包含修饰的Fc结构域的多聚Fc受体多肽的制作方法

专利名称：：包含修饰的Fc结构域的多聚Fc受体多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抑制白细胞F(ry受体(FcryR)和免疫5求蛋白G(IgG)相互作用的可溶性多聚Fc受体多肽(multimericFcreceptorpolypeptide)和蛋白质。所述多肽和蛋白质在炎症疾病，特别是免疫复合物介导的炎症疾病如类风湿性关节炎(RA)、免疫性血小板减少性紫癜(ITP)和系统性红斑狼疮(SLE)的治疗中是有用的。通过引用并入本专利申请要求如下申请的优先权-于2006年12月13日提交的题目为"多聚Fc受体多肽"的PCT/AU2006/001890，以及-于2007年6月13日提交的题目为"多聚Fc受体多肽"的US11/762,664。通过引用将这些申请的全部内容并入本文。
背景技术：
：自身免疫性疾病和其它炎症疾病如RA和SLE的治疗进入了一个崭新且令人兴奋的阶段，对免疫系统中涉及到的分子认识的增加允许对关4建性的炎症分子如肿瘤坏死a因子(TNFo!)和白细胞介素1/5(IL-1②进行特异性抑制。例如，在近期的研究中，已经证明抗体在RA的发病机理中起了强大的作用，且在人类临床试验中，对去除产生抗体的B细胞的抗CD20单克隆抗体(MAb)疗法的应用发生的阳性反应已经产生了强有力的证据来证明抗体在RA中的显著性角色(Emery等，2001)。由于Fc受体(FcR)在基于免疫球蛋白的效应器系统中扮演关键的角色，FcR功能的抑制可以为很多疾病的有效治疗提供基础。而且，6由于Fcry受体(FcryR)对于IgG的效应器系统是关4建性的，以白细月包FcryRs和抗体之间的相互作用为靶向为RA的治疗介入提供了可能(Nabbe等，2003)。本申请人感兴趣的实现所述介入的一种途径是使用FqR可溶形式作为"假体(decoy)"以防止白细胞被抗体激活。Fc受体(FcR)是与抗体的Fc部分特异结合的白细胞表面的糖蛋白。IgG的受体，即FcryR，分布最为广泛且最具多样性，其主要类型有FctkRI(CD64)、Fc7RII(CD32)、FcryRIII(CD16)。在有机体内正常的免疫反应中形成的免疫复合物(IC)，及见于自体免疫疾病如RA的病理学中的免疫复合物(IC)能同时接合(engage)很多FcR。例如，在人体中，激活的巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜曙红细胞和肥大细胞能表达FcryRI、FcyRIIa、FryRIIb和FcyyRIII(Takai，2002)。然而，在这些FcR中，Fc下RIIa是IC-介导的炎症的主要引发物，且尽管所有FcyR型接合IgGFc结构域(domain)和CH2结构域的下4交4连区(lowerhingeregion)以至于任何可溶性Fc7R假体多肽均可以抑制IgG与所有种类的Fc7R结合，本申请人认识到由于Fc7RIIa显示出对强烈的IgG免疫复合物结合最广泛的结合特异性和最高的选择性，可溶性Fc7RIIa的发展和研究提供了最大的潜力。实际上，现有研究已经证明简单的重组可溶性FcyyRIIa多肽(rsFcyRIIa单体)，包含FcryRIIa外结构域(Ierino等，1993a)，明显能抑制IC-介导的炎症。在这些研究中，用Arthus反应测试rsFc7RIIa，其中免疫复合物通过被动给予抗体和抗原在真皮中形成(Pflum等，1979)，这是血管炎(关节炎中额外的关节并发症)的一种模型，也发生在SLE中。发现在rsF(ryRIIa单体与抗体和抗原同时给药抑制炎症和嗜中性粒细胞渗透时，因对免疫复合物相对低水平的选择性而需要大量的rsFc7RIIa单体。为了解决这个问题，本申请人建议用rsFc^RIIa假体的多聚体形式，且惊喜地发现，这些多聚体形式不仅能成功表达，且对免疫复合物表现出增高的选择性。这些多聚rsFcryRIIa多肽因此显示出治疗诸如RA和SLE的IC-介导的炎症疾病的可观前景。发明概述因此，在第一方面，本发明提供了能够抑制白细胞Fc7受体(FcryR)与免疫球蛋白G(IgG)的相互作用的可溶性多聚多肽，所述多肽包含两个或更多以首对尾排列方式连接的Fc结合区，以及经修饰以降低或防止与所述Fc结合区结合和/或改变效应功能的免疫球蛋白的Fc结构域，其中至少一个Fc结合区4汙生自Fc7R型受体。优选地，多肽是衍生自Fc7Ri1型受体，特别是Fc7RIIa的Fc结合区的多聚体。这种分子可以被认为是同源多聚体，一种特别优选的这种类型的分子是衍生自F(ryRII型受体的Fc结合区的同源二聚体。然而，本发明也包括下述情形分子可以是衍生自Fc7R型受体(如Fc7RH型受体)的Fc结合区及另外来源的Fc结合区(如来自另一Fc受体型或合成性Fc结合多肽的Fc结合区)的多聚体。这种类型的分子可以4皮认为是异源多聚体，一种特别优选的此类分子是衍生自Fc7RII型受体的Fc结合区和衍生自FcryRIII型受体的Fc结合区的异源二聚体。Fc结合区可以通过肽键或通过短连接子序列(如单个氨基酸或例如2至20个氨基酸长度的短肽)相连。在第二方面，本发明提供了包含如第一方面所述多肽的可溶性多聚蛋白质。在第三方面，本发明提供了包含编码如第一方面所述多肽或如第二方面所述蛋白质的核苷酸序列的多聚核苷酸分子。所述多聚核苷酸分子可以存在于表达盒或表达载体中(如导入细菌宿主细胞的质粒，或病毒载体如用于转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体，或质粒或病毒载体如用于转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒)。因此，在第四方面，本发明提供了包含第三方面所述的多聚核苷酸分子的重组宿主细胞。在第五方面，本发明提供了制备多肽或蛋白质的方法，所述方法包含以下步骤(i)提供包含如第三方面所述的多聚核芬酸分子的重组宿主细胞，(ii)在合适的培养基中和适合于所述多肽或蛋白质表达的条件下培养所述宿主细胞，及(iii)从培养物，以及任选地从培养基中，分离所述多肽或蛋白质。在第六方面，本发明提供了治疗个体炎症疾病的方法，所述方法包括将如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白质给予所述个体，所述多肽或蛋白质任选地与药学上或兽医可接受的载体或赋形剂结合。附图简述图1提供了两个Fc7RIIa细胞外区域的首对尾同源二聚体构建体的核苷酸序列(及翻译后的氨基酸序列)，每一区域都包含两个FcryRIIa外结构域即外结构域1和外结构域2。所述Fc7RIIa外结构域1和外结构域2由FcyRIIa多肽序列的氨基酸1至174组成，氨基酸1至88包含结构域1,氨基酸89至174包含结构域2(HIbbsHibbs等，1988;人类IgG的Fc片段，低亲和性IIa受体(CD32)(FCGR2A)，mRNA，ACCESSIONNM—021642;和Powell等，1999)。图中，氨基酸1至182衍生自Fc下RIIa的纟田月包夕卜区，其中氨基酸1至174包含FcryRIIa的外结构域1和外结构域2，氨基酸175至182包含膜近端茎(其在FcryRIIa中将外结构域1和外结构域2连接至跨膜序列)。因此包含二聚物的Fc7RIIa第一个细胞外区由氨基酸1至182组成，且FcryRIIa第二个细胞外区由氨基酸184至362组成(对应于Fc7RIIa的氨基酸3至182)。加下划线的氨基酸表示非FcyyRIIa连接子的氨基酸残基，粗体的氨基酸则突出显示了C端His6标签。图2显示由图1所示的核苷酸序列表达的重组可溶性(rs)多聚形式的FcryRIIa的蛋白质印迹分析(WestemBlotanalysis)。rsFc7RIIa二聚体基本上是稳定的，只有一小部分rsFc7RIIa单体分解产物的迹象。另一方面，rsFc7RIIa三聚体和四聚体形式是不稳定的，基本上降解为rsFc7RIIa二聚体形式。这种降解可以通过制备时使用蛋白酶抑制剂或另外通过修饰多聚体形式的序列以移除裂解位点加以避免。图3显示从具有30kDa期望大小的rsFc7RIIa单体(哺乳动物细胞表达)(a)和具有SOkDa期望大小的rsFc7RIIa二聚体(b)的纯化物中收集的部分的考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE(12。/。丙烯酰胺凝胶，在非还原的条件下)。图4图示rsFcryRIIa单体对固定的(a)IgG单体(Sandoglobulin)和(b)模式免疫复合物热聚集的IgG(HAGG)的平衡结合反应。图5图示rsFc下RIIa二聚体对固定的(a)IgG单体(Sandoglobulin)和(b)模式免疫复合物HAGG的平衡结合反应。图6提供了在与人类IgG单体(Sandoglobulin)和二聚体-IgG在溶液中发生在前反应后，rsFc7RIIa单体(a)及由图1的核苦酸序列表达的rsFcryRIIa二聚体(b)与固定的人类IgG单体(Sandoglobulin)结合的图(Wright等，1980)，通过标准BIAcore测定方案确定。图7提供了(a)通过纯化的rsFcyRIIa单体和二聚体对二聚体-IgG与人类嗜中性粒细胞(志愿者V5)结合的抑制，以未被抑制的二聚体-IgG结合活性的百分比计算和(b)通过纯化的rsFcryRIIa二聚体(由图1的核苷酸序列所表达)对二聚体-IgG与人类嗜中性粒细胞(志愿者VI)结合的抑制，以二聚体-IgG结合二聚体的百分比计算。图8提供了(a)在rsFcyRIIa二聚体(2.5pg/ml,在上清中)不存在和存在时，免疫复合物(二聚体-IgG)刺激的TNF从分化24小时的人类MDMs(志愿者V5)中分泌的图；(b)在rsFc7RIIa二聚体(2.5pg/ml)不存在和存在时，免疫复合物(二聚体-IgG)刺激的TNF从分化24小时的人类MDMs(志愿者Vl)中分泌的图。图9提供了免疫复合物(HAGG)刺激人类血小板活化的图，通过在rsFc7RIIa二聚体(30i!g/ml)不存在和存在时，P-选择素表达的平均荧光强度(MFI)来测定。图10提供了在(a)非还原和(b)还原条件下的SDS-PAGE、(c)采用抗Fc^RIIa抗体的蛋白质印迹以及(d)HPLC时，分离自稳定转染的CHO-S细胞的rsFc7RIIa二聚体的分析结果。所述rsFc7RIIa二聚体在期望的分子量(50kD)处迁移出单带，与抗Fc7RIIa抗体反应，且通过HPLC分析确定纯度大于96%。图11提供了在rsFcryRIIa单体或rsFc^RIIa二聚体存在时，免疫复合物(HAGG)与细胞表面表达的人类rsFc7RIIb(在鼠科B淋巴瘤细胞系IIA1.6上)结合的图。图12提供了在rsFc7RIIa单体或rsFcryRIIa二聚体(由图1的核苷酸序列所表达)存在时，用HAGG处理后活化的血小板(CD41和CD62P呈阳性)图，以用HAGG单独处理后活化的血小板的百分比表示。图13提供了在rsFcryRIIa单体或rsFcryRIIa二聚体存在时，用OVA免疫复合物孵育后，TNF-a从MC/9细胞中释放的图，以在OVA免疫复合物单独存在时TNF-a释放的百分比表示。图14显示rsFc7RIIa融合蛋白的蛋白质印迹分析。(1)rsFc7RIIa单体；(2)rsFcryRIIa二聚体；(3)融合于IgG,-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa单体;(4)融合于IgG广Fc71(L234A,L235A)的rsFc，Ia二聚体；。)融合于人类血清蛋白(HSA)的rsFc7RIIa单体；(6)融合于HSA的rsFcr/RIIa二聚体；(7)纯化的rsFryRIIa单体标准品；和(8)纯化的rsFcryRIIa二聚体标准品。图15提供了用rsFcryRIIa单体和rsFcr/RIIa二聚体融合物进行的HAGG-捕获ELISA的结果，(a)以0.75吗/ml开始的rsFcyRIIa单体标准品(Powell等，1999)(单体标准品)；来自于用rsFcyRIIa单体构建体转染的细胞的蛋白质(转染426(单体))；来自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFcyRIIa单体构建体(单体-Fc)转染的细胞的蛋白质；来自于用融合于HSA的rsFcryRIIa单体构建体(HSA-单体)转染的细胞的蛋白质；(b)以0.5^g/ml开始的rsFc7RIIa二聚体标准品(二聚体标准品)；来自于用rsFc7RIIa二聚体转染的细胞的上清(转染427(二聚体))；来自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚体(二聚体-Fc)转染的细胞的上清；来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体(HSA-二聚体)转染的细胞的上清。图16提供了在rsFc7RIIa单体和rsFc7RIIa二聚体融合蛋白质上的捕获-标签ELISA(CAPTURE-TAGELISA)中获得的结果，以i正实确立受体一皮合适地折叠的抗原表位的存在。(A)以0.75pg/ml开始的rsFc7RIIa单体标准物(单体标准品)；来自于用rsFc7RIIa单体(转染426(单体))转染的细胞的上清；来自于用融合于IgG-Fc7l(L234A,L235A)的rsFcyRIIa单体(单体-Fc)转染的细胞的上清；来自于用融合于HSA的rsFcryRIIa单体(HSA-单体)转染的细胞的上清；(B)以0.5^g/ml开始的rsFcryRIIa二聚体标准品(实验室内部制备)；来自用rsFcryRIIa二聚体转染的细胞的上清(转染427(二聚体))；来自用融合于IgG-Fc^l(L234A,L"SA)的rsFc^RIIa二聚体(二聚体-Fc)转染的细胞的上清；来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体(HSA-二聚体)转染的细胞的上清。图17提供了(a)rsFcryRIIa单体；(b)rsFcryRIIa二聚体；(c)融合于IgG-Fcryl(L234A，L235A)的rsFcryRIIa单体的二聚体，(d)融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)rsFcryRIIa二聚体的二聚体，(e)融合于HSA的rsFcryRIIa单体；和(f)融合于HSA的rsFcryRHa二聚体的示意图。其中(c)中的二聚化过程是通过rsFc7RIIa单体融合多肽的Fc结构域来实现，提供了具有两个Fc结合区的分子(也就是一个蛋白质分子对Fc结合区而言是二聚的，或具有"二价")；其中(d)中的二聚化过程是通过rsFcRIIa二聚体融合多肽的两个Fc结构域来实现，提供了具有四个Fc结合区的分子(也就是一个蛋白质分子对Fc结合区而言是四聚的，或具有"四价，，)。图中，Dl和D2分别表示外结构域1和外结构域2，D2相邻的实心条表示连接子序列，在(c)和(d)中二聚的Fc结构域上面的暗环表示二硫键，H6则表示His标签；图18显示rsFc7RIIa二聚体(无融合搭档)在小鼠关节炎模型中的作用。在rsFc7RIIa二聚体不存在(黑方块)和存在(白方块)时，用致关节炎的抗胶原抗体处理小鼠；图19提供了本发明实施方案的氨基酸序列，即融合于衍生自IgG2a的Fc结构域的rsFc7RIIa二聚体(此融合蛋白在下文中称为D2蛋白)；图20提供了编码图19中的D2蛋白的核苷酸序列；图21图示了用于表达图20中核苷酸序列(编码D2蛋白)的质粒；图22显示通过SDS-PAGE(A图)和蛋白质印迹(B图)对图19中纯化的D2蛋白的分析；图23显示(图19中的)D2蛋白在MC/9肥大细胞测定中对TNF-释放的影响；图24显示(图19中的)D2蛋白对人类嗜中性粒细胞活化的影响；以及图25显示(图19中的)D2蛋白对人类血小板活化的影响。发明详述本发明提供了能够抑制白细胞F(ry受体(Fc7R)和免疫球蛋白G(IgG)的相互作用的可溶性多聚多肽和蛋白，所述免疫球蛋白G包含两个或更多Fc结合区，其中一个区基本上衍生自Fc7R型受体。这种多肽和蛋白对免疫复合物的选择性高于先前观察到的可溶性单体多肽如rsFcyRIIa单体的选4奪性，因此为作为"假体"分子用于IC-介导的炎症性疾病如RA和SLE的治疗提供了可观的前景。因此在第一方面，本发明提供了能够抑制白细胞Fry受体(Fc7R)和免疫球蛋白G(IgG)之间相互作用的可溶性多聚多肽，所述多肽包含两个或更多以首对尾排列方式连接的Fc结合区，和经修饰以降低或防止与所述Fc结合区结合和/或改变效应器功能的免疫球蛋白的Fc结构域，其中至少一个Fc结合区衍生自Fc7R型受体。如本文所使用，术语"可溶性"表示多肽(或蛋白质)没有结合在细胞膜上，因此其特征为跨膜(也就是亲脂的)结构域的全部或主要部分的缺乏或功能的破坏，以至于多肽(或蛋白质)缺乏任何膜锚定功能。细胞质结构域也可以不存在。如本文所使用，术语"Fc结合区"表示能与免疫球蛋白，包括其基因修饰形式的Fc结构域(如免疫球蛋白的木瓜蛋白酶水解制备的Fc片段)结合的Fc受体以及合成性Fc结合多肽的任一部分或多个部分。所述至少一个书f生自Fc7R型受体的Fc结合区可以书f生自，例如，与IgG有低亲和性，即与IgG的亲和性低于5x107M"的Fc7R。这种低亲和性的受体包括FcyRII型受体(例如包括多形变体、FcryRIIa-H131和Fc7RIIa隱R131的Fc7RIIa(Stuart等，1987;Brooks等，1989;Seki等，1989)、FcryRIIb和Fc7RIIc)、Fc7RHI型受体(例如FcryRIIIa和Fc7RIIIb)、Fc7RI型受体(如FcryRIa和Fc7RIb)的截短形式如包含FcryRI受体三个外结构域中第一个和第二个的截短多肽(Hulett等，1991;Hulett等，1998),及FcryRI的基因修饰形式，所述修饰形式通常对IgG有高的亲和性但是由于修饰(例如一个或更多氨基酸取代、删除和/或添加)显示出与IgG有^氐于5x107mt'的降^[氐的亲和性。优选地，所述多肽为衍生自诸如低亲和性Fc"kR的FcryR受体的Fc结合区的同源多聚体。合适的Fc结合区由Fc7R受体的一个或更多外结构域的全部或一个Fc结合部分或多个部分组成。本领域技术人员能够容易地鉴别FcyR受体的Fc结合外结构域，因为这些结构域属于IgG结构域超家族(Hulett等，1994、Hulett等，1995、Hulett等，1998和Tamm等，1996)且其典型特征为"色氨酸夹层(atryptophansandwich)"(例如Fc7RIIa的残基W90和W113)和其它残基(例如在Fc7RIIa中；外结构域1和外结构域2的连接子残基，及外结构域2的BC(W113-V119)、C，E(F132-P137)和FG(G159-Y160)环(Hulett等，1994))。更优选地，所述多肽为FcryRIIa的Fc结合区的同源多聚体。合适的Fc7RIIa的Fc结合区由Fc7RIIa的外结构域1和外结构域2的全部或一个Fc结合部分或多个部分。Fr/RIIa的外结构域1和外结构域2被发现在FcryRIIa氨基酸序列的1至172位氨基酸内(Hibbs等，1988和ACCESSSIONNM—021642)。Fc7RIIa的外结构域1和外结构域2的Fc结合部分的一个实例是包含FcyRIIa氨基酸序列的90至174位氨基酸的片段，其包括外结构域1和外结构域2连接子残基和外结构域2的BC(W113-V119)、C，E(F132-P137)和FG(G159-Y160)环。X-线结晶学研究表明在此片段内，氨基酸113-116、129、131、133、134、155、156和158-160对能够与IgG的Fc结构域结合的片l殳表面^t出了重要贡献。所述多肽也可以为^f;f生自F(yyRII型受体的Fc结合区和另外来源的Fc结合区(例如衍生自另外Fc受体类型如另外FcryR类型的Fc结合区或书t生自另外免疫3求蛋白受体如IgA和IgE的受体的Fc结合区)的异源多聚体。一种特别优选的此类分子是衍生自Fc7RII型受体(特别地，Fc7RIIa)的Fc结合区和衍生自FcryRIII型受体的Fc结合区的异源二聚体。被认为"衍生自"特定的Fc受体的Fc结合区包括与Fc受体具有等同的氨基酸序列的Fc结合区，以及包含存在于Fc受体的Fc结合区的序列的一个或更多氨基酸修饰。这些氨基酸修饰可以包括氨基酸的取代、删除、添加或这些修饰的任意组合，并且相对于Fc受体的生物活性，这些修饰可以改变Fc结合区的生物活性(例如，所述氨基酸》务饰可以提高免疫复合物的选择性或亲和性，在氨基酸133、134、158-161的这些修饰在国际专利WO96/08512的说明书中有描述)。另一方面，衍生自特定的Fc受体的Fc结合区可以包括一个或更多相对于Fc受体的生物活性而言，基本上不改变Fc结合区的生物活性的氨基酸修饰。此种类型的氨基酸修饰通常包括保守性氨基酸取代。下面的表1给出了示例性的保守性氨基酸取代。想到的特定的保守性氨基酸取代有G、A、V、I、L、M;D、E、N、Q;S、C、T;K、R、H:和P，Na画烷基氨基酸。一般地，保守性氨基酸取代的选择是在它们对(a)取代位置处Fc结合区的多肽骨架的结构、(b)取代位置处多肽的电荷或疏水性，和/或(c)取代位置处氨基酸侧链的大小没有任何实质影响的基础上进行。当包含一个或更多保守氨基酸取代的Fc结合区通过合成制备时，Fc结合区还可以包括不被遗传密码编码的一种氨基酸或氨基酸，例如，羧基谷氨酸和羟基脯氨酸及D-氨基酸。表1示例性保守性氨基酸取代保守性取代AlaVal*,Leu，lieArgLys*,Gin,AsnAsnGin*,His,Lys,Arg,AspAspGlu*,AsnCysSerGinAsn*,His,Lys,GluAsp*，y-羧基谷氨酸(Gla)GlyProHisAsn,Gin,Lys，Arg*lieLeu*，Val，Met，Ala，Phe,正亮氨酸(Nle)LeuNle，Ile*，Val,Met,Ala,PheLysArg*，Gln，Asn,鸟氨酸(Orn)MetLeu*，lie,Phe,NlePheLeu*，Val,Ile，AlaProGly*,羟脯氨酸(Hyp),Ser，ThrSerThrThrSerTrpTyrTyrTrp,Phe*,Thr,SerVallie,Leu*,Met,Phe,Ala,Nle*表示优选的保守性取代所述Fc结合区优选通过肽键或通过短连接子序列(如单个氨基酸或如2至20个氨基酸长度的短肽)连接。然而，在特定情况下，通过其它合适的连接方式(如通过化学交联)来连接所述Fc结合区是优选的或理想的。本发明中所述多肽的Fc结合区是以"首对尾"排列方式连接的。即第一个FC结合区的C-末端("尾")会以串联的方式连接于第二个Fc结合区的N-端("首")。至少有两个Fc结合区，通常为2至4个Fc结合区以这种方式相连，然而多肽可以有多至10个或更多(如20个)个以首对尾排列方式相连的Fc结合区。Fc结合区域通常通过肽键或通过短连接子物序列(例如单个氨基酸或如2至20个氨基酸分子长度或更优选地，2至15个氨基酸分子长度、2至IO个氨基酸分子长度、2至8个氨基酸分子长度或最优选地，2至5个氨基酸分子长度的短肽)相连。合适的短连接子序列可以是短随机序列或可以包括FcryR的短的非Fc结合区片段(例如来自于Fc^R膜茎(membranestalk)的近端区域的20个或更少氨基酸的短片段)。连接子序列可以是合成性连接子序列如，例如对蛋白质水解具有低易感性的GGGGSGGGGS(SEQIDNO:4)。这样的连接子序列可以是2至5个串联的"Gly4Ser"单位的形式。通过肽键或短连接子序列连接Fc结合区允许用重组表达系统制备多肽。因此，在如本发明所述多肽的第一个特别优选的实施方案中，所述多肽包括两个至四个衍生自FcryRIIa以首对尾排列方式连接的Fc结合区。在如本发明所述多肽的第二个特别优选的实施方案中，所述多肽包括两个衍生自FcryRIIa以首对尾排列方式连接的Fc结合区。且在如本发明所述多肽的第三个特别优选的实施方案中，所述多肽包括两个均包含外结构域1和外结构域2的FcryRIIa细胞外区，其中所述细胞外区通过包含l至20个氨基酸的连接子以首对尾排列方式相连。在本发明的一些实施方案中，多肽中的Fc结合区通过组成Fc7RIIa的膜近端茎区的肽连接子相连，以序列PSMGSSSP(SEQIDNO:7)为代表。具有相似二级结构的等价连接子也是有用的，包括并入了保守性氨基酸取代的等价物。此外，这种氨基酸序列的截短和延伸，具有少一个或两个或另外的氨基酸，也是有用的。合适的连接子一般是那些允许多聚多肽采用如下结构的连接子每一Fc结合区均能参与与具有Fc结构域的分子的结合。在这种方式下，连接子允许，例如包含两个已连接的Fc结合区的多肽比相应的单体结合更多数量的具有FC结构域的分子。可以在如本文所示例的筒单的结合实验的基础上选择适合于此目的的连接子。本发明所述的多肽还可以包含载体蛋白质(即，使所述多肽是载体蛋白质和所述两个或更多连接的FC结合区和修饰的FC结构域的"融合物")。载体蛋白质可以是任何本领域技术人员熟知的载体蛋白质，但是优选地，是人类血清蛋白(HSA)或另一种常用于的载体蛋白质以提高生物利用率(也就是当给予个体后，通过提高所述多肽的血清半衰期)。方便地，载体蛋白质可以根据本领域技术人员熟知的任一种方法通过将所述多肽表达为与所述载体蛋白的融合蛋白而融合于所述多肽上。本发明所述的多肽可以进一步包含其它有用的连接的分子，例如乙二醇(也就是制备聚乙二醇化的多肽)以提高生物利用率、补体调节分子如CD46、CD55和CD59，细胞因子(例如能够将细胞因子递送至炎症部位)和细胞因子受体。本发明所述的多肽包括免疫球蛋白的Fc结构域。此Fc结构域能够与另一Fc结构域结合(也就是形成二聚体)从而提供了连接两个或更多如本发明所述的多肽以形成蛋白质的方式。因此，通过利用例如包含两个或更多已连接的Fc结合区的多肽，可以制备出包含至少四个Fc结合区的蛋白质(换句话说，可溶性多聚蛋白质包含四个或更多Fc结合区)，所述多肽融合于能够与另一Fc结构域结合的Fc结构域，所述另一Fc结构域可能相同或不同且其自身已融合于另一包含两个或更多已连接的Fc结合区的多肽，。所述Fc结构域可以选自任一免疫球蛋白(例如IgG如IgG!、IgG2a或IgG4)。野生型形式的IgG4Fc结构域对Fc7Ri1受体具有相对低的亲和性，因此可以无需修饰就用于本发明所述的多肽以避免与所述多肽已连接的Fc结合区(也就是衍生自FcyyRII型受体)的自行退火。然而更理想地，所选Fc结构域是经修饰的(例如通过在对于与Fc受体结合关键的残上的氨基酸取代)以防止Fc结构域与连接的Fc结合区的自行退火(也就是"自结合")，以及优选地，以防止在有机体内与Fc受体结合(也就是，所述修饰的FC结构域对结合内源性Fc受体而不是新生的Fc受体(FcRn)，包括例如FcryRI、FcryRII和F(ryRIII，优选地显示出降低的亲和性)。同样地，所选Fc结构域期望被修饰以改变效应器功能，如此以降低补体结合和/或降低或消除补体依赖性细胞毒性(CDC)。这些修饰已经被例如Clark和其同事广泛地描述，他们设计且描述了一系列突变的IgGl、IgG2和IgG4Fc结构域和它们的Fc7R结合性质(Armour等，1999;Armour等，2002，其内容在本申请中作为参考文献#皮并入)。例如，在234、235、236、237、297、318、320和322位的任一或更多氨基酸可以^皮修饰(例如通过氨基酸取代)以改变与效应器配体，如Fc受体或补体的Cl组分的亲和性(Winter等，美国专利第5,624,821号和第5,648,260号)。同样，在329、331和322位的一个或更多氨基酸可以#^奮饰(例如通过氨基酸取代)以改变Clq的结合性和/或降低或消除CDC(例如被Idusogie等人在美国专利第6,194,551号中描述)，和/或降低或消除抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一特别优选的经修饰的Fc结构域中，Fc结构域衍生自IgG,(Wines等，2000)且包含在氨基酸234和/或235,即Leu"4和/或Leu235上的氨基酸修饰。这些亮氨酸残基处于IgG!的下绞链区内，在那里Fc受体与Fc结构域接合。所述亮氨酸残基的一个或两个都可以被取代或删除以防止Fc受体接合(也就是结合)；例如Leu^和Leu235中的一个或两个可以被丙氨酸(也就是L234A和/或L235A)或另外合适的氨基酸取代(Wines等，2000)。在另一特别优选的经修饰的Fc结构域中，Fc结构域衍生自IgG2a且包含氨基酸235、318、320和322，即Leu235、Glu318、Lys，和Lys322中的任一个或多个的氨基酸修饰。优选地，Leu235用谷氨酸取代，Glu318、Lys，和Lys322用丙氨酸取代。在另一特别优选的经修饰的Fc结构域中，Fc结构域衍生自IgG4，包括人类IgG4，且包含氨基酸228、233、234、235和236中任一个或多个的氨基酸修饰。优选地，在lgG4Fc结构域中的氨基酸修饰引入Pro228、Pro233、Val234、Ala235，且删除236(也就是Del236)。在第二方面，本发明提供了包含如第一方面所述的多肽的可溶性多聚蛋白质。在第三方面，本发明提供了包含编码如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白质的核苷酸序列的多聚核香酸分子。所述多聚核苷酸分子可以存在于表达盒或表达载体中(例如导入细菌宿主细胞中的质粒、或如转染昆虫宿主细胞的杆状病毒载体的病毒载体、或如转染哺乳动物宿主细胞的慢病毒的质粒或病毒载体)。对于包含如本发明所述多肽的二聚体的可溶性多聚蛋白质，本领域技术人员会理解，在宿主细胞中表达时，编码多聚核苷酸分子将会产生融合多肽的单链，此单链然后会产生作为宿主细胞分泌产物的期望的多聚蛋白质。在第四方面，本发明提供了包含如第三方面所述的多聚核苷酸分子的重组宿主细月包。所述重组宿主细胞可以选自诸如大肠杆菌(E.co/z')的细菌细胞、如曱醇酵母(p.;^^on'"的酵母细胞、如甜菜夜蛾Sf9细胞的昆虫细胞、诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴肾细胞(COS)和人胚肾细胞293(HEK293)的哺乳动物细胞以及植物细胞。在第五方面，本发明提供了制备多肽或蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供了包含如第四方面所述的多聚核苷酸分子的重组宿主细胞，(ii)在合适的培养基上和适合于所述多肽或蛋白质表达的条件下培养所述宿主细力包，以及(iii)从培养物，和任选地从培养基中，分离所述多肽或蛋白质。所述多肽或蛋白质可以用本领域技术人员熟知的任一种方法分离。例如，所述多肽或蛋白质可以用金属亲和性色谱技术或用固定化IgG或热聚集的IgG(HAGG)色谱技术容易地分离。在第六方面，本发明提供了治疗个体炎症疾病的方法，所述方法包括将如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白质给予所述个体，所述多肽或蛋白任选地与药学上可接受的或兽医可接受的载体或赋形剂结合。所述方法适合于治疗炎症性疾病如IC-介导的炎症性疾病，包括RA、ITP、SLE、肾小球性肾炎和肝素诱导的血小板减少伴血栓形成综合征(HITTS)。所述个体通常为人类，但是第六方面的所述方法也可以适用于其它动物个体如家畜(例如竟技马)和宠物。术语"药学上可接受的或兽医可接受的载体或赋形剂"意指用于将本发明所述的多肽或蛋白质递送至个体的任一药学上或兽医可接受的溶剂、悬浮剂或媒介(vehicle)。所述多肽或蛋白质可以通过任一本领域技术人员熟知的途径，尤其是静脉给药(iv)、皮内给药(id)和皮下给药(sc)及口服给药和鼻给药对所述个体进行给药。对于皮下给药，可以通过注射或通过插入皮下的导管实现。可选择地，皮下给药可以通过缓释植入组合物或可注射的储存组合物来实现。通常，所述多肽或蛋白质给药的剂量会是每天0.5mg/kg个体体重至15mg/kg个体体重。然而，本领域技术人员明白"有效剂量"(也就是在治疗炎症性疾病中有效的剂量)的量会随着一系列因素包括个体的年龄和一般健康状况及所治疗的炎症性疾病的严重度而变化。为每一特定的个体确定或优化合适的有效剂量在本领域技术人员的技术范围内。在本发明的另一方面，提供了包含如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白质的药物组合物，所述多肽或蛋白质任选地与药学上或兽医可接受的载体或赋形剂结合，以及提供了如第一方面所述的多肽或如第二方面所述的蛋白质在制备用于治疗炎症疾病的药物中的用途。另外，本发明所述的多肽或蛋白质在治疗个体炎症疾病之外的应用中有用。也就是说，它们可用于4企测与自体免疫疾病如RA和SLE的病理学有关的循环免疫复合物(IC)的诊断测定，其中所述多肽或蛋白质可用于"捕获"IC的步骤中(例如通过将所述多肽或蛋白质结合到合适的基质如ELISA培养板上)，取代了这种测定中典型的沉淀步骤(用聚乙二醇)。在从待测定的样品(例如来自于个体的血清或滑液样品)中捕获IC后，所捕获的IC可以用本发明的多肽或蛋白质以一种形式检测，由此所述多肽或蛋白质连接到作为标志物或报告分子的分子(例如放射性同位素示踪标记的分子、化学发光分子、生物发光分子、荧光分子或能产生可检测信号的酶如辣根过氧物酶)上。可选择地，所捕获的IC可以用对某些自身抗原(例如在RA中的瓜氨酸(citrullene)、SLE中的DNA、Sj0gren综合征中的La/SS-B和硬皮病中的DNA拓朴异构酶I)特异性的抗体检测或"探测"以使能够确定特异性自身抗原在循环IC中的水平，这可以允许对自身免疫疾病具有改良的诊断或预后结果的测定的开发。而且，以相似的方式，结合到合适底物上的本发明所述多肽或蛋白质捕获的IC可以用对某些传染性病原体的抗原(例如细菌如葡萄球菌和链球菌、寄生虫如恶性痴原虫(痴疾)和病毒如肝炎C病毒(HCV)、埃-巴二氏病毒(EBV)、人类免疫缺陷病毒(HFV)及诱发登革热的虫媒病毒)特异性的抗体检测或"探测"以在鉴别诱发感染病原体、疾病预后和/或感染处理方面提供有用的信息。另外，本发明所述的多肽或蛋白质在各种生物测定中也是有用的，其中它们可以有效地抑制肿瘤坏死因子(TNF)从细胞，包括巨噬细胞、树状突细胞和嗜中性粒细胞中释放。而且，当连接到如上所述的可以充当标志物或报告分子的分子时，所述多肽或蛋白质可以用于体内炎症部位的成像。进一步地，本发明所述的多肽和蛋白质对与IC-介导的炎症疾病有关的循环IC的移除是有用的，其中所述多肽或蛋白质结合于如惰性珠、纤维或其它表面的合适基质且暴露于来自含有IC复合物的个体的生物流体下(特别是血液)，如此以至于IC被捕获且随后从生物流体中移除。基本上没有IC的经处理的生物流体可以返回至获得所述流体的个体。为了使本发明的性质可以被更清楚地理解，现在结合下述的非限制实施例描述其优选的形式。实施例22实施例1FcR多聚体多肽的制备、纯化和表征材料和方法FryW//a/菜#4这我'谬的一々建通过使用热稳定聚合酶/Vo(Roche)、作为cDNA模板的克隆Hu3.0(Hibbs等，1998,ACCESSIONNM一021642)和引物oBW10GTAGCTCCCCCAAAGGCTG(SEQIDNO:1)和oBWllCTACCCGGGTGAAGAGCTGCCCATG(SEOIDNO:2)，扩增包含人类Fc7RIIa外结构域1和外结构域2的Fc结合区。加下划线于半S"aBI(全部DNA》务饰酶均来自NewEnglandBiolabs)和Smal位点。用T4DNA连接酶将平端PCR产物在用DNA聚合酶I的《/ewow片段补平的五coRI位点处，连接到pPIC9(Invitrogen，LifeTechnologies)载体，得到pBAR14载体。为了制备编码Fc7RIIa串联外结构域的pBAR28载体，pBAR14用S"flBI消化，pBAR14的SwaBI/Smal片段连接于所述SnaBI位点。用于表达FcryRIIa多聚化的外结构域的杆状病毒载体以如下方式构建编码F(ryRIIa前导序列和外结构域1及外结构域2的片段通过用五coRI和义6al消化从pVL-1392中获得(Powell等，1999及Maxwell等，1999),然后连接于4奮饰的pBACPAK9(InvitrogenLifeTech)的五coRIAY&al位点中，其中多克隆位点中的5amHI位点首先通过用SamHI消化去除，用DNA聚合酶的《/ewovv片^殳补平然后再连接。pBAR69载体这种构建体用5amHI消化，连接于pBAR28SamHI片段，得到分别编码Fc7RIIa二聚体、三聚体和四聚体的pBAR71载体、pBAR72载体和pBAR73载体。插入物大小通过五coRI/X6al消化来确定，多聚化5amHI片段的正确取向通过用标准方法的消化来筛选。编码FcryRIIa单体和二聚体的哺乳动物表达载体以如下方式制备使用accuprime#PCR(Invitrogen，LifeTechnologies)*/"增Fc7RIIacDNA克隆Hu3.0(Hibbs等，1988和DEFINITION:HomosapiensFcfragmentofIgG,lowaffinityIIa,rec印tor(CD32)(FCGR2A),mRNA,ACCESSIONNM—021642(定义人类IgG的Fc片段，低亲和性IIa,受体(CD32)(FCGR2A)，mRNA，ACCESSIONNM—021642)，并按照生产商的说明书利用BPclonaseTM反应将FcyRIIacDNA克隆Hu3.0克隆入Gateway载体pDONRTM221(Invitrogen,LifeTechnologies)中，得到pNB6。采用pNB6的聚合酶accuprimep/x连同引物oBWll和oBW302AAG(SEQIDNO:3)的PCR，用消化，用T4连接酶连接，得到编码具有C-末端六个组氨酸标签的rsFcryRIIa的pBAR3卯。用5amHI消化pBAR390,连接于pBAR28的5a附HI片段，得到编码rsFc7RIIa二聚体的pBAR397载体。然后用PraII消化来筛选二聚化5amHI片段的取向以及用ABIBigDye3.1(AppliedBiosytems)测序来证实目标序列。然后用GatewayLR克隆酶反应(Invitrogen,LifeTechnologies)^1Fc7RIIa单体(pBAR390)或二聚体(pBAR397)转移入GatewayTM阅读框架画A盒(Invitrogen，LifeTechnologies)适合的表达载体pAPEX3P(Evans等，1995及Christiansen等，1996)中，得到表达载体pBAR426和pBAR427。同样地，用GatewayLR酶克隆反应将FcryRIIa单体(pBAR390)或二聚体(pBAR397)转移入Gateway阅读框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)适应的表达载体pIRESneo(Clontech)中。图1示出用于构建表达载体pBAR427的pBAR397内的FcryRIIa"首对尾"二聚体构建体的多聚核苷酸序列(及翻译的氨基酸序列)。氨基酸1至174(也就是第一个Fc结合区)和184至362(也就是第二个Fc结合区)作为两个重复显示，且通过Fc7RIIa膜近端茎的短片段(8氨基酸序列；残基175至182)加另外的缬氨酸残基(图1中加下划线的残基183)连接。图1中所示序列的氨基酸-31至-l表示Fc7RIIa的天然前导序列。raFryi//"卓沐;fp二,谬/應的斜务重组可溶性Fc7RIIa(rsFc7RIIa)单体和二聚体多肽在HEK293E细胞中的表达根据生产商的说明书通过在10cn^孔中用5/xg质粒DNA(pBAR426,pBAR427)和阳离子脂质体2000(Lipofectamine2000)试剂(Invitrogen,LifeTechnologies)或Transiti式剂(BioRadLaboratories)哞争染来进行。48小时后，转染的细胞通过在4jag/ml嘌呤霉素中孵育来选择。然后噤呤霉素选择的细胞在添加1%FCS的CD293培养基(Invitrogen，LifeTechnologies)中生长至静止期。重组产物随后通过固定的镍(Qiagen)或钴(Clontech)柱色谱纯化，用Superdex200或SuperdexG75(Amersham/Pharmacia)尺寸排阻色谱法进一步纯化。aFc7i//a卓谬^^二,傳/應袭/p'^^/量的化凝釆用标准BIAcore测定方案(Wines等，2001;Wines等，2003)对纯化的rsFcyRIIa单体和二聚体进行亲和性测量；将不同的浓度的rsFcyRIIa单体或二聚体注射在固定的人类IgG单体(Sandoglobulin,Novartis)或热聚集的IgG(HAGG，Wines等，1988;Wines等，2003)上方60分钟，之后表面会重新形成(Wines等，2003)。人类IgG单体在生物传感器表面的固定化使之成为模拟免疫复合物的多价阵列。raFc^/7a卓谬和二菜沐/农^伊對;^/4的比較纯化的rsF(ryRIIa单体和二聚体用渐增浓度的人类IgG单体(Sandoglobulin)和二聚体-IgG(Wright等，1985)溶液孵育。然后游离受体多肽的量根据标准BIAcore测定方案通过注射在固定化的人类IgG单体上方进行测量。^Pc7i//a卓沐和二菜沐/农^^危^复合務和乂类勿/《潜合的,尸斜在纯化的rsFc7RIIa单体和二聚体不存在和存在时，通过流式细胞计数分析(CurrentProtocolsinImmunology(免疫学通用方法)，WileyInterscience)确定小免疫复合物(以二聚体-IgG为代表)与人类嗜中性粒细胞(志愿者VI和V5)的结合。"Fc^/Az##和二,#/1,,4,于^瘦^合參^^/變的MZ)M^卓核的巨的T7VF为\必的氺尸劍在第一个实验中，外周单核细胞从人类血液(志愿者V5)中提取，用全自动细胞分选仪(MiltenyiBiotec)基于CD14表达进行正向分选，并且用不同浓度的小免疫复合物(以二聚体-IgG为代表)在rsFc7RIIa二聚体(上清中为2.5Mg/ml)不存在和存在下进行刺激前，使外周单核细胞在M-CSF存在下分化24小时，分化至MDMs(单核细胞来源的巨噬细胞)。然后根据生产商的方案(BDPharmingen)通过人类TNFELISA测量来自于MDMs的TNF分泌。在第二个实验中，MDMs在体外从人类血液(这次来自于志愿者Vl)中类似地制备，并且用不同浓度的小免疫复合物(也就是二聚体-IgG)在rsFc7RIIa二聚体(上清中为2.5jiig/ml)不存在和存在下进行刺激前，使外周单核细胞分化24小时。mFct///"二,体,农^^血V、我付义瘦复合參活^的^伊賴洗涤过的血小板通过全血的低速离心(Thai等，2003)制备，用热聚集的IgG(HAGG)刺激。血小板的活化用流式细胞计数法通过P-选择素(CD62P)增加的表面表达来测量(Lau等，2004)。结果^々^虫勿/《的"^^//""#谬和,果^/炎的^这感染的细胞上清的蛋白质印迹分析证实了重组可溶的Fc/yRIIa二聚体和三聚体形式的成功制备(图2)。尽管某些三聚体多肽被检测到，然而其被大量地裂解成二聚体形式，且四聚体没有被检测到，其大量裂解得到二聚体形式。由于FcryRIIa二聚体在本质上是最稳定的，其在哺乳动物表达系统(也就是HEK293E细胞)中被进一步被表征和开发。然而，由于天然的FcryRIIa可以通过蛋白质水解从白纟田月包表面脱落(Astier等，1994),将三聚体、四聚体和更大的多聚体的蛋白质水解最小化的一种策略是消除或者更优选地，替换连接Fc7RIIa细胞外区的膜近端茎(membraneproximalstalk)连4妻子序列。例如，膜近端茎连接子序列的蛋白质水解易感性可以通过一或多个氨基酸修饰(例如一或多个氨基酸取代、删除和/或添加)或通过用合成的连接子序列例如对蛋白质水解具有低易感性的GGGGSGGGGS(SEQIDNO:4)替换那个连接子序列来降低。成功制备三聚体、四聚体和更大多聚体的另一种策略是通过化学交联将已表达的二聚体多肽连接到一或多个单体或其它二聚体多肽。FcyRIIa二聚体的多聚体也可以通过将二聚体多肽表达为一种具有Fc结构域(例如，IgGFc结构域)的融合蛋白质来制备，此融合蛋白质本身是二聚的，因此可以和任一融合伴侣发生二聚化。来々f^#乙动參勿/敏的^Pry///a##;^二菜谬>妖的《这纯化的rsFc^RIIa单体的蛋白质产率是3mg/1(pBAR426构建体)，rsF(ryRIIa二聚体的产率是0.5mg/1(pBAR427构建体)。图3示出收集自rsF(ryRIIa单体和二聚体纯化物的部分的考马斯染色的SDS-PAGE(12%丙烯酰胺凝胶，在非还原的条件下)。rsFc^RIIa单体具有30kDa(a)的期望大小，rsFcryRIIa二聚体具有60kDa(b)的期望大小。^Fryi//a卓体f口二菜傳,炎^和'/^承y量的^凝测定的结果示于图4和图5中。所述测定表明rsFc7RIIa单体具有单结合性位点，其对人类IgG单体的亲和离解常数(Ko)为1.7iuM,对HAGG为1.05pM。在rsFc7RIIa二聚体的情况中，结合数据很好地符合了两个结合位点模型，其对固定的人类IgG单体的亲和离解常数(Kd)为3.2nM(Km)和100nM(KD2);对HAGG为2.73nM(KD1;比单聚rsFc7RIIaKD小将近300倍)和99nM(KD2)。^Fc^//fl卓谬和二果沐/應"/伊斜活嫂的化較所进行的比4交rsFcryRIIa单体和二聚体多肽抑制活性的实-睑显示，在溶液中rsFc7RIIa单体(图6a)并不区分人类IgG单体和小免疫复合物(即由二聚体-IgG为代表的)。相比之下，rsFc7RIIa二聚体(图6b)在溶液中选择性地与小免疫复合物(也就是二聚体-IgG)而不是人类IgG单体结合。/xFc^//a卓##口二菜#/妖^t^瘦复合參与人类细i^潜合的^尸劍抑制测定的结果示于图7a和图7b中，其表明rsFcryRIIa二聚体27(IC5。=1.1pg/ml)在抑制小免疫复合物(也就是二聚体-IgG)与人类嗜中性粒细胞结合方面比rsFcryRIIa单体(ICs『10.5pg/ml)的活性高十倍。结果还显示rsFcryRIIa二聚体对小免疫复合物(二聚体-IgG)与人类嗜中'性粒细胞结合的抑制在来自于两个不同个体的嗜中性粒细胞上是可复制的，其ICs。值为0.9-1.1|ig/ml。mFc^//"卓谬和二,举,應,^求々；fA瘦复合參冉激的MDM^卓核的^勿應)的为\必的#尸*结果示于图8a和图8b中。rsF(ryRIIa二聚体看起来抑制了TNF从免疫复合物(也就是二聚体-IgG)刺激的分化24小时的人类MDMs中的分泌。raFryi//fl二菜伴多戚^A血V、^的^^€复合#活化的押劍洗过的人类血小板在30pg/ml的rsFcryRIIa二聚体存在和不存在时，用HAGG(IOpg/ml)孵育30分钟。如图9所示，发现在rsFcyRIIa二聚体存在时血小板的活化被抑制，如P-选择素(CD62P)的较少表达所iiL明的。讨论以单聚(rsFc7RIIa单体)和二聚(rsFcryRIIa二聚体)形式的重组可溶性Fc7RIIa在HEK293E细胞中成功表达。BIAcore平衡结合测定表明rsFc7RIIa二聚体对固定的IgG(Sandoglobulin)具有强于单聚受体~300倍的亲和力(也就是在与固定的IgG作用中，rsFc7RIIa单体具有1pM的KD，rsFcryRIIa二聚体具有3nM的KD)。用BIAcore的竟争实验还表明所述rsFcr/RIIa二聚体选择性地与结合小免疫复合物，且选择性抑制活性用来自于两个捐献者的嗜中性粒细胞在基于细胞的测定中得到证实。所述rsFc^RIIa二聚体还^皮证明作为小IgG免疫复合物结合的抑制剂比rsFc7RIIa单体强约10倍，且在标准血小板测定中，所述rsFcRIIa二聚体被观察到完全抑制血小板的免疫复合物活化(也就是rsFcryRIIa二聚体是细胞活化的强有力抑制剂)。因此本发明所述的rsFc^RIIa二聚体和其它可溶的多聚蛋白质和多肽被认为对IC-介导的炎症性疾病如RA和SLE的治疗显示出可观的前景。实施例2rsFc7RIIa二聚体多肽的制备、纯化和表征材料和方法aFc7i//a二果沐>I的*务如实施例1中所述的Fc7RIIa二聚体构建体在经修饰的CMV启动子的调控下被克隆入哺乳动物表达载体。然后稳定的CHO-S转染物通过如下方式建立收集90%汇合的CHO-S细胞，洗涤三次，将15ml培养基中的2xl0个细胞分散至10cm培养皿(petridishes)。然后将线性化DNA-阳离子脂质体2000(LinearisedDNA-lipofectamine2000)复合物(1:2.5比例)在室温下孵育5分钟，逐滴加入到细胞中。随后，细胞在37°C孵育48小时，然后以在CD-CHO培养基中的有限稀释铺于96-孔板中，所述培养基补充有600pg/ml潮霉素B、8mML-谷氨酸、lxHT添加物和50pg/ml葡聚糖碌lJ吏醋。细胞用标准ELISA法筛选以检测可溶的FcryRIIa蛋白，最高表达株通过有限稀释再次亚克隆。一个克隆(#6)分泌约40mg/L的FcryRIIa二聚体，于30°C下在振荡烧瓶中孵育进行最优化的蛋白表达。包含rsF(yyRIIa二聚体的上清通过正切流动过滤(Tangentialflowfiltration)浓缩，在20mMpH为7.4的磷酸钠緩冲液中^皮交换。然后所述样品在20mM磷酸钠和0,5M氯化钠中稀释4倍，通过HisTrapFF2x5ml柱(GEHealthcare),在20mM磷酸钠、0.5MpH为7.4的氯化钠和100mM咪唑中洗脱来纯化。透析洗脱的物质并通过采用25mlQFF柱(GEHealthcare)、150mM氯化钠洗脱的离子交换色谱来纯化。然后纯化的物质在磷酸緩冲盐中透析。^Fc7i/7a二果伴/戚/,/^(GG与Fc7///6潜合的逸錄纯化的rsFc7RIIa二聚体阻断免疫复合物与细胞表面FcyyRIIb结合的能力通过流式细胞计数测定来评估。热聚集的IgG(HAGG)与不同浓度的rsFcyRIIa二聚体或rsFc7RIIa单体(R&DSystems,Cat存1330-CD/CF)在4°C孵育1小时。然后将这些混合物加入到包含105个用人类Fcr/RIIb转染的IIA1.6细胞的96-孔板中(IIA1.6是缺乏内源Fc7R表达的小鼠B淋巴瘤株)。所述板在4。C孵育1小时，洗涤，然后用抗hlgG-FITC偶联物着色以检测已结合的HAGG。洗涤后，细胞用标准方法在FACS扫描流式细胞仪上分析。/xPc^//a二,谬/應对/^GG-漆发的AV、^活化的胆餘血小板与HAGG的接触导致了通过FcryRIIa的活化，引起P-选择素(CD62P)的上调。rsFc7RIIa二聚体或rsFc7RIIa单体阻断这种激活的能力通过流式细胞计数测定来评估。热聚集IgG(HAGG)与不同浓度的rsFc7RIIa二聚体或rsFcryRIIa单体(R&DSystems,Cat弁1330-CD/CF)在4。C孵育1小时。然后将所述混合物加入到包含3xl0个人类血小板的96-孔板中，所述血小板事先洗涤过且重悬在添加有1mMEDTA的Tyrodes/Hepes緩冲液中。在室温下孵育30分钟后，将所述细胞洗涤、固定且用标准方法着色以进行CD62P和GPIIb(CD41)表达的检测，在FACS扫描流式细胞仪上分析。aFc7i//a二,^,應逸辟义瘦复合4^资发'的MG9法化MC/9是Fc7R-阳性的鼠肥大细胞系，其接触免疫复合物后，会活化且释放TNF-a。使用由卵白蛋白和抗卵白蛋白抗体(OVAICs)组成的作为刺激物的免疫复合物来评价rsFcr/RIIa二聚体或rsFcryRIIa单体阻断这种活化的能力。OVAICs(10!ig)与不同浓度的rsFcryRIIa二聚体或rsFc7RIIa单体(R&DSystems，Cat弁1330-CD/CF)在室温下孵育1小时。然后将所述混合物加入到包含2xl()S个MC/9细胞的96-孔板中，在37。C孵育过夜。收集上清，使用商业ELISA试剂盒(BDBiosciences)测量TNF-a的量。MFryi//"二,傳^入类Fc7///a脊染的V、處模型哞#刺谬发#^，^使用人类FcryRIIa转基因小鼠的关节炎模型来评估rsFcryRIIa二聚体的活性，所述转基因小鼠在已公布的PCT申请WO03/104459中被30描述，通过引用的方式将该申请并入本文。这些小鼠表达编码人类Fc7RIIa的转基因。直到溶于PBS中的单克'隆抗体M2139的单次2mg剂量给药后的至少第四天才引起这些小鼠发生临床明显的关节炎疾病(用标准关节炎指数确定)，所述溶于PBS中的M2139是与胶原II的Jl表位，氨基酸551-564特异性结合的IgG2a。所述单克隆抗体是由被证明为致关节炎的杂交瘤纟田月包来制备的(Amirahmadi等，爿W力n7/sawJi/zewma"sm(关节炎和风湿病)，2005年6月；Nandak腿ar等，A,Anto7e廳rc/z朋d772era"(关节炎研究和治疗)，2004年5月)。所述小鼠是使用如图1所示的可溶性FcryRIIa二聚体以如下步骤处理的四只Fcr/RIIaTg小鼠用0.5mg可溶性Fc7RIIa二聚体注射，四只小鼠的对照组则经腹腔注射给予PBS。两小时后，两组均注射2mgM2139(经腹腔注射)和1mg快速注射剂量(bolusdose)的二聚体或PBS。在注射M2139后的24小时和48小时再次给予二聚体(0.5mg/剂量)。关节炎被常规评分，最大可能分值是12。四个脚爪评分的和，每一个为0-3分(0=正常；1=一个受累的关节，红斑，轻微肿胀；2=两个或更多受累的关节，踝/腕肿胀；3=所有关节均受累，丧失活动性/关节强硬，深度红斑和水肿)。结果^Fc^//a二果傳/农的*务图10示出纯化的rsFqRIIa物质的分析，包括SDS-PAGE(在还原和非还原的条件下)、用抗Fc7RIIa抗体(R&DSystems,目录号AF1875)和作为才企测抗体的兔抗山羊IgG过氧化物酶的蛋白质印迹，以及HPLC。所述多肽在期望的分子量(50kD)处迁移出单带，与抗FcryRIIa抗体反应，且通过HPLC确定纯度大于96%。^Fc^/Az二菜伴/應逸辨/ZJGG与Fryi/仏的潜合HAGG结合测定的结果示于图11中。rsFc7Rna二聚体和rsF(ryRIIa单体均能够完全阻断HAGG与细胞表面FcryRIIb的结合。然而，rsFcyyRIIa二聚体(IC5。二3.9ng/ml)的效力比单体蛋白质(IC5o二2082ng/ml)的效力超过500倍。^Fr^Z/a二,举/炎逸辟/^GG渗爭的iV、我活化血小板活化测定的结果示于图12中。用HAGG单独处理后活化的血小板的百分比定义为100%。rsF(ryRIIa二聚体和rsFc7RIIa单体均能够显著降低HAGG诱导的CD62P的上调。滴定法显示rsFcryRIIa二聚体(ICs『3.9/ig/ml)比rsFc7RIIa单体(ICs『20.9Mg/ml)强5倍。二菜伴/戚胆餘名瘦f合參谬爭的MC/9话/AMC/9活化测定结果示于图13中。用OVAICs单独孵育后TNF-ce的释放量定义为100%。rsFc7RIIa二聚体和rsFc7RIIa单体均能够完全抑制免疫复合物诱导的TNF-ce释放。滴定法显示rsFc7RIIa二聚体(IC50=2.1/ig/ml)比rsFc7RIIa单体(1(]50=17.7/ig/ml)强8倍。二,谬^乂类Fc7i//a脊差^的V、處模型#浙劍渗发#^貫义如图18中所示，rsF(ryRIIa二聚体的给药提供了关节炎分值显著的下降。另一个实验证实了二聚体介导的关节炎分值的下降，虽然以不太显著的方式。讨论所述rsFcryRIIa二聚体在CHO-S细胞中成功地表达。还原条件下和非还原条件下的SDS-PAGE显示纯化的rsFcryRIIa二聚体大小接近50kDa,蛋白质印迹显示二聚体被抗Fc7RIIa抗体特异性地结合。rsFcryRIIa二聚体通过HPLC确定的纯度为96%。rsFcr/RIIa二聚体和rsFc7RIIa单体均完全阻断HAGG与细胞表面FcryRIIb的结合，且rsFc7RIIa二聚体具有比rsFc7RIIa单体高将近500倍的阻断效率。类似地，rsFcyRIIa二聚体和rsFc7RIIa单体均显著降低了HAGG诱导的血小板活化，且二聚体显示出比rsFc7RIIa单体高将近5倍的效率。进一步地，通过TNF-O!释放测量，rsFqRIIa二聚体和rsFc7RIIa单体均抑制了小鼠肥大细胞系(MC/9)活化，且二聚体显示出比单体强8倍的效率。重要的是，rsFc7RIIa二聚体在诱发性关节炎的小鼠模型中减轻了关节炎，表明了其在体内的功效。实施例3包含衍生自IgG,的Fc结构域的rsFc7RIIa融合多肽的设计和表达材料和方法"Fr/i//"融合錄4这裁体的一々建编码可溶性单体FcryRIIa或可溶性二聚体FcryRIIa的多肽独立地融合于编码IgG广Fc7l(L234A，L235A)的多聚核芬酸。在共价连接两个Fc部分下绞链区的链间二硫键N-末端侧的位置，将可溶性单体Fc7RIIa多肽的C-末端可操作地融合于人类IgGi多肽。这个位置的融合形成单聚的Fc7RIIa-IgG广Fc7l(L234A，L235A)融合蛋白，所述蛋白由于共价连接的Fc结构域之间的相互作用会与另一个Fc结构域二聚化。所述IgG绞链区以其柔性而出名，包含Fc结合区的多肽与下绞链区链间二硫键的N-端侧的融合允许Fc结合区进行相当自由的运动。相似地，在共价连接两个Fc部分的下绞链区的链间二石克4建N-末端侧的位置，将可溶性二聚体Fc7RIIa多肽的C-末端可操作地融合于人类IgG,多肽。编码可溶性单体FcryRIIa或可溶性二聚体Fc7RIIa的多聚核香酸以与先前在国际专利说明书第WO96/08512号中描述的方式等同的方式独立地融合于编码人类血清蛋白(HSA)的多聚核苷酸。如上述专利说明书所公开的，HSA融合于rsFc^RIIa单体的N-末端。以相似的方式，所述HSA融合于rsFcryRIIa二聚体的N-末端。编码不同融合多肽或蛋白质的多聚核苷酸用标准克隆技术可操作地4吞入到Papex3P-xDEST。raFcy7/a卓沐和,？Fcy^/a二,'体/融》#的賴备rsFcryRIIa单体和二聚体融合物表达载体用标准方法瞬时转染到CHOP细胞中、稳定转染到293E细胞中。瞬时转染的CHOP细胞上清用抗Fc7RIIa抗体8.2(Powell等，1999)进行免疫沉淀反应，免疫沉淀物进行非还原的SDS-PAGE(12%)。然后用标准方法进行蛋白质印迹分析，兔抗FcryRIIa抗体(Maxwell等，1999)作为一抗且抗兔Ig-HRP作为二抗。合參进行HAGG-捕获ELISA以测量rsFc7RIIa融合物的Fc结合活性。为检测rsFc7RIIa单体融合物的结合活性，滴定已知的FcyRIIa单体标准品(Powell等，1999)(以0.75|ig起始)和来自于rsFc7RIIa单体转染的细胞的蛋白(转染426)，与来自于用融合于IgG-Fcyl(L234A，L235A)的rsFcyRIIa单体(单体-Fc)转染的细胞的蛋白和来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa单体(HSA-单体)转染的细胞的蛋白进行结合性比较。为检测rsFcryRIIa二聚体融合物的结合活性，滴定已知的Fc7RIIa二聚体标准品(以0.5i!g/ml起始)和来自于rsFcryRIIa二聚体转染的细胞(转染427)的蛋白，并与来自于用融合于IgG-Fql(L234A，L235A)的rsFcryRIIa二聚体(二聚体-Fc)转染的细胞的蛋白和来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体(HSA-二聚体)转染的细胞的蛋白进行结合性比较。#获标蕃￡"丄/&4fa^we-JVzg五ZJ&4)^fy会烤脊染的C/ZO尸勿應J:清的raFqi^/a融合錄采用标准ELISA方法，板用抗FcryRIIa抗体8.2包被。将所述rsFc7RIIa融合物加入到孔中，且与所述8.2抗体接触。二抗为抗FcryRIIa抗体8.7-HRP(Powell等，1999;Ierino等,1993a),其与抗体8.2特异于不同的FqRIIa抗原表位。所测试的单聚rsFcryRIIa样品包括已知的rsF(ryRIIa单体.(以0.75pg/ml起始的单体标准物)、来自于rsFc7RIIa单体转染细胞(转染426)的上清、来自于用融合于IgG-Fcyl(L234A，L235A)的rsFc，IIa单体(单体-Fc)转染的细胞的上清和来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa单体(HSA-单体)转染的细胞的上清。所测试的二聚rsFcr/RIIa样品包括已知的rsFc7RIIa二聚体(以0.5Hg/ml起始的二聚体标准品)、来自于rsFcryRIIa二聚体转染细胞(转染427)的上清、来自于用融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsF(ryRIIa二聚体(单体-Fc)转染的细胞的上清和来自于用融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体(HSA-单体)转染的细胞的上清。结果^Pc^/7a卓沐和二,举厨合的表这才艮据纯化的rsFcyRIIa单体和rsF(ryRIIa二聚体的活性，分泌的所述rsFc7RIIa单体-IgG-Fcryl(L234A，L235A)融合物的水平(在293E细胞中约为12pg/ml)高于所述rsF(ryRIIa二聚体-IgG-Fcryl(L234A,L235A)融合物的水平(在293E细胞中约4|ng/ml)。如图14所示，蛋白质印迹分析表明所述融合蛋白以期望的分子量大小在上清中存在，且它们可以被成功制备为无降解产物迹象的独特蛋白。合參如图15(a)中所示，融合于IgG-Fc7l(L234A，L235A)的rsFc7RIIa单体在测定中出现可4全测地结合，融合于HSA的rsFcr/RIIa单体(HSA-单体)则被观察到结合很弱。此结果可以通过下述事实加以解释通过融合的Fc结构域重链间的二聚化导致融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFcryRIIa单体为二聚体，而融合于HSA的rsFc7RIIa单体对Fc结合区而言仍然是单体的。如图15(b)中所示，融合于IgG-F(yyl(L234A,L235A)的纯化的rsFc7RIIa二聚体(二聚体-Fc)显示出与二聚体标准品相似的结合活性，融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体(HSA-二聚体)具有可检测的但较低的结合活性。在此实施例中，由于融合的Fc结构域重链间的二聚化，融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚体对于Fc结合区是四聚的(或者"四价的，，)，而融合于HSA的rsFc^RIIa二聚体对Fc结合区仍然是二聚的。(T印^"e-tog￡X/&4」^7f脊染的勿應丄清^融合參的趁都如图16(a)中所示，融合于IgG-Fc71(L234A，L235A)的rsFryRIIa单体和融合于HSA的rsFcryRIIa单体在该测定中均被捕获并是可检测的。如图16(b)中所示，融合于IgG-Fcryl(L234A，L235A)的rsFcryRIIa二聚体和融合于HSA的rsFcryRIIa二聚体在该测定中也都被捕获并是可检测的。明显地，用于捕获这些受体的8.2抗原表位和用于检测捕获的受体的8.7抗原表位都是完整的，表明了融合物的正确折叠。讨论所述rsFcryRIIa单体和rsFc7RIIa二聚体融合构建体从载体p-APEX3P-xDST中表达，在CHOP细胞中瞬时表达以及在293E细胞中稳定表达。所表达的融合物在蛋白质印迹上没有降解产物的迹象，呈现为清晰蛋白条带。融合于IgG-Fcryl(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚体可以显示出比其单体对应物较低的表达水平。然而，如蛋白质印迹(图14)所确定的，融合于HSA的rsFc7RIIa二聚体的表达水平与融合于HSA的rsFc7RIIa单体的表达水平近似等同，因此作为大量制备rsFc7RIIa二聚体的方式显示出可观的前景。令人感兴趣的是，rsFc7RIIa二聚体融合物显示出比其单体对应物更高的HAGG和抗FcryRIIa抗体8.2结合活性。如上所述，这可以通过下述事实加以解释rsFc^RIIa二聚体融合物对Fc结合区为二聚的或四聚的(在融合于IgG-Fc71(L234A,L235A)的rsFc7RIIa二聚体的例子中)，因此rsFc7RIIa二聚体融合物由于这种多价性具有较高的表观结合亲和性(亲和力)。四聚的分子被预期可以以结合基本上为不可逆的这种亲和性与免疫复合物结合。实施例4包含衍生自IgG2a的Fc结构域的rsFr/RIIa融合多肽的设计和表达在此实施例中，使用修饰的鼠IgG2a的Fc结构域为融合伴侣制备rsFc7RIIa二聚体融合蛋白。所述二聚体融合蛋白被指定为D2。将此蛋白的活性与缺乏融合伴侣的rsFcryRIIa二聚体(如实施例1和实施例2所描述的)进行比较，且与rsFc7RIIa单体融合蛋白比较，其中所述融合伴侣为修饰的鼠IgG2aFc结构域。,逾T溶'/4"^FcY^Z/aFcP"蛋^|的沒D2蛋白翻译后的氨基酸序列(SEQIDNO:8)和核苷酸序列分别示于图19和图20中。所述D2蛋白包括由天然Fcr/RIIa信号序歹'j(氨基酸l-31)、Fcr/RIIa蛋白的细胞外结构域(氨基酸32-205)、对应于Fcr/RIIa膜近端茎的短连接子加上另外的缬氨酸残基(残基206-214)、另一个FcryRIIa蛋白(残基215-385)、膜近端茎连接子的重复(残基386-393)和小鼠IgG2aFc结构域(绞链-CH2-CH3)区(残基394-625)组成的多肽的二聚体。所述IgG2aFc结构域包含下列四种突变，其^皮引入以减少Fc受体结合和补体结合亮氨酸-413突变为谷氨酸(对应于EU编码系统中的235位)、谷氨酸-496突变为丙氨酸(对应于EU318位)、赖氨酸-498突变为丙氨酸(对应于EU320位)及赖氨酸-500突变为丙氨酸(对应于EU322位)。/^^迷我'谬的#建编码人类Fc7RIIa的信号肽和细胞外结构域的cDNA通过PCR扩增，使用先前构建的质粒(Fc7RIIa-d/pAPEX-dest)为模板并使用如表1所示的引物1和引物4。突变的小鼠IgG2aFc区通过PCR扩增，使用先前构建的质粒(CD200IgG2aFc-d)为模板、如表2所示的引物2和引物3。表2用于质粒构建的引物(限制酶位点加下划线)<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>然后通过4吏用引物1和引物2的重叠PCR(overlappingPCR)扩增Fc7RIIa和修饰的小鼠IgG2aFcPCR产物。在1mMMgS04、0.4mM的每种dNTP、20pM每种引物和100ng模板DNA中，使用白金牌(platinum)尸/xDNA聚合酶(Invitrogen)在下列条件下进行扩增在94°C起始熔解(initialmelting)5分钟，接着进行30个由94。C1.5分钟、然后65。C2分钟，然后72。C3分钟组成的循环。随后将此反应在72°C保持10分钟，冷却到4°C。反应产物通过0.7%的琼脂糖凝胶进行电泳，用溴化乙4走显影。通过采用QIAquick凝月交提取试剂盒(Qiagen)，将感兴趣的DNA条带从琼脂糖凝胶中切除并纯化。此纯化的PCR产物用A^e/和爿ge/限制酶消化，用QiaquickPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化。然后通过T4DNA连接酶将所述片段连接到已被用iWe/和爿ge/进行了相似消化的pMPG表达质粒中。然后根据生产商的说明，将连接反应物(ligationreaction)(5pl)转化入50|il感受态大肠杆菌C&c/^n'c/^(3co/z〕D/Z5a纟田胞(Invitrogen)中。将转化物铺于含有100iug/ml氨比西林的LB-琼脂板中，接着在37。C孵育16小时。通过小量制备法(mini-prep)从小量大肠杆菌(E.co")培养物中纯化质粒DNA，并证实DNA序列。得到的表达质粒pMPG-D2FqRnA-IgG2aFc的示意图显示于图21中。4这"2^C//6>^謦的y^^:使用质粒Maxi试剂盒(Qiagen)，从大肠杆菌的大量培养物中分离pMPG-D2Fc7RIIa-IgG2aFc质粒DNA,用la/使其线性化，并通过使用QIAGENTips纯化所述质粒DNA。使用阳离子脂质体(Lipofectamine2000)试剂用线性化的质粒转染在无血清的化学成分明确的培养基中生长的CHO-S细胞。48小时后，所述细胞在包含600pg/ml潮霉素B的培养基中在不同浓度(10000、5000或2000细胞/孔)下转移到96-孔板中。抗药的寡克隆通过ELISA用如下步骤筛选96-孔板用100pl山羊抗小鼠IgGFc(Sigma)包被，在4。C孵育过夜。洗涤所述孔，用200pl溶于PBST中的2%BSA在室温下封闭1小时。洗涤后，将100pl样品用溶于PBST中的1。/。BSA稀释，加入到孔中，孵育1小时，洗涤，然后用HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG(Fc特异性)(Sigma)在室温下孵育1小时。洗涤所述孔，加入TMB底物，在室温下孵育3至5分钟。在450nm处测量吸光度，用已知量的纯化的小鼠IgG或D2Fc7RIIa-IgG2aFc构建标准曲线。上清样品还通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行分析。对于SDS-PAGE,样品重悬于有或没有2-ME的样品M^冲液中，并在95。C加热IO分钟，在冰上冷却。然后在8%SDS-PAGE凝胶中分离所述样品。随后根据生产商的说明用考马斯亮蓝(CoomassieBlue)染所述凝胶。对于蛋白质印迹，如上所述制备样品并在SDS-PAGE上分离样品，然后在100V下转膜1小时，将样品转移到ImmunoBlotPVDF膜(Bio-Rad)上。将所述膜在溶于PBS/0.1%吐温-20中的5%脱脂奶粉中封闭1小时，用0.2吗/ml山羊抗人的FcryRIIa抗体(R&DSystems)孵育1小时，并用HRP-偶联的兔抗山羊IgG(来自Sigma的完整分子)孵育1小时，然后用TMB底物(VectorLaboratoriesInc)显色。另一个有限稀释在含有600pg/ml潮霉素B的培养基中以较低的不同浓度(0.25和0.5细胞/孔)进行。2至3周后，抗药的克隆再次通过ELISA进行重组蛋白产量的评价，并且通过蛋白质印迹进行检验。蛋^的遂化39CHO转染物在37°C下生长于振荡烧瓶中。当细胞达到1.5xl06至2xl()G个细胞/ml的浓度时，在不断的搅拌下将它们在30。C孵育7至10天。收集上清，在4°C以3000xg离心30分钟，通过一系列不同的高压灭菌的膜过滤器孔径(5.0至0.2iim)过滤。采用BioMaxlO膜的正切流动过滤(Millipore)用于浓缩上清，并在pH为7.8的20mMNa-P/148mMNaCl中进行缓冲液交换。然后将所述物质用结合緩冲液(20mMNa-P&3MNaCl,pH7.8)稀释9倍，以4ml/min加载到蛋白A柱(ProteinAcolumn,GEHeathcare)上，4°C过夜。所述柱用结合緩沖液(20体积，5ml/min)洗涤，且用0.1MpH为4.0的柠檬酸以2ml/min洗脱蛋白质。将洗脱的物质的pH调节至中性，在4LpH为6.0的10mM的Na-P中于4°C透析过夜。然后将其加载到大量制备(macro-prep)的40iim陶瓷羟磷灰石II型(CHTII)柱(Bio-Rad)上。用结合緩冲液洗涤柱后，将所述蛋白用pH为6.0的10mMNa-P、500mMNaCl洗脱(所有操作均在5ml/min的流速下)。然后在4°C下将洗脱的物质在3X4LpH为7.4的PBS中透析。蛋白浓度通过280nM(1.34消光系数(extinctioncoefficient)))处的吸光度确定。图22A显示了最终纯化的物质的SDS-PAGE分析。蛋白质印迹分析示于图22B中。蛋^胆银龙瘦复合務漆发的MC/9應义勿應活^在MC/9肥大细胞测定中，检测了D2蛋白阻断免疫复合物介导的Fcry受体活化的能力。MC/9是FcryR-阳性的鼠肥大细胞系，其暴露于免疫复合物后会活化且释放TNF-a。10pg卵白蛋白-抗卵白蛋白免疫复合物(OVAICs)在室温下用纯化的D2孵育1小时。OVAICs也用纯化的BIF(如实施例1和实施例2中所述的缺少Fc标签的D2的变体)和纯化的M2蛋白(仅包含融合于修饰的IgG2aFc结构域的单F(ryRIIa亚基的D2的变体)孵育。然后将所述混合物加入到包含2xl()S个MC/9细胞的96-孔板中，在37。C孵育过夜。收集上清，用商业ELISA试剂盒测量TNF-a量。结果示于图23中，其中将无处理时释放的TNF-a量定义为100%。所述D2和M2蛋白及rsFcryRIIa二聚体多肽完全抑制了OVAIC介导的活化。然而所述D2蛋白比非-Fc标记的(non-Fctagged)二聚体强3倍，比Fc-标记的单体(M2)强12倍。蛋冷^嗜哞^在勿/敏法化溯/;t^逸錄A^复合錄介导^Fr^的活化还在嗜中性粒细胞活化测定中，检测了D2蛋白阻断免疫复合物介导的Fc7R受体的活化的能力。静止的人嗜中性粒细胞表达FcryRIIa和FcryRHb，且被免疫复合物活化时，快速失去L-选择素(CD62L)的细胞表面表达。将OVAICs(100pg/ml)单独或者与滴定量的纯化的D2、M2或BIF在水上孵育1小时。然后将所述混合物加入到每孔包含2x105个人嗜中性粒细胞的96-孔^f反中，所述嗜中性粒细胞通过右旋糖酐沉降法和Ficoll密度梯度离心法从外周血液中纯化。所述板在37°C孵育15分钟，通过加入等体积的冰冷的緩冲液终止反应，接着在冰上孵育5分钟。然后通过流式细胞计数法确定嗜中性粒细胞细胞表面的CD62L水平。结果示于图24中，其中在OVAIC单独存在时，表达CD62L的细胞百分数定义为100%活化，表达CD62L的未处理细胞的百分数定义为0%活化。BIF和M2蛋白显示了相似的抑制活性，然而D2蛋白的抑制活性强将近6倍。蛋冷4^V、^活化溯0C哞逸錄^^复合游介^的Fryi的活必此外，还在血小板活化测定中，检测了D2蛋白阻断免疫复合物介导的Fc7R受体的活化的能力。血小板暴露于热聚集的IgG(HAGG)时会通过FcryRHa活化，引起P-选择素(CD62P)的上调，所述HAGG是一种典型的免疫复合物。热聚集的IgG(HAGG)在4'C用不同浓度的D2蛋白(或M2或BIF)孵育1小时。然后将所述混合物加入到包含3x107个人血小板的96-孔板中，所述血小板事先洗涤过且重悬在添加有lmMEDTA的Tyrodes/Hepes緩沖液中。在室温下孵育30分钟后，通过标准4支术将细胞洗涤、固定和染色以4全测CD62P和GPIIb(CD41)的表达，并且在FACS扫描流式细胞仪上进行分析。活化测定的结果示于图25中。HAGG单独处理后，活化的血小板(CD41和CD62P均为阳性)的百分比定义为100%。BIF和M2蛋白显示了相似的抑制活性。然而D2蛋白的抑制活性强将近3倍。讨论D2蛋白包含融合于鼠科IgG2aFc结构域的两个首对尾的FcryRIIa蛋白的细胞外结构域，其有四个氨基酸突变以降低Fc受体结合和补体结合。所述D2蛋白有效地阻断了免疫复合物介导的MC/9肥大细胞的活化，且在嗜中性粒细胞活化测定及血小板活化测定中阻断了免疫复合物介导的FqR的活化。因此这种Fc结合二聚体融合蛋白可以成为体内免疫复合物介导的疾病的有效抑制剂。实施例5异源二聚Fc受体多肽的设计和表达材料和方法Fryi//a-Fc7i///岸源二菜衷这裁脊的一々建Fc7RIIa和Fc7RIH的Fc结合区可以各自采用如实施例1中所述的合适的引物从cDNA模板中进行PCR扩增。扩增的区域包括Fc结合区的已知特性的残基和基序(motifs)例如外结构域1和外结构域2连接子残基(也就是Dl/D2连接)以及BC、C，E和FG环。作为这些Fc结合区的多聚核苷酸序列是本领域技术人员所熟知的。可以用T4DNA连接酶将平端PCR产物在用DNA聚合酶I的片段补平的五coRI位点处，连接到载体pPIC9(Invitrogen,LifeTechnologies)中。可以使用与实施例1中所述的方法相似的PCR和克隆技术，从这些扩增产物中产生可操作的融合的Fc7RHa-FcyRIII异源二聚多核苷酸。可以通过分析性限制酶消化或DNA测序证实插入物的大小和取向。可操作地融合的Fc7RIIa-Fc7Rin异源二聚多核苷酸可以克隆到各种表达载体中。例如，FtryRIIa-FcryRni异源二聚多核苷酸可以连接到修饰的pBACPAK9(InvitrogenLifeTech)的￡coRIZ%aI位点中，其中通过用5a附HI消化首先消除多克隆位点中的5amffl位点，使用DNA聚合酶尺/e朋w片4爻补平，而后再连接。可以通过五coRIZW"I消化来确定插入物的大小，多聚的SamHI片段的正确取向可以采用标准方法通过消化来筛选。可选4奪地，所述Fc7Rna-Fc7Rm异源二聚多肽可以克隆到哺乳动物表达载体中。例如，GatewayLR克隆酶反应(Invitrogen，LifeTechnologies)可以用于将可操作地融合的多聚Fc受体多核芬酸片段转移到GatewayTM阅读框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)适合的表达载体pAPEX3P(Evans等，1995及Christiansen等，1996)中，以提供表达融合的Fc受体多聚体的哺乳动物表达载体。同样地，所述GatewayLR克隆酶反应可以用于将可操作地融合的多聚Fc受体多核苷酸片段转移到GatewayTM阅读框架-A盒(Invitrogen,LifeTechnologies)适合的表达载体pIRESneo(Clontech)中。讨论Fc结合区的多聚化产生了与Fc结构域具有较高亲和力的相互作用的分子。多聚体中的每一单体能够单独地与免疫球蛋白的Fc结构域相互作用以产生较高亲和力。可以产生包含衍生自不同Fc受体的Fc结合区域的多聚体。例如，多聚体可以从Fc7RI、Fc7RIIa、FcryRIIb、Fc7RIIIa、FcryRIIIb、FcoRI和F"RI的Fc结合区域的组合中形成。异源二聚体也可以从这些Fc结合区域的组合中形成。例如，可以形成Fc7RIIa-FcryRni、Fc7RIIa-Fc7RI和Fc7RI-Fc7Rin异源二聚体，及由Fc结合区的其它组合组成的异源二聚体。众多Fc受体的Fc结合域通过诱变或结晶学已经确定(IgG和Fc7R:Maxwell等，1999;Radaev等,2001;Sondermann等,2000;Hulett等，1988;Hulett等，1991;Hulett等，1994;Hulett等，1995;IgE和FceRI:Garman等，2000;IgAandFccxRIinteractions(IgA和FcoRI相互作用):Wines等，2001;Herr等，2003)。此外，也进行了相似FcR序列的比较和Fc受体结构的比较分析(Sondermann等，2001)。这些分析表明相关的、清楚限定的不同Fc受体的片段能与它们的配体相互作用。而且，与Fc7RIH和IgG的结晶学分析相比较(RadaevWa/.2001,Sonderman&a/.2001)，对国际专利第WO2006/133486号说明书中F(ryRIIa与IgG相互作用的结晶学分析清楚地证实了这一点。显然，这些数据连同其它Fc受体的诱变实验表明来自这些相关FC受体的外结构域1和外结构域2之间的连接区域的片段，以及来自不同受体第二结构域的BC、C，E和FG环的片段与它们各自的配体相互作用。将这些Fc结合区并入其它多肽能够赋予新多肽对那种免疫球蛋白类型的特异性。为了这一目的，Hulett等，1991，Hulett等，1995和Maxwell等，1999表明将IgG结合区添加到否则不能与IgG结合的蛋白中使蛋白获得了对IgG的特异性。相似地，还观察到一系列IgE结合序列插入到不能与IgE结合的蛋白中产生了具有IgE特异性的蛋白嵌合体，如先前在国际专利说明书第WO96/08512中所述。因此可以预测以相似的方式，^!争能与来自于FcryRI或Fc7RIH的IgG相互作用的Fc结合区包括在多肽或蛋白中可以赋予该多肽或蛋白质结合IgG的功能，或类似地，将能与来自于CD89或FccxRI的IgA相互作用的Fc结合区包括在多肽或蛋白中可以U武予该多肽或蛋白结合IgA的功能。这种序列可以包括已知能与IgA相互作用的CD89的FcoRI的第一细胞外结构域的环，这样的环可以包括结构域1的BC、C，E和FG环。重要的残基包括氨基酸35、52和81-86(Wines等，2001;Herr等，2003)。这样，包含能与不同种类的免疫球蛋白相互作用的片段的受体多肽和蛋白质是可能的。本说明书中术语"包含(comprise)"，或其变体诸如"包含(comprises)"或"包含(comprising)"，应该被理解为意指包含所述的元素、整体(integer)或步骤，或元素、整体或步骤的组，但是并不排除任一其它的元素、整体或步骤，或元素、整体或步骤的组。本说明书提及的所有出版物通过引用并入本文。包括在本说明书中的文件、法令(acts)、材料、装置、文章或类似物的任何讨论完全用于为本发明提供背景的目的。不应将其视为承认这些材料的任一或全部构成现有技术基础的一部分或为本发明相关领域的公众常识，因其在本申请任一权利要求的优先权日之前即已存在于澳大利亚或其它地方。本领域技术人员应该理解，在不偏离广泛描述的本发明的精神或范围的前提下，可以对具体的实施方案中所示的本发明做出许多变化和/或修饰。因此无i仑从哪方面现有的实施方案都应该被看作是说明性的而非限制性的。参考文献1.AmirahmadiSFetal.&RowleyMJ.2005.Arthritogenicanti-typeIIcollagenantibodiesarepathogenicforcartilage-derivedchondrocytesindependentofinflammatorycells(致关节炎性抗II型胶原抗体对于独立于炎症细胞的4欠骨源性软骨细胞是致病的).JW/zn'to52(6):1897-906.2.ArmourKLetal.&ClarkMR.2003.DifferentialbindingtohumanFcgammaRIIaandFcgammaRIIbreceptorsbyhumanIgGwildtypeandmutantantibodies(人类IgG野生型和突变抗体与人类Fc7RIIa和FcryRIIb受体的差异结合).Afo//m附w"o/.40(9):585-93.3.ArmourKLetal.&ClarkMR.2002.ThecontrastingIgG-bindinginteractionsofhumanandherpessimplexvirusFcreceptors(人类和单纯疱渗病毒Fc受体的对比IgG结合相互作用).Soc7V朋s.30(4):495-500.4.AstierAetal.&DHanau.1994.HumanepidermalLangerhanscellssecreteasolublereceptorforIgG(FcgammaRII/CD32)thatinhibitsthebindingofimmunecomplexestoFC7R+cells(人类表皮朗才各汉,斤细月包细胞分泌抑制免疫复合物与FcgammaR+纟田胞结合的IgG(Fc7RII/CD32)的可溶性受体).//m附w"o/.152(1):201.5.BrooksDetal.&RavetchJ.1989.StructureandexpressionofhumanIgGFcRII(CD32).Functionalheterogeneityisencodedbythealternativelysplicedpr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