专利名称：格尔德霉素的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于药物分离纯化领域，具体涉及一种格尔德霉素(抗癌抗生素)的分离纯化方法。
背景技术：
格尔德霉素(geldanamycin，格尔德霉素)于1970年在吸水链霉菌(Sti^ptomyces hygroscopicus var geldanus NRRL 3602)中首先发现，属于苯安莎类抗生素。这类抗生素还包括herbimycin禾口 macbecins, Ansatrienins禾口 reblastatin,开女台时只发现这些抗生素具有抗原虫和抑制草本植物生长等作用。近年来苯安莎类抗生素在抗癌的领域备受关注，是因为重新认识到它们还具有抗肿瘤和抗病毒的作用。格尔德霉素是合成多种抗肿瘤药物的原料，由于自潮湿链霉菌发酵液中提取高纯度的格尔德霉素较为困难，回收率较低，长期以来成为了研究苯醒安莎霉素类抗生素的障碍。潮湿链霉菌发酵产物中的成分十分复杂，从中提取格尔德霉素的工艺繁琐。在以往的报道中，格尔德霉素的纯化多采用烦琐的液相分配方案，主要利用的是格尔德霉素在不同溶剂中溶解度的差异，多步骤的反复萃取造成总体的回收率较低，也有报道中提到配合高选择性大孔径层析介质的使用，使得格尔德霉素的纯化更加简便，但纯度和回收率均不理想。 中国专利CN02132162中格尔德霉素的纯化采用大孔吸附树脂，具体包括以下步骤将预处理后的格尔德霉素发酵液流经含分离填料的层析柱，用流洗液、洗脱液流洗及洗脱，浓缩后即得到格尔德霉素。其中所述分离填料为纯水/低离子强度的水溶液，洗脱液为甲醇/ 二氯甲烷等有机溶剂。此法所得到的格尔德霉素纯度不高，且最终的成品没有结晶。
发明内容
预处理后的格尔德霉素发酵液中，格尔德霉素含量较低，且有大量的色素、杂质等，给其分离纯化带来较大的问题。为解决该技术问题，本发明提供一种工艺简单却能得到高纯度和高回收率的格尔德霉素的分离纯化方法。本发明人通过动态实验筛选大孔吸附树脂，并对吸附洗脱条件进行优化，使得发酵液中格尔德霉素能够初步的分离富集，然后通过氧化铝柱除去杂质、结晶等步骤进一步纯化，最终制得的格尔德霉素纯度最高可达99%以上。本发明方法的最大优点在于该分离过程简单便捷，切实可行，可避免加热破坏，同时可大幅度降低能耗及生产成本，为工业化制备格尔德霉素提供了可能性。因此，本发明提供一种格尔德霉素分离纯化方法，所述方法包括以下步骤a)将预处理后的格尔德霉素发酵液上大孔吸附树脂；b)用洗脱溶剂系统洗脱所述大孔吸附树脂，得洗脱液；c)将洗脱液过氧化铝柱，得收集液；d)将收集液结晶。所述预处理后的格尔德霉素发酵液按照下列步骤得到取格尔德霉素发酵液，调PH4. 5离心，所得上清液即为预处理后的发酵液。具体处理方法取格尔德霉素发酵液3L，将其pH值调节至4. 5，以4000r/min的速度离心30分钟，取上清，即得预处理后的格尔德霉素发酵液。本发明所述大孔吸附树脂型号可以包括微球1号和HZ803，优选为型号为HZ803的大孔吸附树脂。氧化铝柱可以包括酸性氧化铝柱、中性氧化铝柱或碱性氧化铝柱，考虑到格尔德霉素在碱性氧化铝和中性氧化铝中的稳定性问题，优选酸性氧化铝柱。本发明所述洗脱溶剂系统可以选自丙酮、甲醇或乙醇等，但比较下来，丙酮能够更好的溶解格尔德霉素，且所含的杂质最少。因此所述溶剂系统优选为丙酮水溶液及丙酮。当选择丙酮水溶液作为洗脱溶剂系统时，丙酮水溶液中丙酮的浓度可以是20% -30% (体积百分比)。根据本发明格尔德霉素分离纯化的方法的一个优选方式，所述洗脱条件为预处理后的格尔德霉素发酵液上大孔吸附树脂吸附完全后，先用大量的水冲洗柱子，再用3倍柱体积的20% -30%的丙酮水除去杂质，最后用丙酮洗脱。根据本发明格尔德霉素分离纯化的方法的一个优选方式，本发明所述方法具体包括以下步骤取预处理后的HZ 803树脂(树脂预处理步骤采用含IN盐酸的70%丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3CV，再用去离子水洗到中性)装于层析柱中，取预处理后的发酵液，直接上柱，控制其流速为0. 05CV/min-0. lCV/min,吸附完全后，先用5CV去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，再分别用3CV的20% -30%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，洗脱流速控制在 0. 05CV/min-0. lCV/min，分步收集洗脱液。装填酸性氧化铝层析柱，将格尔德霉素洗脱液流经层析柱，收集流出液。结果发现，经过酸性氧化铝纯化后，在格尔德霉素的丙酮溶液中酸性氧化铝能够有效的吸附其中的色素和极性杂质，而格尔德霉素基本不被其吸附，其纯度达到99%，溶液颜色呈格尔德霉素本身所呈现的淡黄色，再将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在25-30°C，使格尔德霉素结晶析出。该工艺总回收率高达75%。本发明通过实验得到价廉效果好的大孔吸附树脂，并通过洗脱条件的摸索，使其能较好的分离富集格尔德霉素。通过进一步实验得到吸附力强，吸附速度快的氧化铝柱，使得该制备高纯度格尔德霉素的方法优点突出。此方法比文献报道的方法有以下优点1、该工艺材料成本低，操作简单，易于放大，适用于格尔德霉素的大量工业制备。2、所得产物纯度在86%以上，最高可达99%以上。3、提高了回收率，总回收率在35%以上，最高可达75%以上。
图1为本发明实施例5制得的格尔德霉素HPLC图谱，其中格尔德霉素出峰时间为 8. IOmin 左右。HPLC 条件色谱柱Hypersil0DS25um流动相水甲醇=27 73温度40°C
流速0. 8ml/min波长304nm
具体实施例方式本发明格尔德霉素发酵条件如下本发明实施例1-6采用如下菌种Str印tomyces hygroscopicus，保藏号为 ATCC55256，购自美国微生物保藏中心；实施例7_9采用其他类似菌种。斜面培养培养基(质量百分比)酵母膏0. 1%、牛肉膏0. 1%、水解酪蛋白0.2%、葡萄糖 1.0%、琼脂 2.5%。条件J8°C，8d。种子培养培养基(质量百分比)葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.5%条件，3天，摇床转速250rpm。发酵培养培养基(质量百分比)葡萄糖3%、淀粉4%、冷黄豆粉4%、碳酸钙1%、氯化钴 lmg/100ml、豆油 0. 5%。121°C灭菌20min，接种量10%，摇瓶装量100ml/750ml，置于恒温室中旋转式摇床250rpm摇瓶发酵5天后，得到格尔德霉素发酵液。实施例1取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30分钟离心取上清，即得预处理后的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml微球1号树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位747 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml 的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%甲醇水、40%的甲醇水、80%甲醇水、甲醇溶液进行洗脱，分步收集洗脱液。检测发现其纯度68%，回收率约40%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ20Χ250πιπι)中，将格尔德霉素甲醇洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的甲醇收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度为88%，总回收率为35%。实施例2取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml微球1号树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位847 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml 的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%乙醇水、40%的乙醇水、80%乙醇水、乙醇进行洗脱，流速为6ml/min，分步收集洗脱液。检测发现其纯度72 %，回收率约 51%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素乙醇洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的乙醇收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在观！，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度86%，回收率为46%。实施例3取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位822 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，上柱后不用去离子水洗除盐，直接用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制 6ml/min。检测发现其纯度67%，回收率约79%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度高达98%，总回收率为77%。实施例4取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位813 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为5ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制lOml/min。检测发现其纯度78%，回收率约76%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在25°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度高达99.4%，总回收率为73%。实施例5取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位845 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为2. 5ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml 的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制2. 5ml/min。检测发现其纯度79. 8%，回收率约80%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在观！，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度高达99.9%，总回收率为77%。实施例6取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。
取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位853 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制6ml/min。检测发现其纯度80. 8%，回收率约80. 5%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度高达99.9%，总回收率为77%。实施例7-9比较不同菌种来源的发酵液分离效果实施例7采用吸水链霉菌ATCC BAA-668进行发酵，取发酵液2L，调pH4. 5，4000r/min， 30min离心取上清，即得预处理后的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位863 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，再用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制5ml/min。检测发现其纯度69%，回收率约78%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度为98.4%，总回收率为78%。实施例8采用吸水链霉菌NRRL3602进行发酵，取发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离
心取上清，即得预处理后的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位485 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，再用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制5ml/min。检测发现其纯度62%，回收率约74%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度为94. 8%，总回收率为71. 6%。实施例9采用吸水链霉菌SIPI.A. 2060进行发酵培养。该菌株由上海医工院保藏，是以 ATCC BAA-668为出发菌株，对其进行60s紫外诱变处理后挑选出的高产突变株，其发酵单位较出发菌株提高了约70%，且传代稳定性较好。取吸水链霉菌SIPI.A. 2060的发酵液2L，调pH4. 5，4000r/min，30min离心取上清，
即得预处理后的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位844 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，吸附完全后，先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，再用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制5ml/min。检测发现其纯度68%，回收率约80. 7%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度为96.8%，总回收率为74%。对比例1-3考察大孔吸附树脂对格尔德霉素吸附效果的比较对比例1取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml微球一号树脂装于Φ30Χ350πιπι的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位831 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，收集漏液，200ml/瓶。并通过 HPLC对其漏液进行检测，结果发现第7瓶有格尔德霉素漏出，此时树脂的吸附量为23 μ g/ ml.树脂。对比例2取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml HZ 803树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位887 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为3ml/min，收集漏液，200ml/瓶。并通过HPLC 对其漏液进行检测，结果显示无格尔德霉素漏出，此时树脂的吸附量大于35. 48 μ g/ml.树脂。对比例3考察不同氧化铝对格尔德霉素脱色除杂效果的比较对比例3分别取酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝装填于3根层析柱(Φ20Χ250πιπι) 中，高度30ml，将格尔德霉素丙酮洗脱液500ml流经层析柱，流速lml/min，收集流出液。液相检测结果表明酸性氧化铝对格尔德霉素有较好的脱色纯化效果。对比例4，5考察CN02132162中方法和本发明方法比较对比例4取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5，取预处理后的50ml XAD-7树脂装于 Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位687 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为2ml/min，吸附完全后，上柱后先用IOOOml的去离子水洗脱树脂将盐除去，再用250ml 甲醇溶液将格尔德霉素集中洗下，流速控制6ml/min，检测发现其纯度94.4%，回收率约 56. 2%。将洗脱收集液在旋转蒸发仪上旋蒸，得到无定形的格尔德霉素固体。对比例5取格尔德霉素发酵液2L，调pH4. 5,4000r/min, 30min离心取上清，即得预处理后
的格尔德霉素发酵液。取预处理后的50ml微球1号树脂装于Φ 30 X 350mm的层析柱中，取2L处理后的发酵液，单位687 μ g/ml，直接上柱，控制其流速为2ml/min，吸附完全后，上柱后先用250ml的去离子水洗脱树脂将树脂中的盐除去，用150ml的20%丙酮水及丙酮溶液进行洗脱，分步收集洗脱液，流速控制5ml/min。检测发现其纯度89. 4%，回收率约81. 0%。装填30ml的酸性氧化铝层析柱(Φ 20 X 250mm)中，将格尔德霉素丙酮洗脱液流经层析柱，收集流出液。将过完酸性氧化铝的丙酮收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在30°C，使格尔德霉素结晶析出。最终制得的格尔德霉素纯度高达98.9%，总回收率为76.4%。附吸附剂规格大孔吸附树脂HZ803含水量61 士3%粒度(目)20-50比表面积(m2/g) 450-550孔容(mL/g)1. 2-1. 3平均孔径(埃) 100湿真密度(200C )g/Mll. 05湿视密度g/mL 0. 67 士 0. 3生产厂家山海华震科技有限公司100 200目酸性氧化铝技术条件性状白色无定形粉末主要性能指标技术条件符合Q/CYDZ 1791-2005颗粒度> 75.0%干燥失重彡1.0%水溶解物<0.5%灼烧失重彡8.0%ρΗ3·8 4·8生产厂家国药集团化学试剂有限公司
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权利要求
1.格尔德霉素的分离纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a)将预处理后的格尔德霉素发酵液上大孔吸附树脂；b)用洗脱溶剂系统洗脱所述大孔吸附树脂，得洗脱液；c)将洗脱液过氧化铝柱，得收集液；d)将收集液结晶。
2.根据权利要求1所述的分离纯化方法，其特征在于，所述预处理后的格尔德霉素发酵液按照下列步骤得到取格尔德霉素发酵液，将PH值调至4. 5后离心，所得上清液即为预处理后的发酵液。
3.根据权利要求1或2所述的分离纯化方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号选自微球1号或HZ803。
4.根据权利要求3所述的分离纯化方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为 HZ803。
5.根据权利要求1至4任一所述的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱溶剂系统选自丙酮、甲醇或乙醇。
6.根据权利要求5所述的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱溶剂系统为丙酮。
7.根据权利要求6所述的分离纯化方法，其特征在于，所述丙酮为丙酮水溶液。
8.根据权利要求7所述的分离纯化方法，其特征在于，所述丙酮水溶液中丙酮的浓度为20-30体积％。
9.根据权利要求1至7任一所述的分离纯化方法，其特征在于，所述氧化铝柱选自酸性氧化铝柱、中性氧化铝柱或碱性氧化铝柱。
10.根据权利要求9所述的分离纯化方法，其特征在于，所述氧化铝柱为酸性氧化铝柱。
11.根据权利要求1-10任一所述的分离纯化方法，其特征在于，b)步骤用洗脱溶剂系统洗脱所述大孔吸附树脂前，先用大量的水冲洗大孔吸附树脂。
12.根据权利要求1-11任一所述的分离纯化方法，其特征在于，a)步骤中所述的预处理后的格尔德霉素发酵液的上柱流速为0. 05CV/分钟-0. ICV/分钟。
13.根据权利要求1-12任一所述的分离纯化方法，其特征在于，b)步骤中所述洗脱溶剂系统的洗脱流速为0. 05CV/分钟-0. 2CV/分钟。
14.根据权利要求1-13任一所述的分离纯化方法，其特征在于，d)步骤中所述收集液在旋转蒸发仪上缓慢旋蒸，温度控制在25-30°C，使格尔德霉素结晶析出。
全文摘要
本发明公开一种格尔德霉素的分离纯化的方法，所述方法包括以下步骤a)将预处理后的格尔德霉素发酵液上大孔吸附树脂；b)用洗脱溶剂系统洗脱所述大孔吸附树脂，得洗脱液；c)将洗脱液过氧化铝柱，得收集液；d)将收集液结晶。由该方法制得的格尔德霉素色素杂质基本除去，纯度和收率均得到提高。整个工艺过程简单便捷，切实可行，可避免加热破坏，同时可大幅度降低能耗及生产成本，为工业化制备格尔德霉素提供了可能性。
文档编号C07D225/06GK102190620SQ20101012646
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月17日 优先权日2010年3月17日
发明者刘涛, 卢亮, 李继安, 林惠敏 申请人:上海医药工业研究院