专利名称：一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法
技术领域：
本发明涉及天然药物化学和生物细胞学，具体说就是一种从王不 留行中分离制备具有增乳活性单体的方法。
(二)
背景技术：
我国中草药资源丰富，中药用于增奶，具有毒副作用小、价格低、 无抗药性、无残留等独特优势。将中草药作为增奶剂和饲料添加剂的 研究最早源于我国，目前已经有许多增奶方剂用于饲料添加剂来提高 奶牛产乳量，同时一些增乳的天然中药及其制剂在临床上也己广泛应
用。Dugoua等(2006， 2009)系统阐述了增乳中药的药理学性质， 对增乳中药在妊娠和泌乳临床应用中的正确性和安全性进行了评价。 王不留行(&mewK"cc"Wae)为石竹科植物麦蓝菜的种子，为传
统常用中药。王不留行作为重要的增乳中药，其所含成分种类多，成 分复杂。天然药物有效性的物质基础在于它的有效成分。因此若想探 明王不留行的增乳机理就需要寻找到其中具有增乳活性的单体成分， 才能通过含量测定的方法控制天然药物及其制剂的质量，从而更好的 研究其药效动力学及药代动力学，对王不留行增乳活性成分的开发利 用具有重要的理论和实际价值。从中药复方的药味筛选到成分筛选是 中药药效研究的主流。利用细胞培养技术筛选中药药效成分是十分快 捷有效的方法。随着天然药物化学技术的研究进展，邻苯二甲酸二丁 酯从一些天然活性物质中分离获得。韦松等(1997)从苋科牛膝属植 物怀牛膝分离制备鉴定出7种化合物，其中包括邻苯二甲酸二丁酯。 周忠波等(2007)发现红柳中含有邻苯二甲酸二丁酯成分。韩志慧等 (2006)发现山茱萸中含有邻苯二甲酸二丁酯成分。此外具有增乳效 应的漏芦中也含有邻苯二甲酸二丁酯。由于生态环境与陆地生物迥 异，海洋生物中蕴藏着大量结构独特的活性物质，海洋天然产物成为 目前天然药物化学研究中最活跃的领域之一。史大永等(2005)对基 根硬毛藻的化学成分进行分离纯化，鉴定出其中含有邻苯二甲酸二丁 酯。孙奕(2008)从绿藻从石莼中分离得到8个化合物，其中包括邻苯 二甲酸二丁酯。曲新颜等(2004)从海洋来源的放线菌代谢产物分离
3制备出邻苯二甲酸二丁酯，且其具有抗肿瘤活性。邻苯二甲酸二丁酯 是一种环境雌激素，具有雌激素生物样的生物活性。近年的一些研究 表明，对羟基苯甲酸酯体外实验具有弱雌激素活性，能与雌激素受体 (ER)结合。关于邻苯二甲酸二丁酯生物活性的研究报道较少， 一些 体内试验的结果表明邻苯二甲酸二丁酯生物可以对促进子宫增重具
有一定作用(杨波等，2002)。邻苯二甲酸二丁酯可促进雌激素依赖 性乳腺癌MCF-7细胞的增殖，可能具有拟雌激素作用(靳秋梅等， 2005)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备方法简便、纯度高、成本低的从 王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法。
本发明的目的是这样实现的从王不留行中分离制备具有增乳活 性单体的方法步骤如下
步骤一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用体积分数 70%的乙醇加热回流提取3次，每次2h，减压回收溶剂，稀释母液， 依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取部位。
步骤二王不留行提取物活性部位的筛选对乙酸乙酯部位进行
聚酰胺柱层析，干法上样，分别用水，10%， 30%， 50%， 70%, 95% 乙醇系统进行梯度洗脱，收集不同梯度洗脱液，旋转蒸发后获得不同 洗脱部位的中药成分，通过其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型细胞活 力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影响确立50%的乙醇洗脱部位为王不留 行增乳活性部位。
步骤三王不留行增乳单体的制备对50%的有效部位进行进一 步的分离纯化，对聚酰胺柱层析分离获得的50%乙醇洗脱部位进行硅 胶薄层层析，根据硅胶G板的薄层结果的Rf值情况选择摸索不同的 溶剂系统，最终确立石油醚-乙酸乙酯系统为有效分离系统，采用石 油醚-乙酸乙酯系统对50%乙醇洗脱部位进行硅胶柱层析，对分离的
化合物进行筛选，其中石油醚乙酸乙酯20: l的洗脱流分中含有- -
个具有增乳活性的单体成分；对该增乳单体化合物的制备采用分析型 和制备型HPLC法进行，采用10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的甲醇对单体化合物的粗品进行紫外全波长扫描进行检识，确立此化合物的紫外吸收波长为275nm，采用半制备 型HPLC对化合物连续进样以纯化并制备出高纯度的目的化合物。
步骤四增乳单体的结构鉴定采用紫外光谱、核磁共振氢谱、
核磁共振碳谱、高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)对目的化合物进行 结构鉴定，以确定目的化合物的分子量、分子式及其具体结构形式， 鉴定结果确定目的化合物为邻苯二甲酸二丁酯；制备出的邻苯二甲酸 二丁酯可以促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳糖和(3-酪蛋白的分 泌水平；且邻苯二甲酸二丁酯制备的中药单体注射液的动物试验结果 表明其可以促进小鼠和奶牛产奶量的提高。
本发明一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法，在 提取过程中采用的乙醇等有机溶剂的成本低廉、无毒、可以回收。采 用的聚酰胺柱层析和硅胶柱层析可以扩大规模化生产，从而可以获得 大量的增乳成分。同时可以通过制备型HPLC获得单体成分，其制备 方法简便且纯度高。对王不留行增乳成分一一邻苯甲酸二丁酯的确定 可以为增乳新药的开发提供重要思路。对于王不留行中药资源的开发 具有一定的意义，也必然会带来一定的经济效益。
(四)
图1为本发明的分离前样品色谱图2为本发明的增乳活性成分的硅胶薄层层析图3为本发明的增乳活性单体分离前；
图4为本发明的增乳活性单体分离后；
图5为本发明的增乳单体的结构图。
具体实施方式
下面结合附图举例对本发明作进一步说明。
实施例1，结合图l一图5，本发明一种从王不留行中分离制备 具有增乳活性单体的方法，方法步骤如下
步骤一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用体积分数 70%的乙醇加热回流提取3次，每次2h，减压回收溶剂，稀释母液， 依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取部位；
步骤二王不留行提取物活性部位的筛选对乙酸乙酯部位进行 聚酰胺柱层析，干法上样，分别用水，10%， 30%, 50%， 70%， 95%获得不同 洗脱部位的中药成分，通过其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型细胞活 力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影响确立50%的乙醇洗脱部位为王不留
行增乳活性部位；
步骤三王不留行增乳单体的制备对50%的有效部位进行进一 步的分离纯化，对聚酰胺柱层析分离获得的50%乙醇洗脱部位进行硅
胶薄层层析，根据硅胶G板的薄层结果的Rf值情况选择摸索不同的
溶剂系统，最终确立石油醚-乙酸乙酯系统为有效分离系统，采用石
油醚-乙酸乙酯系统对50%乙醇洗脱部位进行硅胶柱层析，对分离的
化合物进行筛选，其中石油醚乙酸乙酯20: l的洗脱流分中含有^ 个具有增乳活性的单体成分；对该增乳单体化合物的制备釆用分析型 和制备型HPLC法进行，采用10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的甲醇对单体化合物的粗品进行紫外全波长 扫描进行检识，确立此化合物的紫外吸收波长为275nm，采用半制备 型HPLC对化合物连续进样以纯化并制备出高纯度的目的化合物；
步骤四增乳单体的结构鉴定采用紫外光谱、核磁共振氢谱、 核磁共振碳谱、高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)对目的化合物进行 结构鉴定，以确定目的化合物的分子量、分子式及其具体结构形式， 鉴定结果确定目的化合物为邻苯二甲酸二丁酯；制备出的邻苯二甲酸 二丁酯可以促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳糖和(3-酪蛋白的分 泌水平；且邻苯二甲酸二丁酯制备的中药单体注射液的动物试验结果 表明其可以促进小鼠和奶牛产奶量的提高。
实施例2:结合图l-图5，本发明一种从王不留行中分离制备具
有增乳活性单体的方法，实验方法如下 实验试剂
化学分析纯的乙醚、乙酸乙酯、石油醚、乙醇；色谱级甲醇；层 析用聚酰胺(80 100目)；层析用硅胶(200~300目)。 实验设备
R-205型旋转蒸发仪，上海申胜；ZHJH-1112垂直流超净工作台， 上海智城分析仪器制造有限公司；CO-150型C02培养箱，日本；SZ-93 自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂；LC-10AT高效液相色
6谱仪，日本岛津，SPD-10A紫外检测器；2695-2996型HPLC色谱仪， 美国Waters; Delta-600-2487制备型HPLC色谱仪，美国Waters; Bmker-400型超导核磁共振光谱仪；SHIMADZU UV-1601型紫外光 谱仪；IonSpec Ultima 7.0T FTICR高分辨电喷雾质谱仪(HR-ESI-MS); Hypersil-ODSlI(5(im 10x250mm)半制备型色谱柱，大连依利特公司； Hypersil ODSII(5pm 4.6x200 mm)分析型色谱柱，大连依利特公司。 实验方法
(1) 王不留行粗提取
取王不留行粗粉10kg，用体积分数70%的乙醇加热回流提取3 次，每次2h，减压回收溶剂。稀释母液，依次以乙醚、乙酸乙酯萃 取。获得乙酸乙酯萃取部位。
(2) 王不留行提取物活性部位的筛选
对乙酸乙酯部位进行聚酰胺柱层析，干法上样，分别用水，10%， 30%， 50%, 70%， 95%乙醇系统进行梯度洗脱。收集不同梯度洗脱 液，旋转蒸发后获得不同洗脱部位的中药成分。通过其对奶牛乳腺上 皮细胞泌乳模型细胞活力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影响确立50% 的乙醇洗脱部位为王不留行增乳活性部位。
(3) 王不留行增乳单体的制备
对50%的有效部位进行进一步的分离纯化。对聚酰胺柱层析分离 获得的50%乙醇洗脱部位进行硅胶薄层层析，根据硅胶G板的薄层 结果的Rf值情况选择摸索不同的溶剂系统，最终确立石油醚-乙酸乙 酯系统为有效分离系统。采用石油醚-乙酸乙酯系统对50%乙醇洗脱 部位进行硅胶柱层析。对分离的化合物进行筛选，其中从石油醚乙 酸乙酯(20: 1)部位分离的一个化合物具有增乳活性。
增乳单体化合物的制备采用分析型和制备型的HPLC法进行。采 用10%、 20%、 30%、 40。/o、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 100%的 甲醇对单体化合物的粗品进行紫外全波长扫描进行检识。以确立此化 合物的紫外吸收波长为275nm。采用半制备型HPLC对化合物连续进 样以纯化并制备出高纯度的目的化合物。
(4) 增乳单体的结构鉴定
采用紫外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分 电喷雾质谱(HR-ESI-MS)对该化合物进行结构鉴定。以确定该化合物的分子
量、分子式及其具体结构形式。制备出的邻苯二甲酸二丁酯可以促进 体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳糖和p-酪蛋白的分泌水平。且邻苯二 甲酸二丁酯制备的中药单体注射液的动物试验结果表明其可以促进 小鼠和奶牛产奶量的提高。
实验结果
(1) 王不留行增乳活性单体的分离制备
采用分析型和制备型的HPLC法对薄层层析的目的点进行分析 及分离制备，其中图1为分离前样品色谱图，分析型HPLC的紫外全 波长扫描结果表明该化合物在275nm下具有最大吸收，HPLC分析结 果表明有杂质峰，其纯度低(图3)。采用Waters制备型HPLC对该 化合物进行纯化，获得了 30mg具有单一 HPLC色谱峰的单体化合物 (图4)。
(2) 王不留行增乳活性单体的结构鉴定结果 本研究通过中药对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型泌乳
功能影响的研究，从王不留行中分离获得了一种具有增乳效应的单体 成分。为明确该活性成分的结构特性及其药效学的物质基础，对制备 型HPLC纯化获得的该中药成分进行紫外光谱、质谱、碳谱、氢谱及 超导核磁共振光谱，以确定其结构。结构鉴定结果表明该化合物为邻 苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate)。其具体结构见图5所示。
增乳单体为无色油状液体，易溶于甲醇。能与醇、醚、酮等混溶， 微溶于水。相对密度1.047~1.049，凝固点-35°C，沸点340°C。 HR-ESI-MS(pos.)谱中，在m/z301.1413处可见[M+Na]+分子离子峰， 表明化合物的分子量为278。结合'H-NMR和13C-NMR谱推测其分 子式为(^16112204(计算值301.1416)，计算出不饱和度为6。
表4-l为该化合物的核磁共振谱的数据与归属。根据此实验结果 在化合物^-NMR谱中，因其结构的对称性，故仅表现出半数结构的 质子信号特征。低场区37.71(2H, dd, J=6.0， 3.2Hz )和7.61(2H, dd, J=6.0, 3.2Hz )处可见归属于邻二取代苯上的两组氢信号；S4.28(4H, t， J二6.4Hz)处可见2个氧代亚甲基氢信号；1.71(4H,m)和1.45(4H，m)处 可见4个亚甲基氢信号；S0.97(6H, t，片3.6Hz)处可见2个甲基氢信号。
8200910072959.5 ， 亦仅表现出半数结构的碳信号特征。其中包括归属于苯环的6个碳信 号(3132.4x2、 129.9x2和133.6x2);在低场区5169.3处可见酯羰基碳 信号；另外，在566.6处可见氧代亚甲基碳信号；S31.7和20.3处可 见亚甲基碳信号；此外在514.1处可见甲基碳信号。
将化合物的！H-NMR谱的全部氢信号和"C-NMR谱的所有碳信 号进行了准确的解析和归属。并将化合物的波谱学数据与已知化合物 邻苯二甲酸二丁酯进行对照，两者基本一致。综合以上分析，鉴定化 合物为邻苯二甲酸二丁酯。
表4-1 THL化合物的H-NMR和13C-NMR的统计数据No.sHsc
1,27.71(2H， dd，《/=6.0,132.4
3,63.2Hz) 7.61(2H, dd，J=6.0,129.9
4,53.2Hz)133.6
1，-169.3
r4.28(4H, t,声6.4Hz)66.6
2"1.71(4H, m)31.7
3"1.45(4H， m)20.3
4，，0.97(6H， t，月.6Hz)14.1
(3)王不留行增乳活性单体的增乳效应
①邻苯二甲酸二丁酯可以显著促进奶牛乳腺上皮细胞乳糖和卩-酪蛋白分泌能力的提高。②邻苯二甲酸二丁酯提高泌乳期小鼠和奶牛的动物产奶量试验表明该单体具有增乳活性。
权利要求
1.一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法，其特征在于方法步骤如下步骤一王不留行粗提取取王不留行粗粉10kg，用体积分数70％的乙醇加热回流提取3次，每次2h，减压回收溶剂，稀释母液，依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，获得乙酸乙酯萃取部位；步骤二王不留行提取物活性部位的筛选对乙酸乙酯部位进行聚酰胺柱层析，干法上样，分别用水，10％，30％，50％，70％，95％乙醇系统进行梯度洗脱，收集不同梯度洗脱液，旋转蒸发后获得不同洗脱部位的中药成分，通过其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳模型细胞活力、乳糖及乳蛋白分泌能力的影响确立50％的乙醇洗脱部位为王不留行增乳活性部位；步骤三王不留行增乳单体的制备对50％的有效部位进行进一步的分离纯化，对聚酰胺柱层析分离获得的50％乙醇洗脱部位进行硅胶薄层层析，根据硅胶G板的薄层结果的Rf值情况选择摸索不同的溶剂系统，最终确立石油醚-乙酸乙酯系统为有效分离系统，采用石油醚-乙酸乙酯系统对50％乙醇洗脱部位进行硅胶柱层析，对分离的化合物进行筛选，其中石油醚乙酸乙酯20∶1的洗脱流分中含有一个具有增乳活性的单体成分；对该增乳单体化合物的制备采用分析型和制备型HPLC法进行，采用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％的甲醇对单体化合物的粗品进行紫外全波长扫描进行检识，确立此化合物的紫外吸收波长为275nm，采用半制备型HPLC对化合物连续进样以纯化并制备出高纯度的目的化合物；步骤四增乳单体的结构鉴定采用紫外光谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、高分辨电喷雾质谱(HR-ESI-MS)对目的化合物进行结构鉴定，以确定目的化合物的分子量、分子式及其具体结构形式，鉴定结果确定目的化合物为邻苯二甲酸二丁酯；制备出的邻苯二甲酸二丁酯可以促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳糖和β-酪蛋白的分泌水平；且邻苯二甲酸二丁酯制备的中药单体注射液的动物试验结果表明其可以促进小鼠和奶牛产奶量的提高。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种制备方法简便、纯度高、成本低的从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法。方法步骤包括王不留行粗提取、王不留行提取物活性部位的筛选、王不留行增乳单体的制备、增乳单体的结构鉴定，鉴定结果确定目的化合物为邻苯二甲酸二丁酯；制备出的邻苯二甲酸二丁酯可以促进体外培养的奶牛乳腺上皮细胞乳糖和β-酪蛋白的分泌水平；本发明一种从王不留行中分离制备具有增乳活性单体的方法，在提取过程中采用的乙醇等有机溶剂的成本低廉、无毒、可以回收。采用的聚酰胺柱层析和硅胶柱层析可以扩大规模化生产，从而可以获得大量的增乳成分。对于王不留行中药资源的开发具有一定的意义，也必然会带来一定的经济效益。
文档编号C07C69/00GK101648870SQ200910072959
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月23日 优先权日2009年9月23日
发明者佟慧丽, 李庆章, 君 秦, 高学军, 黄建国 申请人:东北农业大学