一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法

专利名称：一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法。
背景技术：
小麦是世界上的主要粮食作物，是我国的第三大类粮食作物，在人类生存和国家 粮食安全中起着十分重要的作用。小麦籽粒含有丰富的营养成分，其中蛋白质约占籽粒营 养成分的8% 10%，包括水溶性的清蛋白、盐溶性的球蛋白、醇溶性的醇溶蛋白及溶于酸 或碱的麦谷蛋白类。清蛋白和球蛋白主要存在于小麦种子的胚和糊粉层中，约占籽粒蛋白 的15%左右，在加工后得到的面粉中含量很少，对小麦面粉加工品质的影响比较小。醇溶 蛋白和麦谷蛋白是小麦胚乳中的主要储藏蛋白，约占籽粒蛋白的85 %，是小麦面粉中的主 要蛋白，与小麦面粉加工品质密切相关。其中，醇溶蛋白是单体蛋白，主要影响面团的粘性， 而麦谷蛋白可以形成多聚体蛋白，主要影响面团的弹性。小麦的麦谷蛋白按其分子量大小 又分为高分子量麦谷蛋白亚基(high molecularweight glutenin subunits，简称HMW-GS) 和低分子量麦谷蛋白亚基(low molecularweight glutenin subunits，简称LMW-GS)，其中 LMW-GS是面筋的主要成份，对小麦面粉加工品质起着重要的作用，主要影响面筋的强度和 延展性。SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis, 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)是蛋白质分离中常用的实验技术，其仪器简单、操 作方便、重复性好，在麦谷蛋白的分离鉴定中得到了广泛的应用，特别是在高分子量麦谷蛋 白的分离和命名中发挥了很大的作用。但是小麦LMW-GS的组成比较复杂，种类较多，分子 量大小相似，在SDS-PAGE图谱中迁移率差别很小，难以进行有效的分离和鉴定。随着双向电泳技术和质谱技术的发展以及蛋白质组学技术平台的建立，基于双 向电泳和质谱分析的蛋白质组学技术在分析小麦种子蛋白的研究中发挥着越来越大的作 用。双向电泳(2-DE)又称为等电聚焦双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-SDS-PAGE)，在20世 纪70年代中期建立并开始广泛应用，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的技 术。其原理是，蛋白质首先根据等电点的不同在第一向等电聚焦电泳中分离，然后被转移到 SDS-PAGE中，根据分子量的大小进行第二向分离。质谱(Massspectrometry，MS)分析法是 通过测定样品离子的质荷比(m/z)来进行成分和结构分析的方法，可以将2-DE分离得到的 蛋白质进行有效地鉴定，目前基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F MS)和液相 色谱-电喷雾-串联质谱(LC-ESI-MS/MS)的检测效果较好，应用很广泛。近年来，基于双 向电泳结合质谱技术的蛋白质组学方法在分离小麦LMW-GS的研究中得到了很好的应用。蛋白质双向电泳的第一向凝胶电泳为等电聚焦，根据不同蛋白质本身所带有电荷 的不同将它们进行分离。在麦谷蛋白的提取过程中多使用SDS(十二烷基磺酸钠)来提高 提取效率。而SDS能与蛋白质牢固地结合，改变蛋白质本身所带的电荷，进而影响第一向等 电聚焦，所以，在LMW-GS提取中应尽可能避免使用SDS。在Singh等(1991)提出的麦谷蛋 白提取方法中，仅使用异丙醇和Tris碱，最大限度地减少了对蛋白的修饰。但在用DTT将麦谷蛋白中的二硫键还原后，要用4-乙烯吡啶(4-VP)对还原得到的巯基进行修饰保护，防 止自由巯基的再氧化。我们发现4-VP的修饰可以改变蛋白质的等电点，影响等电聚焦，进 而影响2-DE的效果。与正常条件下的分析结果相比，4-VP修饰改变了 LMW-GS的等电点，超 出了 IPG胶条的pH值(3-10)范围，导致蛋白质在等电聚焦时迁移到了胶条之外，致使等电 聚焦过程失败，即在2-DE图谱中，VP修饰后的大多数蛋白点聚集于碱性端，很多本应出现 的蛋白点丢失了(如图1)。利用质谱对蛋白凝胶中的蛋白质进行鉴定的基本思路是使用蛋白酶将凝胶中的 蛋白切割成大小适中的肽段，再将肽段回收，然后利用质谱测定得到肽段的分子量，产生 质谱峰图，质谱峰图中的信号峰与蛋白点酶切后得到肽段的质量数是一一对应的。在常规 的蛋白质组学研究中，普遍使用的蛋白酶是胰蛋白酶，因为胰蛋白酶可以特异识别氨基酸 K和R，而且K和R在大多数蛋白质中的数量适中和分布较均勻，可以得到合适大小(m/z， 900-3600)的酶切肽段。麦谷蛋白是指禾谷作物的种子中溶于稀酸或稀碱，但不溶于水、盐及醇溶液的蛋 白质组分，是由多个亚基通过分子间二硫键相互连接成的大分子物质，麦谷蛋白在稀酸或 稀碱溶液中的溶解性随肽链上二硫键数目的增加而减小。麦谷蛋白按其分子量高低可分为高分子量麦谷蛋白亚基(分子量为60kD以上) 和低分子量麦谷蛋白亚基(分子量一般为30-45kD)。

发明内容
本发明的目的是提供一种分离麦谷蛋白亚基的方法。本发明所提供的分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤将待分离的麦谷蛋白 进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有 DTT的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述DTT在所述水合上样缓冲液中的浓度为 20mM-65mM,具体为 65mM 或 20mM。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待分离的麦谷蛋白是按照包括如下步骤的 方法提取得到的(1)从待提取物质中提取总蛋白；(2)从步骤(1)得到的蛋白中去除醇溶 蛋白；(3)再用麦谷蛋白提取缓冲液从步骤(2)得到的蛋白中提取麦谷蛋白，得到麦谷蛋 白；所述麦谷蛋白提取缓冲液由异丙醇、Tris-HCl缓冲液、DTT和水组成。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待分离的麦谷蛋白的提取方法中，在所述 步骤(1)之前，包括如下步骤用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物质，离心，收集沉淀，从 沉淀中提取总蛋白；所述水合上样缓冲液由尿素、硫脲、CHAPS、DTT、pH值范围为3_10的IPG buffer、 pH值范围为6-11的IPG buffer和水组成。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，每升所述麦谷蛋白提取缓冲液由500ml异丙 醇、12. 5ml pH值为8. 0的IM Tris-HCl缓冲液、65mmol DTT和水组成；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，每1升所述水合上样缓冲液由6mol尿素、2mol 硫脲、40g CHAPS、20mmol-65mmol DTT、5ml pH值范围为 3-10 的 IPG buffer、1. 25mlpH值范围为6-11的IPG buffer和水组成；所述DTT具体为20mmol ；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述TCA的丙酮溶液中，TCA的浓度为10% (质 量百分含量)；所述浸泡的温度为_20°C，所述浸泡的时间为2小时；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述双向电泳中，第一向是等电聚焦电泳，第二 向是SDS电泳；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述麦谷蛋白亚基为高分子量麦谷蛋白亚基或 低分子量麦谷蛋白亚基；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述待提取物质为麦类作物的去胚后的种子；上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述麦类作物为小麦、大麦或黑麦。上述分离麦谷蛋白亚基的方法中，所述小麦的品种为小偃54。本发明的另一个目的是提供一种分离鉴定低分子量麦谷蛋白亚基的方法。本发明所提供的分离鉴定低分子量麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤1)用上述任一分离麦谷蛋白亚基的方法得到分离的低分子量麦谷蛋白亚基；2)用胰凝乳蛋白酶酶解所述分离的麦谷蛋白亚基，将得到的产物记作酶解产物；3)将所述酶解产物进行质谱检测；4)根据所述质谱检测的结果，得到所述分离的麦谷蛋白亚基的氨基酸序列。上述分离鉴定低分子量麦谷蛋白亚基的方法中，所述酶解的温度为30°C，所述酶 解的时间为4小时；所述胰凝乳蛋白酶与所述分离的麦谷蛋白亚基的质量比为1 50。胰凝乳蛋白酶购自Princeton Separations公司，产品目录号为EN-160。本发明的另一个目的是提供一种提取麦谷蛋白的方法。本发明所提供的提取麦谷蛋白的方法，包括如下步骤(1)用TCA的丙酮溶液浸 泡所述待提取物质，离心，收集沉淀；(2)从步骤(1)得到的沉淀中提取总蛋白；(3)从步骤 (2)得到的蛋白中去除醇溶蛋白；(4)再用麦谷蛋白提取缓冲液从步骤(3)得到的蛋白中提 取麦谷蛋白，得到麦谷蛋白；所述麦谷蛋白提取缓冲液由异丙醇、Tris-HCl缓冲液、DTT和水组成。上述提取麦谷蛋白的方法中，每升所述麦谷蛋白提取缓冲液由500ml异丙醇、 12. 5ml pH 值为 8. 0 的 Imol Tris-HCl 缓冲液、65mmol DTT 和水组成。上述提取麦谷蛋白的方法中，所述TCA的丙酮溶液中，TCA的浓度为10% (质量百 分含量)；所述浸泡的温度为_20°C，所述浸泡的时间为2小时；上述提取麦谷蛋白的方法中，所述麦谷蛋白亚基为高分子量麦谷蛋白亚基或低分 子量麦谷蛋白亚基；上述提取麦谷蛋白的方法中，所述待提取物质为麦类作物的去胚后的种子；所述 麦类作物为小麦、大麦或黑麦。上述提取麦谷蛋白的方法中，所述小麦的品种为小偃54。本发明方法首先在Singh等(1991)提出的麦谷蛋白提取方法(仅使用异丙醇和 Tris碱)的基础上进行了改进，包括TCA/丙酮沉淀蛋白和省去4-乙烯吡啶修饰，没有对 还原得到的巯基进行修饰，而是在蛋白质提取以及后续的分离过程中，保持缓冲液中足够 的DDT浓度，维持还原态的环境，以达到防止游离巯基氧化的目的，使之完全适合蛋白质双 向电泳的需要。其次建立了用胰凝乳蛋白酶对麦谷蛋白进行酶切适合质谱鉴定的方法。因为低分子量麦谷蛋白中重复区比较长，用常规的蛋白质组学研究中普遍使用的胰蛋白酶进 行酶切切点比较少，得到的肽段比较长，不适合质谱鉴定；而胰凝乳蛋白酶可以识别氨基酸 F、Y、W、M和L，在LMW-GS序列中有较多的识别位点，虽然其酶切特异性不高，但实验中只要 严格控制实验条件，包括酶的用量、酶切时间等，尽可能地减少非特异酶切，酶切得到的肽 段完全能适合于质谱鉴定。比较合适的酶切体系是每个蛋白点的用酶量为40ng，酶切时间 为4小时，反应温度为30°C。本发明方法具体的提供了适合双向电泳的低分子量麦谷蛋白的提取和适合质谱 鉴定的蛋白质胶内酶切的技术方案，解决了小麦低分子量麦谷蛋白亚基的分离鉴定技术问 题，也为同类型新的蛋白的分离鉴定提供了一种切实有效的方法，因此，本发明方法适合于 推广应用。


图1为4-乙烯吡啶修饰后的麦谷蛋白经过双向电泳分离得到的电泳图谱。图2为小偃54中麦谷蛋白的SDS-PAGE和2_DE图谱。A、小偃54中的麦谷蛋白的 SDS-PAGE分析；B、利用pH值范围为3_10的蛋白质双向电泳分离小偃54中的麦谷蛋白。在 低分子量区域的蛋白点均集中在电泳图谱的偏碱性区域。图3为小偃54中低分子量麦谷蛋白的2-DE分离图谱以及质谱的鉴定结果。Ajf 双向电泳图谱中的所有60个蛋白点进行MALDI-T0F和LC-MS鉴定。1、2、3、5、6、8、9、10-15、 41、42、47、48、33、38 号圈标注的是低分子量麦谷蛋白点，7、16、18、19、20_24、27_29、32、36、 37、39、40、43、44、53、54号圈标注的是醇溶蛋白点，26、51、57号圈标注的是其他类型的已 知蛋白，而 58-60、4、17、25、30、31、34、35、45、46、49、50、52、55、56 号圈标注的是未知蛋白； B、对小偃54中的低分子量麦谷蛋白的SDS-PAGE图谱。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、小偃54种子中低分子量麦谷蛋白亚基的分离与鉴定小偃54种子购自河南舞阳县种子公司，产品目录号为小偃54。一、小偃54种子中麦谷蛋白亚基的提取提取总蛋白1)将一粒去胚的小偃54干种子磨碎(越碎越好)，放入2mL的离心管中，加入 ImL预冷的10% (质量百分含量)TCA的丙酮溶液(TCA溶于丙酮中)，_20°C沉淀2小时， 15000Xg，4°C离心10分钟，收集沉淀；2)用预冷的丙酮(含有0.07% β-巯基乙醇)漂洗 沉淀，_20°C静置1小时，15000Xg，4°C离心10分钟，收集沉淀；3)再用预冷的80%丙酮水溶液漂洗沉淀，_20°C静置1小时，15000 X g，4°C离心10 分钟，收集沉淀；4)重复步骤3) —次，在空气中挥干沉淀，约10-15分钟；去除醇溶蛋白5)加入800 μ L 50%的异丙醇水溶液，65°C水浴40分钟，期间震荡2_3次，使其中的粉末悬浮，15000 Xg离心10分钟，弃上清，收集沉淀；6)重复步骤5)三次；提取麦谷蛋白7)向沉淀中加入300 μ L麦谷蛋白提取液(每1升所述麦谷蛋白提取液由500ml 异丙醇、12. 5ml pH值为8. 0的IM Tris-HCl缓冲液、IOg (即65mmol) DTT (二硫苏糖醇)和 水组成，用水补足体积)，65°C水浴50分钟，期间震荡几次，15000 Xg离心10分钟，吸取上
清到一新管中；8)重复步骤7) —次；沉淀麦谷蛋白9)收集所有上清液，加入3倍体积的冰丙酮，-20°C静置过夜，15000 Xg离心10分
钟，弃上清；10)加入1.6mL丙酮(含有0.07% β -巯基乙醇)漂洗沉淀，_20°C静置30分钟， 15000 Xg离心10分钟，弃上清；11)重复 10) —次；12)加入1. 6mL 80%丙酮漂洗沉淀，_20°C静置30分钟，15000Xg离心10分钟，
弃上清；13)在空气中挥干沉淀，约10-15分钟；制备蛋白上样液14)加入500 μ L水合缓冲液(每升所述水合上样缓冲液由6mol尿素、2mol硫脲、 40g CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)、3. Ig DTT(相当于20mmol的 DTT) ,5ml pH 值范围为 3-10 的 IPG buffer、1. 25ml pH 值范围为 6-11 的 IPG buffer 和水 组成，水补足体积)，室温下震荡1小时，15000Xg室温下离心10分钟，取上清液，利用2D Quant Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)进行蛋白质浓度测定，等待上样或者分 装后-80°C保存。二、小偃54种子中低分子量麦谷蛋白亚基的分离(一)蛋白质双向电泳(2-DE)第一向电泳——等电聚焦禾Ij用 24cm 的 pH 范围为 3-10 的 IPG (Immobilized pH gradient)胶条(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)，在 Ettan IPGphorII IEF 上进行等电聚焦。1)根据蛋白质浓度测定结果，吸取500 μ g麦谷蛋白，用水合缓冲液补加到 460 μ L，混勻，18，OOOxg室温离心5分钟；2)吸取450μ L麦谷蛋白溶液均勻分布到等电聚焦电泳槽中，缓缓放上IPG胶条， 避免产生气泡，均勻覆盖硅油。3) IPG胶条在电场作用下进行水化，30V，6小时，然后60V，6小时；4)进行等电聚焦电泳，维持系统温度为20°C，具体程序如下200V 1. 5h， 500V1. 5h, 1000V 2h, Gradient 8000V 3h，最后稳定在 8000V 约 8h，总共达到 75，OOOVhs，停
止电泳。5)将IPG胶条取出，吸净硅油，放在-80°C保存，或者继续后续的实验。第二向电泳-SDS-PAGE
6)完成等电聚焦的IPG胶条浸在2-DE平衡缓冲液(50mM Tris-Cl pH8. 8，6M尿 素，30%甘油，2% SDS，微量溴酚蓝)中，加入2% (w/v)DTT，摇床上轻轻震荡15分钟；7)用蒸馏水冲洗IPG胶条，将IPG胶条浸在2-DE平衡缓冲液(50mM Tris-ClpH8.8，6M尿素，30%甘油，2%SDS，微量溴酚蓝)中，加入2. 5% (w/v)碘代乙酰胺， 摇床上轻轻震荡15分钟；8)用蒸馏水冲洗IPG胶条，将胶条放在已经配制好的聚丙烯酰胺凝胶上，并用 0.5%的低熔点琼脂糖(用电泳缓冲液和微量溴酚蓝配制，在微波炉里熔解)将IPG胶条进 行固定，避免存在气泡，待琼脂糖凝固后，进行SDS-PAGE。9) 15°C恒温电泳，最初30分钟，恒定功率为0. 5ff/gel电泳，然后调整为4W/gel，过 夜，至溴酚蓝指示剂离开凝胶后约30分钟，停止电泳。蛋白凝胶的固定、染色、脱色1)电泳结束后，小心取下凝胶，用固定液(40%乙醇，10%冰乙酸)固定1小时；2)倒掉固定液，用蒸馏水冲洗2遍；3)加入配制好的染色液(10%硫酸铵，10%磷酸，0. 12%考马斯亮蓝6250，20%甲 醇)，摇床80转/分钟，摇动过夜(10小时以上)；4)观察蛋白条带染色清楚后，将染色液倒到废液瓶中，统一处理；5)用脱色液(10%乙醇，7%冰乙酸)漂洗凝胶5分钟，倒掉脱色液，用蒸馏水漂洗 2次，再用蒸馏水浸泡凝胶，摇床上摇动2小时，期间换两次蒸馏水；6)在扫描仪(UMAX PowerLook 1120)上，扫描凝胶并保存图片。7)将蛋白凝胶用保鲜膜包裹于4°C保存或直接用于挖取蛋白点作胶内酶切。实验设3次重复。得到的胶图如图2B所示。
(二)麦谷蛋白的SDS-PAGE分析将实验一提取得到的麦谷蛋白直接进行SDS-PAGE。实验设3次重复。结果如图 2A所示。图2表明，本发明提取的麦谷蛋白中，在低分子量区域的蛋白点均集中在电泳图 谱的偏碱性区域。(三)按照Singh等(1991)方法提取和分离麦谷蛋白按照文献(A simplified SDS-PAGE procedure for separating LMW-subunits of glutenin, Singh NK, Sh印herd Kff, Cornish GB. 1991，J Cereal Sci)中所述方法提取 麦谷蛋白，具体方法与实验一中所述一致，不同之处在于没有第1)骤。按照实验二(一)中所述方法进行电泳，不同之处在于所用的水合上样缓冲液中 不含有DTT而是用4-VP取代DTT，具体如下每升水合上样缓冲液由6mol尿素、2mol硫脲、 40g CHAPSU4g 4-VP、5ml pH 值范围为 3-10 的 IPG buffer、1. 25ml pH 值范围为 6-11 的 IPG buffer和水组成，水补足体积。实验设3次重复。得到的胶图如图1所示。图1和图2比较看出，本发明方法使低分子量麦谷蛋白亚基在胶中分离效果更好， 而Singh等的方法中低分子量麦谷蛋白亚基大部分聚集在一起，没有被充分分离，本发明 方法的分离效果好。三、低分子量麦谷蛋白亚基胶内酶切回收及质谱鉴定
胰凝乳蛋白酶购自Princeton Separations公司，产品目录号为EN-160。(一)酶切各个低分子量麦谷蛋白亚基1)将目标蛋白点切下(图3，图3是图2的一部分)，在100 μ L水中漂洗20分钟。2)吸掉水，加入100 μ L蛋白点凝胶脱色液(50% CAN，50mM NH4HCO3)，摇床上震荡， 至脱色完全，约需5小时；3)加入50 μ L乙腈静置10分钟，将胶块脱水；4)用冷冻干燥机干燥胶块，约30分钟；5)加入 50 μ L 的凝胶蛋白点还原剂(50mM NH4HCO3, 20mM DTT)，60°C，1 小时；6)弃液体，静置至室温，加入50 μ L乙腈，静置10分钟，将胶块脱水；7)弃液体，空气干燥5分钟，加入50μ L凝胶蛋白点烷基化剂(50mM NH4HCO3, 55mM 碘代乙酰胺)，37 °C避光静置30分钟；8)弃液体，用50 μ L 50mM碳酸氢铵溶液洗3次；9)加入50 μ L乙腈脱水，弃液体；10)在冷冻干燥机中将蛋白点凝胶块干燥；11)酶解向胶块中加入胰凝乳蛋白酶，酶浓度为20ng/ μ L，加入2 μ L，(即胰凝乳 蛋白酶与低分子量蛋白亚基的质量比为1 50)，在4°C使胶块吸胀。12)将管子倒置，30°C空气浴，酶切4小时；13)用水将胶块瞬时漂洗一次，洗掉反应体系中的盐离子；14)加入IOyL 5%三氟乙酸提取肽段，37°C倒置1小时，将液体转移到一干净离 心管中；15)每胶块再加入10 μ L 2. 5%三氟乙酸/50%乙腈，30°C倒置1小时，吸取液体与 前一次的提取液合并；16)真空浓缩肽段提取液，得到酶解肽段提取物；17)在_20°C中存放，在质谱检测前，加入2μ L 0. 5%的三氟乙酸水溶液溶解酶解 肽段提取物，将得到的溶液记作酶解肽段提取物的溶液。(二)质谱检测MALDI-TOF MS吸取1 μ L 酶解肽段提取物的溶液与 1 μ L CHCA ( α -Cyano-4-hydroxycinnamic acid, Sigma-Aldrich, MO, USA)基质溶液混合，取1 μ L点样到样品板上。利用Bruker Autoflex 质谱仪(Bruker Daltonics, MA, USA)检测 m/z 为 900-3500 的带电离子，保存得 到的谱图。利用软件Biotools 2. 1 (Bruker Daltonics, MA, USA)和在线程序Mascot检索 NCBInr (other green plant)数据库，检索参数如下0. 15-0. 5Da的质量数偏差，允许存在 1个非彻底酶切位点，固定修饰为C(Cys)烷基化，可变修饰为M(Met)的氧化。根据软件的 统计方法判断选取可信的检索结果1。LC-MS/MS利用LCQ deca XP plus 离子胼质谱(Thermo Finnigan, MA, USA)进行 LC-MS/MS 检测。将酶解肽段提取物的溶液用15yL 0.5%的甲酸水溶液稀释，进行质谱检测，采集检 测结果。利用软件Bioworks 3.1分析检测结果。鉴定结果如表1所示。“MALDI-TOF MS或LC-MS/MS质谱鉴定的肽段”表示每一种低分子量麦谷蛋白亚基的特征肽段序列。蛋白点表示图3所示胶图上的蛋白点。a理论分 子量与等电点的计算是通过在线软件Compute ρ I/Mw tool讲行的(http://w驟.expasy. ch/tools/pitool, html)。对于每一种低分子量麦谷蛋白亚基，两种质谱的鉴定结果一致。本发明方法利用过量的DTT作为还原剂取代VP修饰，一方面没有修饰二硫键不会 改变蛋白的等电点，同时还能防止巯基氧化；而利用胰凝乳蛋白酶可以将含有较多重复序 列的麦谷蛋白酶解成较多大小适合质谱鉴定的肽段，因此对小麦低分子量麦谷蛋白的分离 鉴定效果很好。表1、各蛋白点的鉴定结果
权利要求
一种分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤将待分离的麦谷蛋白进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有DTT的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述DTT在所述水合上样缓冲液中的浓 度为 20mM-65mM，具体为 65mM 或 20mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待分离的麦谷蛋白是按照包括 如下步骤的方法提取得到的(1)从待提取物质中提取总蛋白；(2)从步骤(1)得到的蛋白 中去除醇溶蛋白；(3)再用麦谷蛋白提取缓冲液从步骤(2)得到的蛋白中提取麦谷蛋白，得 到麦谷蛋白；所述麦谷蛋白提取缓冲液由异丙醇、Tris-HCl缓冲液、DTT和水组成。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述待分离的麦谷蛋白的提取 方法中，在所述步骤(1)之前，包括如下步骤用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物质，离 心，收集沉淀，从沉淀中提取总蛋白；所述水合上样缓冲液由尿素、硫脲、CHAPS、DTT、pH值为3_10的IPG buffer、pH值为 6-11的IPG buffer和水组成。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于每升所述麦谷蛋白提取缓冲液 由500ml异丙醇、12. 5ml pH值为8. 0的IM Tris-HCl缓冲液、65mmol DTT和水组成；每1升所述水合上样缓冲液由6mol尿素、2mol硫脲、40g CHAPS、20mmol-65mmolDTT、 5ml pH 值为 3-10 的 IPG buffer、1. 25mlpH 值为 6-11 的 IPG buffer 和水组成；所述 DTT 具 体为 20mmol ；所述TCA的丙酮溶液中，TCA的浓度为10% (质量百分含量)；所述浸泡的温度 为-20°C，所述浸泡的时间为2小时；所述双向电泳中，第一向是等电聚焦电泳，第二向是SDS电泳；所述麦谷蛋白亚基为高分子量麦谷蛋白亚基或低分子量麦谷蛋白亚基；所述待提取物质为麦类作物的去胚后的种子；所述麦类作物为小麦、大麦或黑麦。
6.一种分离鉴定低分子量麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤1)用权利要求1-5中任一所述的方法得到分离的低分子量麦谷蛋白亚基；2)用胰凝乳蛋白酶酶解所述分离的低分子量麦谷蛋白亚基，将得到的产物记作酶解产物；3)将所述酶解产物进行质谱检测；4)根据所述质谱检测的结果，得到所述分离的低分子量麦谷蛋白亚基的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述酶解的温度为30°C，所述酶解的时间 为4小时；所述胰凝乳蛋白酶与所述分离的低分子量麦谷蛋白亚基的质量比为1 50。
8.一种提取麦谷蛋白的方法，包括如下步骤(1)用TCA的丙酮溶液浸泡所述待提取物 质，离心，收集沉淀；(2)从步骤(1)得到的沉淀中提取总蛋白；(3)从步骤(2)得到的蛋白 中去除醇溶蛋白；(4)再用麦谷蛋白提取缓冲液从步骤(3)得到的蛋白中提取麦谷蛋白，得 到麦谷蛋白；所述麦谷蛋白提取缓冲液由异丙醇、Tris-HCl缓冲液、DTT和水组成。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于每升所述麦谷蛋白提取缓冲液由500ml 异丙醇、12. 5ml pH值为8. 0的Imol Tris-HCl缓冲液、65mmol DTT和水组成；所述TCA的丙酮溶液中，TCA的浓度为10% (质量百分含量)；所述浸泡的温度 为-20°C，所述浸泡的时间为2小时。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述待提取物质为麦类作物的去胚 后的种子；所述麦类作物为小麦、大麦或黑麦。
全文摘要
本发明公开了一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法。该分离麦谷蛋白亚基的方法，包括如下步骤将待分离的麦谷蛋白进行双向电泳，得到分离的麦谷蛋白亚基；所述双向电泳中，进行电泳的上样液是用含有DTT的水合上样缓冲液溶解所述待分离的麦谷蛋白得到的。本发明方法具体的提供了适合双向电泳的低分子量麦谷蛋白的提取和适合质谱鉴定的蛋白质胶内酶切的技术方案，解决了小麦低分子量麦谷蛋白亚基的分离鉴定技术问题，也为同类型新的蛋白的分离鉴定提供了一种切实有效的方法，因此，本发明方法适合于推广应用。
文档编号C07K1/14GK101891799SQ201010211730
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月21日 优先权日2010年6月21日
发明者刘冬成, 孙家柱, 张爱民, 张相岐, 张肖飞, 王道文, 郭小丽, 阳文龙 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所