ(Rasband， ImageJ， Bethesda， MD (1997-2004)),用前 述方法过滤并分割图像(Tschanz等人，2002)。为测定Lm，通过对含有间 隔90nm的水平线的图象进行位元字串的按位元逻辑与运算(bit-wise logical AND operation )将图4象倒排和归并。将得到的弦排序；排除< 8nm 且〉250nm的弦，从而除去与肺毛细血管和传导气道相关的数据(Soutiere 等人，Respir. Physiol. Neurobiol 140:283-291 (2004))。通过将得到的弦总和除以截段(intercept)数得到Lm。用标准点计数方法测定远端气腔的 %AVD(WeibeI， 1979)。通过计数客观测定次级隔密度。
细胞外基质蛋白的肺染色
用6pm厚、石蜡包埋的肺切片测定肺弹性蛋白和胶原。用0.5%高锰 酸钾和1%草酸处理后，用弹性蛋白米勒染色进行弹性蛋白染色(Miller, Stain Techno. 28:148-149 (1971))。用含0.1%粘胶纤维红(Sirius red)的 饱和苦味酸进行胶原染色(Walsh等人，Anal. Biochem. 203:187-1卯 (1992))。用标准方法测定实质中的弹性蛋白。/。体积密度(Pierce等人Am J Physiol. 272: L452-60 (1997》。
血管发育评估。
用凝集素染色鉴定远端气道壁中的肺微脉管系统。已观察到西非单叶 豆(Griffania simplicifolia, Bandeiraea)凝集素与内皮细胞(Mattsson等人, Pancreatology 2:155-162 (2002))中的a-D-半乳糖苷结合(Hayes等人，J. Biol. Chem. 249:1904-1914 (1974)),优选用于鉴定肺微脉管系统(King等 人，Microvasc. Res. 67:139-151 2004))。石蜡包埋的6nm厚的肺切片经封 闭，与生物素化的西非单叶豆凝集素(Molecular Probes)IB4同种型孵育过 夜。用含0.1。/。吐温20的Tris緩冲盐水(TBST)洗涤过后，用抗生物素蛋白 -生物素复合的碱性磷酸酶和Vector Red底物(Vector Laboratories)检测结 合的凝集素，切片用曱苯胺蓝复染。根据前述方法使用6jmi厚的石蜡包埋 的肺切片，用鼠单克隆抗aSMA抗体(1A4; Sigma)对平滑肌细胞进行免 疫组织化学鉴定(Roberts等人，Circ. Res. 87:140-145 (2000))。
用Weibel(1979)所述的方法分析小鼠幼崽肺中的肺微血管细胞的面密 度(areal density)。如前所述与生物素化的凝集素、aSMA抗体和Vector Red 底物反应的肺切片分别用于获取微脉管系统内皮和SMC区室的详细信息。 使用上文详述的系统抽样法获取除去胸膜、大气道和血管结构的周边肺的 落射荧光图像。经过过滤和分割操作后，通过用荧光像素对应的像素数目除以图像中的像素总数确定％荧光体积密度(。/。FVD)。取每张幼崽肺切片 的三幅图像的。/oFVD中值用于分析。
通过测定富尔顿比(Fulton ratio )(Fulton等人，Br. Heart J. 14:413-420 (1952))评估慢性呼吸85%02或空气对14只小鼠幼崽右心室肥大的影响。 在含3。/。低聚甲醛和0.1%戊二醛的PBS中固定3天后，将心脏在PBS中 4。C储存。除去心房和大血管，将右心室游离壁与左心室和室间隔分割开。 从组织上吸去过量PBS后，将右心室和左心室(包括室间隔)在带防护的天 平上称重。
统计方法
用Pocock所述的方法测定用于立体学分析的样品大小(Pocock， 123-141页,Clinical trials: A practical approach, New York: John Wiley & Sons (1983))。每组取六个肺进行研究以检测可能的10%的Lm减少，使 用同种型对照抗体，a为0.05，效力为0.9。初步研究显示用1D11处理使 得用PBS处理过的呼吸85% 02的小鼠Lm从68.0减少至62.3nm，合计 SI)为4.2。由于这些数据显示每组需要11.4个幼崽肺以显示1D11的有益 效果，a为0.05，效力为0.90,于是每个治疗和暴露组取12个幼崽肺进行 研究。成对两窝中的幼崽重量用随机化完全区组设计进行分析(Snedecor 等人，255-273页，Statistical methods, Ames, Iowa: Iowa State University Press (1980))。数据用平均值士SD表示，用ANOVA因素模型进行对比。 之后当检测到显著差异时，使用Sheffe检验。显著性以P〈0.05确定。
实施例1: TGF-p在发育中肺的表达，及用抗TGF-p抗体调节TGF-p
信号传导
尽管在出生后的大鼠肺中观察到TGF-pi和TGF-J32的RNA水平增加 (Zhao等人，Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 278:L1231-1239 (2000))， TGF-P同种型在发育中的肺周边中的表ii^莫式知之甚少。如图1 所示，在10日龄小鼠幼崽肺中检测TGF-j51-3的免疫反应性。在大传导气道中，以及在末端和呼吸性细支气管中观察到相似的TGF-(5同种型水平。 尽管在周边肺中TGF-pi显示具有最高的免疫反应性，但在该处也检测到 TGF-P2和TGF-(53。由于期望确定抑制远端发育中的肺的TGF-卩活性是 否抑制肺损伤对肺泡发育的影响，我们首先测试泛特异性TGF-(5中和抗体 是否识别周边肺中的TGF-p。 1D11为杂交瘤产生的单克隆抗体，该杂交 瘤由用天然的牛TGF-p2免疫的Balb/c小鼠脾细胞产生(Dasch等人，J. Immunol. 142:1536-1541 (1989))。在体外用1D11中和TGF-(51-3(Dasch， 1989; Ruzek等人，Immimophamiacol. Immunotoxicol. 25:235-257 (2003》 并鉴定人胎盘和蜕膜组织中的TGF-p(Graham等人，Biol. Reprod. 46:561-572 (1992))。如图2所示，用1D11检测10日龄小鼠肺中的TGF-(5。 特别是在大小气道和血管的壁中观察到TGF-p免疫反应性。强烈的细胞外 TGF-p免疫反应性也与细胞外基质(箭头)相关。
尽管出生前暴露于TGF-p中和抗体可以抑制具有细胞外基质异常的 小鼠中的TGF-p信号传导(Neptune等人，2003)，但此方法能否调节受损 的发育中的肺中TGF-p信号传导的预期增加仍不知晓。由于增加的TGF-|5 信号传导与Smad2或3的磷酸化和细胞核定位增加相关(Nakao等人， Embo J. 16:5353-62 (1997)),使用免疫组织化学测试在小鼠幼崽肺中高氧 肺损伤是否与磷酸化的Smad2(p-Smad2)的细胞核区室化增加相关。用此 方法进行额外研究以确定TGF-p信号传导的增加是否可以通过用抗 TGF-j5抗体进行处理而改变。如图3所示，与用PBS处理过、暴露于空气 的幼崽肺相比，用PBS处理过、慢性暴露于85% 02的幼崽肺中细胞核 p-Smad2的水平增加。重要的是，1D11处理与暴露于高水平氧的幼崽肺中 p-Smad2细胞核定位的减少相关。这些观察结果表明高氧肺损伤增加 TGF-p信号传导，且过度的TGF-p活性可以用TGF-p中和抗体减弱。而 且有趣的是，注意到PBS处理的暴露于空气的肺中的一些肺细胞具有细胞 核p-Smad2。这说明TGF-(3在出生后的肺中有一些基础活性，并在正常末 端肺发育的调控中起作用。实施例2:抗TGF-p抗体处理改善受损新生肺中的肺泡产生
新生啮齿动物慢性吸入高水平氧导致肺损伤，抑制末端肺发育，其方 式与在患有BPD的婴儿中所观察到的相似(Bonikos等人，Lab Invest. 32:619-635 (1975); Frank等人，J. Appl. Physiol. 45:699-704 (1978); Pappas 等人，Lab Invest. 48:735-748 (1983); Bonikos, Am. J. Pathol. 85:623-650 (1976); Warner等人，Am.丄Physiol. 275:L110-117 (1998))。因此，使用 高氧小鼠幼崽的肺损伤模型检测用TGF-p中和抗体处理是否改善肺泡的 发育。将新生小鼠幼崽连续暴露于85%0210天，这是因为在初步研究中 观察到这样的暴露水平导致肺泡产生减少，同时存活率>80%。如图4所 示，慢性暴露于85% 02与末端肺发育减退相关。与呼吸空气的对照幼崽 肺相比，受损的幼崽肺的远端气道显示复杂程度较低的间质结构，和较少 的次级隔和肺泡(箭头)。此末梢气腔面积的增加可能由间质组织的减少所 引起，因为暴露于85% 02的肺的总体积与暴露于空气的肺没有不同(肺体 积，jil/g体重PBS和85。/o02 62士8，相对于PBS和空气60±5， P>0.05)。
重要的是，暴露于抗TGF-p抗体改善受损新生肺的末端肺发育，因为 其致使周边肺的分隔水平和气腔面积接近PBS处理的呼吸空气的对照肺中 的水平。此外，暴露于1D11未显示与肺毒性相关。在1D11处理、暴露于 空气的肺中，远端气道中没有高水平的炎症细胞浸润。这些观察结果表明 减弱异常的TGF-p信号传导改善受损的新生小鼠肺中的末梢肺发育。
在暴露于85% 02的幼崽肺中对1D11对于Lm和。/。AVD的影响进行 了检测，以确定用抗TGF-p抗体进行处理是否改善受损的新生肺中的肺泡 产生。受损新生肺中肺泡产生的减少与肺内表面积减少和肺泡的气腔面积 增加相关，这可以用立体学方法进行量化(Weibel， 1979; Bolender等人， Am.丄Physiol. 265:L521-548 (1993))。例如，Lm与肺内表面积成反比， %AVD与肺泡气腔面积逆相关。其他学者才艮道了高氧肺损伤令发育中的小 鼠和大鼠肺中的Lm和。/oAVD增加(Shaffer等人，Pediatr. Res. 21:14-20 (1987); Boros等人，Am. J. Physiol. 272:L433陽441 (1997); Warner等人， Am. ,J. Physiol. 275:L110-117 (1998)).如图5A-5C所示，与暴露于空气相比，慢性呼吸85% 02与Lm增加 30Q/o(PBS-空气50.7±3.4nm,相对于PBS-02 67.3士3.7nm)、 ％AVD增加 20。/。(PBS-空气55.6±3.7%，相对于PBS-02 67.8±4.0%)和次级隔密度降 低相关。重要的是，和这种与暴露于PBS和02相关的变化相比，用1D11 处理呼吸02的肺与Lm降低30%(lDll-O2 62.3士4.4nm)、 ％AVD降低 51%(lDll-02 61.6±4.2%)和次级隔密度提高(增加38%)相关。这些数据表 明TGF-p对于介导损伤对末端肺发育的影响起重要作用。有趣的是，单独 用抗TGF-P抗体进行处理也与Lm和。AAVD的适度降低相关。由于对照 肺中观察到的基础TGF-(5信号传导显示还被对于1D11的暴露所调控，这 些后面的数据表明TGF-P调控新生肺中出生后肺泡形成的速度。
进行了其他研究以探索1D11的保护效应是否归功于其同种型IgG,。 因此，用立体学方法检测IgG,是否能保护高氧新生小鼠肺，令其肺泡产生 不祐:抑制。MOPC21为没有已知抗原的1D11 IgG同种型配对的对照单克 隆抗体，出生前暴露于MOPC21并不减轻由慢性暴露于85% 02诱导的对 肺泡产生的抑制。暴露于85%02并用MOPC21或PBS处理的动物肺中， 对Lm和。/oAVD没有观察到区别(Lm: MOPC21-02 70.4土7.1nm，相对于 PBS-()2 68.0土3,7jim; %AVD: MOPC21-02 69.4±2.6%，相对于PBS-02 68.9±4.5%，两项中PX).05)。这些数据与其他报道相一致，非特异性IgG 不能保护新生肺使其不发生对高氧症诱导的肺泡产生的抑制(Padela等人， Am.丄Respir. Crit. Care Med. 172:907-914 (2005))。
实施例3:通过抗TGF-p处理改善受损新生肺中的肺泡隔的弹性蛋 白结构
弹性蛋白是肺泡壁和肺脉管系统中的重要成分，它的生物合成和胞外 组装对于正常肺发育至关重要。在患有BPD的婴儿肺中，同具有肺损伤的 新生小鼠一样(Veness-Meehan等人，Pediatr. Res. 48:434-444 (2002)),在 次级峰顶部，弹性蛋白的正常结构被破坏，反而在远端气道壁中观察到弹 性蛋白。由于TGF-p调控ECM蛋白质在间充质细胞(Leask等人，Faseb J.和肺(Kucich等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17:10-16 (1997); Parks等人，Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 17:1-2 (1997)) 中的表达和降解，检测了用1D11处理对细胞外基质蛋白沉积的影响。如 图6所示，慢性呼吸高水平02与次级隔中的弹性蛋白表达的改变相关。在 用PBS处理、呼吸空气的幼崽(箭头)中观察到的弹性蛋白表达的典型模式 更加无序，散布在整个隔壁中(箭头头部)。如图7A和7B所示，无序的弹 性蛋白表达才莫式与。/。EVD增加相关。重要的是，用1D11处理与氧处理的 肺次级峰中弹性蛋白沉积模式改善和正常的。/。EVD相关。这些数据表明 TGF-p对于介导高氧肺损伤中的弹性蛋白异常表达起重要作用。而且，这 些数据还表明用抗TGF-p抗体处理可以保护受损的新生肺不产生无序的 弹性蛋白形成。在此肺损伤的早期，在暴露于氧的小鼠幼崽肺中没有观察 到胶原分布的改变(数据未显示)。
实施例4:用抗TGF-p抗体处理改善高氧的发育中肺的微血管发育 在发育中的小鼠和大鼠中，暴露于高水平氧改变正常的肺微血管发育 (Roberts等人，Pediatr. Res. 17:368-375 (1983)); D，Angio等人，Front. Biosci. 7:dl609-1623 (2002))。已报道TGF-卩对于形成血管的细胞的分化起 调控作用(Roberts等人，Am. Rev. Respir. Dis. 140:1126-1128 (1989))。因 此，进行了研究以确定抗TGF-p抗体是否能改善在02损伤的新生幼崽肺 中观察到的异常肺微血管发育。如图8所示，慢性暴露于85% 02与肺微 血管的异形组^f目关。与暴露于空气的对照肺中所观察到的相比，慢性暴 露于85% 02的肺微血管内皮细胞的凝集素染色的模式更发散而较为无序。 这也与受损的幼崽肺周边凝集素染色的细胞的体积密度增加相关；在暴露 于85%02 10天的幼崽肺中，凝集素的。/。FVD增加约4倍(图9)。而且，用 11)11处理与用85% 02处理的肺远端气道中内皮细胞排列的相似模式相 关。此外，暴露于1D11与暴露于高水平02的肺中的凝集素。/。FVD减少将 近50%相关。这些数据表明TGF-p破坏受损的新生肺中的正常肺微血管 发育，用抗体中和TGF-(3可以减轻异常的肺血管发育。由于平滑肌细胞(SMC)影响肺微血管发育，进行了检测以确定用 TGF-p中和抗体减轻受损的新生肺中的异常TGF-(5信号传导是否与肌成 纤维细胞分布改善相关。如图10所示，高氧肺损伤与远端肺壁中aSMA 鉴定的肌成纤维细胞减少相关。在慢性暴露于85% 02的幼崽肺中，aSMA 的。/。FVD减少近于70。/。(图9)。相反，用抗TGF-P抗体进行处理则增加受 损的肺中aSMA免疫反应性的量和。/。FVD。这些数据表明中和TGF-卩对 新生(幼崽)受损的肺微脉管系统具有有益影响。在此才莫型中，用aSMA 抗体进行的免疫组织化学测定显示暴露于85% 0210天的幼崽肺中肺动脉 肌肉形成(muscularization)没有增加(数据未显示)。此外，慢性呼吸高水平 氧的幼崽的右心室质量没有增加(RV:LV+S: PBS-空气0.32士0.04; PBS-85%O2 0.25±0.05， P>0.05)。
实施例5:身体生长和用抗TGF-(5抗体进行处理
新生幼崽高氧肺损伤与身体生长减少相关。由于用抗TGF-p抗体进行 处理与周边肺的肺泡产生和血管发生的改善相关，进行了研究以确定用 11)11处理是否对暴露于85% 02的幼崽生长有有益影响。与呼吸空气的对 照幼崽相比，新生小鼠幼崽暴露于高水平氧与体重减少近30%相关(10日 龄时的体重PBS-空气5.26±1.18 gm， PBS-85% 02: 3.74±1.0 gm; n=10-15， P<0.05)。用1D11处理的暴露于85% 02的幼崽体重(4.62士0.85 gm)与呼吸 空气的对照幼崽体重没有显著差异。
在上述实施例中，暴露于泛特异性抗TGF-P抗体促进具有肺损伤的小 鼠幼崽的肺发育。如同之前报道的，观察到不断吸入高水平02使得在肺发 育决定性的终末期减少肺泡产生并改变血管发生(Roberts等人，Pediatr. Res, 17:368-375 (1983); Warner等人，Am. J. Physiol. 275:L110-117 (1998); D'Angio等人，Front. Biosci. 7:dl609-1623 (2002))。这使得高氧小鼠幼崽 的病理检查结果与患有BPD的新生儿的病理检查结果相似。重要的是，出 生前阶艮暴露于抗TGF-p抗体改善受损的新生幼崽肺的肺泡发育、弹性蛋 白沉积和微血管结构。这些研究结果第一次表明抗TGF-P治疗可以保护受损的新生肺的肺 泡产生和血管发生不受抑制，并治疗BPD。
依照发明书中所引用文献的教导能够最完整的理解本发明书。发明书 中的实施方案提供本发明实施方案的举例说明，而不应，为对本发明范 围的限制。本领域技术人员很容易认识到许多其他的实施方案也涵盖在本 发明中。4^>开中引用的所有出版物、专利、专利申请和生物序列，其完 整引入本文作为参考。此处对任何文献的引用均非承认该文献为本发明的 背景技术。
除非另有说明，在说明书、包括权利要求书中使用的表达许多成份、 细胞培养、处理条件等的量的所有数字，应理解为在所有情况下均可任选 地以术语"约"进行修饰。因此，除非另有相反说明，数字参数为近似值， 并且可以根据本发明意图获取的期望性质而有所变化。除非另有说明，在 一系列要素前的术语"至少"应理解为指该系列中的每个要素。本领域技术 人员仅通过例行试验即可认识到或能够确定本文描述的本发明的具体实施 方案相等同的实施方案。下文的权利要求书旨在涵盖这样的等同实施方案。
权利要求
1.治疗具有罹患支气管肺发育不良风险的婴儿的方法，其包括对婴儿施用治疗有效量的TGF-β拮抗物。
2. 权利要求1所述的方法，其中TGF-p拮抗物在产前期期间对婴儿 施用。
3. 权利要求2所述的方法，其中TGF-p拮抗物在嬰儿出生前通过对 母亲施用而施用于嬰儿。
4. 权利要求2所述的方法，其中TGF-p拮抗物直接对子宫内的婴儿 施用。
5. 权利要求1所述的方法，其中TGF-p拮抗物在产后期期间对嬰儿 施用。
6. 权利要求1所述的方法，其中婴儿的年龄为约妊娠24周至约产后6 个月。
7. 权利要求l所述的方法，其中婴儿为在约妊娠24周至约妊娠32周 的年龄出生的早产儿。
8. 权利要求1所述的方法，其中婴儿出生时的重量为约1500克或更少。
9. 权利要求1所述的方法，其中婴儿出生时的重量为约1000克或更少。
10. 权利要求l所述的方法，其中TGF-p拮抗物选自抗TGF-p抗体、 抗TGF-p受体抗体和可溶性TGF-p受体。
11. 权利要求10所述的方法，其中抗体为人或人源化形式的单克隆抗 体1D11。
12. 权利要求l所述的方法，其中TGF-(5拮抗物为单克隆抗体，其施 用剂量的效价等同于剂量为0.1到10mg/kg体重的1D11抗体的效价。
13. 权利要求1所述的方法，其中TGF-(5拮抗物为单克隆抗体，其施 用剂量的效价等同于剂量为1 mg/kg体重的1D11抗体的效价。
14. 权利要求1所述的方法，其中TGF-p拮抗物为泛特异性的人或人 源化单克隆抗体。
15. 权利要求l所述的方法，其中TGF-p拮抗物通过肌内、静脉内或 皮下施用。
16. 权利要求1所述的方法，其中TGF-P拮抗物以气溶胶形式被吸入。
17. 权利要求16所述的方法，其中TGF-p拮抗物通过喷雾器或吸入 器施用。
18. 权利要求16所述的方法，其中所述气溶胶形式包含直径小于10nm 的小滴，所述小滴在合适的可药用液体载体中包含TGF-p拮抗物。
19. 权利要求1所述的方法，其中TGF-p拮抗物以包含直径小于10nm 的颗粒的粉状形式纟皮吸入。
20. 权利要求1所述的方法，其还包含对婴儿施用至少一种其他物质 或治疗，所述物质或治疗选自表面活性剂、氧治疗、呼吸机治疗、类固醇、 维生素A、 一氧化氮吸入、高卡路里营养制剂、利尿药和支气管扩张药。
21. TGF-p拮抗物的用途，其在所需嬰儿中治疗支气管肺发育不良。
22. 权利要求21所述的用途，其中TGF-(J拮抗物用于减轻已确诊患 有支气管肺发育不良的婴儿的该疾病。
23. TGF-p拮抗物在制备用于在所需婴儿中治疗支气管肺发育不良的 药物中的用途。
24. 治疗嬰儿肺损伤的方法，其包括 对婴儿施用治疗有效量的TGF-p拮抗物；和 出生后对嬰儿提供氧补充。
25. 权利要求24所述的方法，其中TGF-p拮抗物选自抗TGF-卩抗体、 抗TGF-P受体抗体和可溶性TGF-p受体。
全文摘要
本发明涉及通过在包括产前期和/或产后期的围产期期间，对具有罹患支气管肺发育不良风险的婴儿(包括早产儿)施用TGF-β拮抗物进行治疗的方法。对于在产前期期间施用，TGF-β拮抗物可以对子宫内的婴儿直接施用，或对母亲间接施用。
文档编号C07K16/22GK101553254SQ200780044749
公开日2009年10月7日 申请日期2007年10月3日 优先权日2006年10月3日
发明者J·B·施特赖桑德, J·D·小罗伯茨 申请人:建新公司