专利名称：：川楝皮提取物及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的川楝皮提取物及其提取方法和用途。背景介绍川楝皮系楝科楝属植物，分布广泛，具有驱虫、疗癣作用。现代药理研究表明，川楝皮除具有驱虫作用外，还具有抗肿瘤作用、抑菌抗病毒作用、抗肉毒作用，影响循环、呼吸及神经系统。国内外有关楝科植物化学成分的研究工作表明其含有三砲、香豆精、多糖类、黄酮、色素及油脂等多种化学成分，其中楝烷型四环三砲类化合物具有驱虫、抗肿瘤、抗疟、镇痛、抗炎、催眠、抗焦虑等多方面作用。
发明内容本发明提供了新的川楝皮提取物。本发明还提供了新的川楝皮提取物的混合物。本发明还提供了包含新的川楝皮提取物的药物组合物。本发明还提供了包含新的川楝皮提取物的混合物的药物组合物。本发明还提供了新的川楝皮提取物在抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了新的川楝皮提取物的混合物在抗肿瘤药物中的应用。本发明所指的新的川楝皮提取物，具有式I的结构通式I其特征是化合物S1:R产OCOCH(CH3)CH2CH3，R2=R5=H,R3=OAc，R4=0H;或者化合物S2:R尸OCOCH(CH3)CH2CH3，R2=OAc，RfR4-H,R5=OH;或者化合物S3:R尸OCOCH(CH3)2，R2=R5=H，R3=OAc，R4K)H。本发明的新的川楝皮化合物的分离过程如下-川楝皮粉碎呈块状，95%乙醇浸渍过夜，加热回流提取3次(3.0h，1.5h，1.5h)，提取液减压回收乙醇，得乙醇提取物。该提取物加水分散后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部分。将乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析分离，用石油醚:乙酸乙酯系统(1:0，3:1，1:1,0:1，V:V)梯度洗脱，按薄层含相同斑点合并，得粗分组分A。粗分组分A反复经过硅胶柱层析、S印hadexLH-20凝胶柱、反相柱层析以及HPLC分离、纯化，得到以上三个新化合物。相关的鉴定数据如表l、表2和表3:表1化合物S1NMR数据(CD3OD,JinHz)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2化合物S2NMR数据(CD30D，JinHz)NOl3C-NMR(7SMHz)'H-醒R(300MHz)HMBC(C)Roesy174.6,CH4.06,d(4.6)2,3，5，102,9,19a267.7，CH4.49,t(4.8)31,3,19b76.4,CH5.48,d(4.4)1,2,4,5,1'2,19^28441.7,qC29.1，CH2.72,m6b,286a24.2,CH22.17,m6b,306b1.73,m5,6a,28770.0,CH4.01,dd(1.6,3.2)6a'6b,14,30846.6,qC952.2,CH3.59,s1,8,10,11,14,19,30l，5,12b,14，181043.6'qC11213.6,qC12a51.7,CH22.60，d(16.3)11,13,14,1712b，3012b2.38，d(16.3)11,13,17181345.2,qC1461.8，CH3.34，s7,8,151815220.2,qC16a44.7,CH22.69，m1816b2.49,m1742.5,CH3.27，s12a，16b，301828.1，CH31.00's12,13,14,1719a65.8,CH24.55,d(13.勺1l，19b19b4.29，d(12.7)16a,19a,29，3020123.7,qC21141.9，CH7.45,s20,22,23I6a,1722U1.7，CH6.43，dd(0.8,1.7)20,21,2316a，17,18,2323144.4,CH7.48,1(1.6)20,21222818.8,CH30.80,s3,4,5,292995.3.CH5.75,s3,4,1"19b,28,2'3020.2,CH31.07,s7,8,9,14-0￡OCH3(l')172.9,qC21.0,CH32.11，sr-0￡OCH(CH3)CH2CH3(1")176.6，qC-OCO￡H(CH3)CH2CH3(2")42.4,CH2.45,mr-OCOCHH2CH3(5")16.9，CH31.17，d(7.0)r,2",3"-OCOCH(CH,)C%CHi(3''a)27.7，CH21.69,m-OCOCH(CH3)￡HaCH3(3"b)1.53,mr,2"-OCOCH(CH,)CH，CH，(4")11.8，CH30.94,t(7.4)2",3"表3化合物S3NMR数据(CD30D,JinHz)NO"C-NMR(125MHz)'H-隨R(500MHz)HMBC(C)Roesy174.4,CH4.19,dd(1.4,3.8)28272.3，CH5.70，t(3.8)1,3，19a,19b,2974.3，CH4.05，d(1.5)28442.7,qC27.9,CH2.79,dd(3.1,15.4)6b,9'286a24.3,CH22.15,m6b,306b1.74，dt(14.3,3.2)2870.0,CH4.04,m6a,6b，30846.4，qC952.2,CH3.61,s8,11,19,305'12b,141044.2,qC11213.6,qC12a51.8,CH22.61，d(16.4)11,14,1712b，1712b2.32,d(16.3)11,13,189'12a，181345.1，qC1461.8,CH3.34，s8,15,17,18,309,1815220.1,qC16a44.7,CH22.69，ddd(1.6，12.1,18.9)1516b16b2.49,dd(l8.9,8.2)13,14,15171742.6，CH3.29,t(4.0)18,21,3012a,16b,301828.1，CH30.99，s12,13,14,1619a65.3，CH24.48,dd(12.9,l.l)3,5,293019b4.32,d(12.9)13020123.7,qC21141.9,CH7.43，d(0.7)20,22,2316a22111.7'CH6.42，dd(1.0,0.8)20,21,2316a23144.4，CH7.47，t(1.6)20,21222819.5,CH30.96,s3,4,5,29292995.6,CH5.78,s3,1'2,6a,19a,19b,2'3020.2,CH31.08,s7,8,9,14-0￡OCH3(l')172.2，qC-OCOCH!(2')21.0,CH32.12,sr-0￡OCH(CH3)2(r)177.2,qC-OCO￡H(CH3)2(2")35.4,CH2.59,ml",3"，4"3"-OCOCH(CH2、2(3".4")19.1,CH31.18,d(l.l);1.16，d(1.1)l"，2"本发明的新的川楝皮化合物在分离的过程中可形成多组分的混合物，包括上述提及的三个新化合物。本发明的新的川楝皮化合物或其混合物可与药学上可接受的载体形成组合物。根据本领域内技术人员熟知的细胞毒活性化合物的常规筛选方法，通过体外多种肿瘤细胞株的筛选研究，研究人员发现，式I化合物具有一定的抗肿瘤活性，可作为抗肿瘤药物的候选药。具体实施方式以下通过实施例对本发明做进一步的说明。本发明中没有具体描述的提取、分离方法均为本领域普通技术人员熟知的方法，本领域普通技术人员可以根据说明书的提示采用药典规定的方法或者其他操作规程限定的方法结合所使用仪器的说明书进行操作，即可实现本发明。实施例1粗分组分的制备川楝皮30kg，粉碎呈块状，95%乙醇浸渍过夜，加热回流提取3次G.0h，1.5h，1.5h)，提取液减压回收乙醇，得乙醇提取物。该提取物加水分散后分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯部分，分别减压回收溶剂，得乙酸乙酯部分250g。将乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析分离，用石油醚:乙酸乙酯系统(1:0，3:1，1:1,0:1，V:V)梯度洗脱，按薄层含相同斑点合并，得粗分组分A(29.2g)。实施例2化合物Sl、S2、S3的分离将组分A(29.2g)，依次经硅胶柱层析(氯仿:甲醇(8:1、1:1、0:1)梯度〕、SephadexLH-20凝胶柱层析(氯仿:甲醇(l:l))、硅胶柱层析〔氯仿:甲醇(20:1、10:1))、ODS反相柱层析〔75%甲醇)、SephadexLH-20凝胶柱层析(甲醇)、硅胶柱层析〔氯仿:甲醇(卯:l、70:1))、HPLC(32。/。-36。/。乙腈梯度)分离纯化，分别得到化合物Sl(tR=83分钟)、S2(tR=66分钟)、S3(t^55分钟)。实施例3活性实验筛选的细胞株有人结肠癌细胞株(HT-29)测定按常规采用SRB法。材料细胞株人结肠癌细胞株(HT-29)以上细胞株用相应培养基，于37'C，5%0)2的培养箱中培养。2.药物化合物S1、S2、S3以及VP163.试剂3.1RPMI1640培养基(RPMI1640+10。/。小牛血清+HEPES3.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/D。3.2高糖DMEM培养基(DMEM+10%小牛血清+}^￡83.5g/l+NaHC032.2g/l+青霉素0.13g/l+链霉素0.15g/l)。3.3胰酶、DMSO4.设备4.1C02培养箱、无菌操作台、酶标仪、离心机等。4.2移液枪、移液管、离心管、96孔板等。二.方法-2.1操作步骤2丄1接种取处于指数生长期，状态良好的细胞一瓶，加入适量胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，用含10%小牛血清的RPMI1640(或DMEM)培养液配成细胞悬液，计数，并将细胞密度调整稀释至一定浓度.取细胞悬液接种于96孔板上，180ul/孔。2丄2培养将培养板转入恒温C02培养箱中，在37°C，5%(202及饱和湿度条件下培养24小时。2丄3初筛加药受试化合物先用DMSO配制成0.1M浓度，再作5个稀释度，用于筛选(浓度见结果)。加入受试化合物，20ul/孔，培养72小时。每组设3个平行孔，并重复3次。2丄4染色将96孔板各孔接种细胞加TCA固定1h，水洗5遍干燥，加SRB染色15min，醋酸洗涤5遍干燥，Tris溶解。2丄5测定酶标仪设定波长为490nm,测定96孔板每孔吸光值，记录结果并计算细胞抑制率，以判断受试药物的抗肿瘤活性。2.2注意事项2.2.1细胞悬液需充分混匀，以避免各孔之间细胞分布不均，加细胞的过程应控制在4小时以内，避免细胞活性受损。2.2.2各板需单独设定空白对照及阴性对照。2.3.1细胞抑制率的计算对照组平均OD值-给药组平均OD值抑制率=-xl00%对照组平均OD值2.3.2ICso的计算根据Logit方法计算所得。活性筛选结果(IC5o,uM):化合物_人结肠癌(HT-29)5118.75214.35316.8VP1621,910权利要求1、从川楝皮中提取分离的化合物，具有式I结构其特征是化合物S1R1＝OCOCH(CH3)CH2CH3，R2＝R5＝H，R3＝OAc，R4＝OH；或者化合物S2R1＝OCOCH(CH3)CH2CH3，R2＝OAc，R3＝R4＝H，R5＝OH；或者化合物S3R1＝OCOCH(CH3)2，R2＝R5＝H，R3＝OAc，R4＝OH。2、一种从川楝皮中提取的混合物，其特征在于包含权利要求1所述的化合物。3、一种药物组合物，其特征在于包括权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体c4、一种药物组合物，其特征在于包括权利要求2所述的混合物和药学上可接受的载体c5、权利要求1的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。6、权利要求2的混合物在制备抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明提供了具有式I结构的新的川楝皮化合物及其混合物，或与药学上可接受的载体构成的组合物，以及它们在抗肿瘤药物中的应用。文档编号C07J71/00GK101328202SQ20081002314公开日2008年12月24日申请日期2008年7月29日优先权日2008年7月29日发明者周春燕,唐海英,桑已曙申请人:江苏先声药物研究有限公司