专利名称：一种毛发干裂解液的制作方法
技术领域：
本发明涉及生化试剂，尤其涉及一种毛发裂解液。
背景技术：
在犯罪现场证物收集过程中，毛发是最为常见的犯罪现场证物之一。此外， 因毛发干具有特殊的分子机构而使其具有不易腐烂特点，所以比其它现场犯罪 证物如血迹、唾液、指纹、脚印、肌肉等更易被收集到，特别是在犯罪时间比 较久远的现场。目前，法医鉴定过程中是从现场证物中获取犯罪嫌疑人的遗传 信息，通过分子比对来判定犯罪嫌疑人的是否参与作案。在以毛发干作为样品 抽提遗传信息的过程中，工作者常常发现，毛发干不易被消化。目前最快的消
化方法仍需要3个小时甚至更长，这种不易消溶的特性不仅限制了其在法医鉴定 过程中成为非首选检测证物，而且严重影响了其尽管作为最易获得且对人伤害 度最低的临床标本却常常不被选取的困境。因而，在不破坏毛发遗传分子的结 构的前提下，提高人体毛发消化效率，縮短毛发的溶解时间是解决上述困境的 有效途径。
发明内容
本发明的目的在于解决现有毛发消化时间长效率低的问题，提供一种在不 破坏毛发干遗传分子的结构的前提下能快速溶解消化毛发干的裂解液。
本发明的快速消化毛发干的裂解液成份为Tris-Cl (pH8.0) 10 mmol/L、 NaCl 100 mmol/L、CaCl2 lmmol/L、DTT 20~200 mmol/L、SDS质量浓度0.5% 5.0 %、 Triton 乂-100体积浓度0.5%~4°/0、蛋白酶K 0.2~2mg/ml，溶剂为无菌双蒸 水。
毛发干裂解液的配制及使用是常温常压下，按上述配方取Tris-Cl(pH8.0)、 NaCl、 CaCl2、 SDS、 DTT、 Triton X-100溶入无菌双蒸水，充分搅拌制成A液， 4'C保存；使用时在预处理后的样品中先加入A液后，再按0.2~2mg/ml加入相 应量蛋白酶K。溶液的配制遵循现配现用原则。
本发明通过正交实验设计，充分考虑了常用还原剂DTT、去污剂及蛋白质 变性剂SDS、破膜剂Triton X-100与蛋白酶K之间的匹配，开发出一种能快速 高效消化头发干的裂解液。与现有的毛发消化液相比，消化时间大大縮短，消 化效率大大提高，为法医鉴定与临床诊断提供新的途径。
具体实施例方式
实施例l将pH为8.0的Tris-Cl、 NaCl、 CaCl2、 SDS、 DTT、 Triton X-100按表1浓 度溶于无菌双蒸水，4'C保存备用；使用时，再按表1浓度加入相应量蛋白酶K，
制备成本发明的毛发干裂解液。
表1本发明发干裂解液各组分含量及消化耗时
组分浓度单位C2c3c4
Tris-Cl (pH8.0)mmol/L10101010
NaClmmol/L100100100100
CaCl2mmol/L1111
DTTmmol/L208080200
SDS质量分数0.5225
Triton X-画体积分数0.5224
蛋白酶Kmg /ml0.20.20.51
消化时间min100±2080±1550±1060±15
取长40cm的新鲜头发干，先用洗涤精充分洗涤，除尽头发上的杂质，用无 菌蒸馏水多次漂洗，随后用无菌的2W的NaOH洗涤15分钟，接着用无菌的2% 的HC1洗涤15分钟，之后用无菌蒸馏水多次漂洗后依次用75%、 100%的乙醇 洗涤一次，晾干后备用。
在无菌条件下剪成长约0.5-3mm的片段，并置于4个编号为C广C4且体积 均为2ml的无菌EP管中，每个EP管中头发干长度均为10cm。
在C广C4EP管中按表1分别加入温度为56。C的消化液40(HU，充分混匀， 56'C水浴直至EP管内看不到明显的毛发碎片，期间每15分钟轻轻颠倒EP管数 次，观察并记录消化用时。4种配比的消化耗时见表1。
对比例
根据现有技术中文献公开的组织消化液种类及配方，配制如表2所示的消 化液，与本发明的消化液作毛发干消化对比试验。其中D,号消化液参照高林林 等的配方(参见文献高林林等.染色毛干mtDNA不同提取方法的研究.中国法 医学杂志，2006， 21 (5): 284-286)， D2号消化液参照S. Amory等配方(参见 文献S. Amory, C.Keyser， E. Crube'zy，B. Ludes.STR typing of ancient DNA extracted from hair shafts of Siberian mummies.Forensic Science International,2007,166: 218-229); D3号消化液参照Hellmann等配方(参见文献 A. Hellmann,U. Rohleder,H. Schmitter，M. Wittig,STR typing of human telogen hairs-a new approach.Int J Legal Med， 2001,114 :269—273); D4号消化液参照M.
4Thomas P. Gilbert等配方(参见文献M. Thomas P. Gilbert, Lynn R Tomsho， Snjezana Rendulic, Michael Packard,et al.Whole國Genome Shotgun Sequencing of Mitochondria from Ancient Hair Shafts. Science, 2007,317:1927); C 3号消化液是本 发明实施例1中第3种配方。
取长约50cm的新鲜头发干，先用洗涤精充分洗涤，除尽头发上的杂质，用 无菌蒸馏水多次漂洗，随后用无菌的2Q/。的NaOH洗涤15分钟，接着用无菌的
2。/。的HC1洗涤15分钟，之后用无菌蒸馏水多次漂洗后依次用75%、 100%的乙 醇洗涤一次，晾干后备用。
在无菌条件下剪成长约0.5-3mm的片段，分别置于5个编号为Dp D2、 D
3、 D4、 Cs的无菌EP管中。
在D广D4号EP管中依次加入如表2中所示的D广D4号消化液400^1，充 分混匀，56'C水浴，期间每15分钟轻轻颠倒EP管数次，直至EP管内看不到明 显的毛发碎片，观察并记录消化用时。消化耗时结果见表2。从消化用时来看， 本发明的消化时间比其它配方大大縮短。
表2现有的4种消化液配方成分及消化时间与本发明的比较
消化液组分浓度单位D2D3D4c3
Tris-Cl (pH8.0)mmol/L—10101010
NaClmmol/L—100_10100
CaCl2mmol/L—1—1
DTTmmol/L4039654080
CH3COONammol/L—一300一一
SDS%一2222
EDTAmmol/L一—52.5—
Triton X-100%——_一2
N-phenacylthiazolium bromidemmol/L一—1——
(PTB)
蛋白酶Kmg/mL0.20.2511000.5
无菌蒸馏水溶剂溶剂溶剂溶剂溶剂
消化时间min2240218021502180240
注符号"一"代表不含有该种物质。
权利要求
1. 一种毛发干裂解液，成份及配比为Tris-Cl(pH8.0)10mmol/L、NaCl 100mmol/L、CaCl2 1mmol/L、DTT 20～200mmol/L、SDS质量浓度0.5％～5.0％、Triton X-100体积浓度0.5％～4％，蛋白酶K0.2～2mg/ml，溶剂为无菌双蒸水。
2. 如权利要求1所述的毛发干裂解液，其特征在于DTT浓度为80mmol/L、 SDS质量浓度为2 %、 Triton X-100体积浓度为2%、蛋白酶K浓度为5mg /ml。
全文摘要
本发明公开了一种毛发干裂解液，成份及配比为Tris-Cl(pH8.0)10mmol/L、NaCl 100mmol/L、CaCl<sub>2</sub> 1mmol/L、DTT 20～200mmol/L、SDS质量浓度0.5％～5.0％、Triton X-100体积浓度0.5％～4％，蛋白酶K 0.2～2mg/ml，溶剂为无菌双蒸水。与现有的毛发消化液相比，消化时间大大缩短，消化效率大大提高，为法医鉴定与临床诊断提供新的途径。
文档编号C07H21/00GK101508716SQ20091004293
公开日2009年8月19日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者曾乐平, 慧 王, 童建斌, 罗学港, 旦 陈, 黄菊芳 申请人:中南大学