专利名称：一种检测鸭圆环病毒抗体的间接elisa方法
技术领域：
本发明所涉及的是一种用于检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，属于兽用生物制品的生产领域。
背景技术：
鸭圆环病毒(Duck circovirus，DuCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员之一，是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒，该病毒于2003年由Hattermann在德国首次报道以来，已分别在匈牙利、美国、中国台湾及中国大陆等地被发现或报道。鸭圆环病毒感染的鸭子所表现的临床症状主要表现为发育状况差，并且明显表现羽毛营养失调，在背部脊柱(的羽毛)尤其明显，许多羽毛羽轴出血，背部皮肤组织病理学检查主要表现为囊泡和围绕囊泡的组织异嗜性炎性渗出，内脏器官总的病理表现为鸭传染性浆膜炎协同感染的症状，对法氏囊组织病理学检查表明，淋巴细胞损伤、坏死、组织细胞增多(Hattermann et al.，2003)。作为一种新发现的病毒，DuCV自2003年以来，已在上述的四个国家相继报道。德国报道的Mulard duck群中DuCV的个体阳性率为46％(6/13)(Hattermann et al.，2003；Soike et al.，2004)，匈牙利Pekin duck群中(Fringuelliet al.，2005)报道的DuCV阳性率为84％(85/101)，在中国台湾地区Muscovy duck群中DuCV阳性率为38.2％(13/34)(Chen et al.，2006)。姜世金等报道在我国福建发生鸭传染性浆膜炎的43只病死鸭中的34只、12个鸭群中的10个鸭群为DuCV阳性(Jiang et al.，2008)。张兴晓等报道在所调查的山东省742只樱桃谷鸭中，DuCV感染率达到三分之一，然而，单纯感染DuCV的样品只占被调查样品总数的18.10％，15.19％为DuCV和其他病原的混合感染，其中，二重感染的比率为9.57％(RA.或E.coli)，三重感染的比率为4.85％(RA+DHV-I或E.coli)，四重感染的比率为0.81％(RA+DHV-I+E.coli)(Zhang et al.，2009)。刘少宁等进行的山东、江苏、四川、福建、广东五个省份36个鸭群临床有发病表现的343只病、死鸭的多个病理组织(肝脏、脾脏、法氏囊，胸腺和骨髓随机采样)DNA的PCR检测显示DuCV个体阳性率为81.63％，群体阳性率为94.44％。表明我国鸭群中DuCV感染的普遍性(刘少宁等，2009)。
由于没有可行的体外增殖培养DuCV的方法，目前尚不能在实验室完成病毒的分离鉴定。目前对DuCV的研究主要集中在PCR检测及全基因组序列测定分析两个方面。普通PCR和荧光定量PCR两种方法均已用于DuCV感染的诊断。二者均具有特异性好、灵敏度高的优点，但荧光定量PCR的灵敏度要比普通PCR高1个数量级，而普通PCR则具有简便适用、成本低廉的优点，更适合在生产中推广应用(Hattermann et al.，2003；Soike et al.，2004；Fringuelli et al.，2005；Chen et al.，2006；Jiang et al.，2008；刘少宁等，2009)。另外，核酸探针杂交检测的方法也在实验室中得到应用，这种方法既可以用于对提取的组织DNA进行检测，也可以对福尔马林固定石蜡包埋样本进行原位检测(Zhang et al.，2009；刘少宁等，2010；Fringuelli et al.，2005)，但在检测灵敏度方面，核酸探针杂交要远低于PCR检测，但其稳定性与可重复性均要高于PCR检测，并且可以根据显色情况对被检的目的核酸进行大致的定量。
血清学调查一直是进行疫病检测的有效手段，特别是适用于健康或者活的动物的检疫，其中，酶联免疫吸附实验(ELISA)由于其标准化、可高通量大量检测样本而成为目前应用最为广泛的一种血清学检测方法。由于目前DuCV不能在体外增殖培养，从病理组织中大量获取抗原也不可取，所以通过分子生物学方法大量表达DuCV的抗原蛋白并以此作为包被抗原建立检测鸭血清中抗DuCV抗体的ELISA方法成为对DuCV感染进行血清学调查的最佳选择。
经过基因组结构分析，发现DuCV仅编码Rep蛋白(replication protein，复制蛋白)和Cap蛋白(Capsid protein，衣壳蛋白)两个主要的ORF。其中Cap蛋白是构成DuCV衣壳的唯一蛋白，其作为病毒的主要抗原蛋白能够诱发感染宿主产生抗体，因此，本发明人通过pET-32a(+)表达载体构建部分Cap基因的原核表达载体，并利用表达后纯化的重组蛋白建立检测相应抗体的间接ELISA方法。
发明内容
本发明提供了一种用于检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，即利用pET-32a(+)原核表达载体，构建了能表达鸭圆环病毒部分衣壳蛋白基因(Cap)的载体，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，以检测鸭血清中DuCV的抗体水平。
本发明通过以下步骤实现 A、利用基因工程重组技术构建鸭圆环病毒衣壳蛋白的原核表达质粒，命名为pET-32a-Cap； B、将质粒pET-32a-Cap转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌(命名为BLpET-32a-Cap)，将BLpET-32a-Cap在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，表达量占到菌体总蛋白的39％。
C、将重组蛋白通过亲和层析进行纯化后复性，Western blot分析表明复性后的重组蛋白具有良好的免疫学活性。
D、以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测鸭血清中DuCV的抗体水平 (1)包被将纯化复性后的重组蛋白用抗原包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为4μg/ml的终浓度，每个ELISA孔加入100μl，4℃条件下包被24h，PBST缓冲液(含0.01％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤5min×3次； (2)封闭每孔加封闭液(含1％明胶、1％牛血清白蛋白、5％脱脂奶粉的PBST缓冲液)100μl，37℃作用3h，PBST缓冲液洗涤5min×3次； (3)加待检血清每孔加入100μl用稀释液按1∶50倍稀释后的血清，37℃作用1.5h，PBST缓冲液洗涤5min×3次； (4)加二抗每孔加100μl稀释的HRP标记的羊抗鸭二抗(用pH7.0的PBS按1∶1000比例稀释HRP-goat anti-duck IgG)，37℃作用1h，PBST缓冲液洗涤5min×3次； (5)加显色液每孔加含1mg/ml TMB(四甲基联苯二胺)的显色液100μl，37℃作用避光作用20min； (6)加终止液每孔加入100μl终止液(2M H2SO4)，酶标仪测定450nm吸光值(OD450)。
(7)结果判定待检血清OD450值≥0.3时判定为鸭圆环病毒抗体阳性，待检血清OD450值＜0.25时判定为鸭圆环病毒抗体阴性，0.25≤OD450值＜0.3时判定为可疑样品，需重新检测，若仍然为0.25≤OD450值＜0.3则判定为鸭圆环病毒抗体阴性。
图1重组蛋白表达和纯化后的SDS-PAGE分析 图2用免疫印迹试验显示DuCV Cap蛋白 具体实施例方式 本发明的发明要点是利用pET-32a Prokaryotic Expression Systems构建部分Cap基因的原核表达载体，并将表达后的重组蛋白进行纯化，建立ELISA方法，并初步运用于临床。
1DuCV Cap基因扩增及表达载体的构建 根据GenBank中已登录的Cap基因序列，自行设计一对引物(5′-ATAGAATTCTTTTCAGTAGTGACGTT-3′；5′-TACCTCGAGACTAGAACCCGGTGAA-3′)。以保存的质粒DNA为模板，PCR扩增Cap部分目的基因，大小约684bp。将PCR产物连接至pMD18-T载体，酶切鉴定为阳性克隆，命名为pMD-Cap。用EcoR I/Xho I酶切重组质粒pMD-Cap，获得Cap基因，克隆入pET-32a(+)载体，用EcoR I/Xho I酶切鉴定，阳性克隆命名为pET-32a-Cap，并送上海生物工程有限公司测序。
2Cap基因的诱导表达和分析 将基因工程菌BLpET-32a-Cap于LB液体培养基中37℃培养，待A600值达到0.4～0.6时，加入Isopropylthio-β-D-galactosi de(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，进行诱导表达。收集诱导后不同时间表达的菌体，于冰浴上进行超声破碎，4℃15000×g离心10min，取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果在沉淀中可见有明显的重组蛋白表达，表达量占到菌体总蛋白的39％，且重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中。
3重组蛋白的纯化、复性和分析 按照Bug Buster Ni-NTA His Bind Purification Kit(Novagen，Madison，WI，USA)说明书进行蛋白的纯化，再用透析的方法使其复性，结果可见一条44kDa的目的蛋白条带，表明亲和层析能获得较纯的目的蛋白。Western blot分析发现，该重组蛋白能与抗鸭圆环阳性血清进行反应，具有良好的免疫学活性。
4以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测鸭血清中DuCV的抗体水平，并对影响试验的各种条件进行选择。
4.1抗原包被浓度与血清最佳稀释度的选择 采用方阵滴定，横排作抗原倍比稀释(128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml)，纵排将阳性血清和阴性血清经大肠杆菌裂解液处理后也分别进行倍比稀释(1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400)，每个稀释度重复1次，取其平均值。结果，当抗原浓度为4μg/ml，待检血清以1∶50稀释时，P/N值最大，非特异性较低。因此每孔400ng的抗原包被量和1∶50稀释的血清浓度为最佳反应浓度。
4.2包被液的选择 分别用蒸馏水(pH6.5)、磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)、碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)、Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0)作为包被液，抗原包被浓度为4μg/ml，阳性、阴性血清作1∶50稀释，按说明书将酶标二抗稀释至1∶1000的浓度，进行ELISA检测。结果当用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)作包被液时，P/N值最高。
4.3抗原包被条件的确定 用最适浓度抗原包被酶标板，包被条件分别为37℃条件下3h、6h、9h、12h和4℃条件下12h、18h、24h、30h、36h。用1％BSA/PBS溶液封闭，加入1∶50稀释的阳性血清进行ELISA测定，结果4℃包被24h效果更好。
4.4血清最佳反应时间的确定 加入血清后，分别在37℃温箱中作用30、60、90、120min后，进行DuCV抗体的ELISA检测。结果待检血清作用90min为最佳。
4.5底物最佳反应时间的确定 加入底物(TMB)后，室温避光10、15、20、25min后，加入H2SO4终止反应。结果表明底物最佳作用时间为20min。
4.6间接ELISA临界值的确定 在最佳工作条件下，对收集的1109份无DuCV抗体鸭血清进行间接ELISA测定，确定阴阳性临界值(X±3SD)分别为0.25和0.30。
4.7间接ELISA的特异性和重复性试验 利用DuCV Cap重组蛋白建立的间接ELISA方法检测DHV、DPV、GPV、NDV等阳性血清，结果OD值均小于0.25，为阴性，表明该方法与上述病毒无交叉反应；对效价高、中、低的三份血清进行了测定，计算本试验的板间、板内的变异系数(CV，是个体参数的标准差与平均数的比率)，结果均小于10％，表明该方法具有较好的重复性。
5间接ELISA方法的初步应用 通过对山东省五个地区的12个种鸭场403份血清和两个地区的19个肉鸭场的1211份血清进行间接ELISA检测，结果显示肉鸭场的DuCV抗体个体阳性率在0～40.43％，平均为12.96％(157/1211)，群体阳性率为89.47％(16/18)，19个鸭场仅有2个鸭场抗体为阴性(具体结果见表1)；种鸭场的DuCV抗体个体阳性率在0～88.89％，平均为22.08％(89/403)，群体阳性率为75％(9/12)，12个鸭场有3个鸭场抗体为阴性(具体结果见表2)。并且DuCV在老养殖场以及养殖时间长的鸭群的感染和危害更加严重。
表1不同肉鸭场DuCV的个体检出率
表2不同种鸭场DuCV的个体检出率
本发明的优点 本发明利用表达和纯化后的重组蛋白作为抗原包被ELISA板建立的间接ELISA方法，确实可以检测到鸭体内抗DuCV抗体，且具有良好的特异性和重复性。对临床样品进行检测，结果表明本方法可以作为鸭圆环病毒血清学检测的一种方法而运用到生产实践中。
权利要求
1.一种检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，其特征在于通过以下步骤实现
A、利用基因工程重组技术构建鸭圆环病毒衣壳蛋白的原核表达质粒，命名为pET-32a-Cap；
B、将质粒pET-32a-Cap转入宿主菌大肠杆菌中成为基因工程菌(命名为BLpET-32a-Cap)，将BLpET-32a-Cap在LB培养基中培养，诱导表达并经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中，表达量占到菌体总蛋白的39％；
C、将重组蛋白通过亲和层析进行纯化后复性，Western blot分析表明复性后的重组蛋白具有良好的免疫学活性；
D、以重组蛋白为包被抗原制备ELISA检测板，检测鸭血清中DuCV的抗体水平
(1)包被将纯化复性后的重组蛋白用抗原包被液(0.05mol/L，pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释为4μg/ml的终浓度，每个ELISA孔加入100μl，4℃条件下包被24h，PBST缓冲液(含0.01％Tween-20的PBS缓冲液)洗涤5min×3次；
(2)封闭每孔加封闭液(含1％明胶、1％牛血清白蛋白、5％脱脂奶粉的PBST缓冲液)100μl，37℃作用3h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；
(3)加待检血清每孔加入100μl用稀释液按1∶50倍稀释后的血清，37℃作用1.5h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；
(4)加二抗每孔加100μl稀释的HRP标记的羊抗鸭二抗(用pH7.0的PBS按1∶1000比例稀释HRP-goat anti-duck IgG)，37℃作用1h，PBST缓冲液洗涤5min×3次；
(5)加显色液每孔加含1mg/ml TMB(四甲基联苯二胺)的显色液100μl，37℃作用避光作用20min；
(6)加终止液每孔加入100μl终止液(2M H2SO4)，酶标仪测定450nm吸光值(OD450)；
(7)结果判定待检血清OD450值≥0.3时判定为鸭圆环病毒抗体阳性，待检血清OD450值＜0.25时判定为鸭圆环病毒抗体阴性，0.25≤OD450值＜0.3时判定为可疑样品，需重新检测，若仍然为0.25≤OD450值＜0.3则判定为鸭圆环病毒抗体阴性。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测鸭圆环病毒抗体的间接ELISA方法，即利用pET-32a(+)原核表达载体，构建了能表达鸭圆环病毒部分衣壳蛋白(Cap)的基因工程菌BLpET-32a-Cap，并将表达的重组蛋白纯化复性后包被ELISA板，以检测鸭血清中DuCV的抗体水平。结果表明该方法具有重复性好、特异性高的特点，可用于DuCV血清学调查。
文档编号C07K14/01GK101806800SQ20101012634
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者姜世金, 刘少宁, 周恩民 申请人:山东农业大学