专利名称：帕曲星a的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种帕曲星A的分离方法。
背景技术：
1971年Tiberio Bruzzese等从土壤样品中分离纯化得到一株链霉菌属的生金链霉菌(Str印tomyces aureofaciens)，并在该菌的代谢产物中分离出了一种七烯大环内酯类抗生素，命名为帕曲星(partricin)。帕曲星是一种抗真菌和抗原虫的高效药，通过抑制真菌细胞细胞膜的合成实现抑菌作用，尤其对白色念珠菌具有极高的抑菌活性。帕曲星主要包含两种组分，帕曲星A和帕曲星B。生金链霉菌发酵产物中，除产物帕曲星外，还同时生成大量的四环素和金霉素等其他种类的抗生素及杂质，成分十分复杂，因此从发酵产物中提取帕曲星A的工艺繁琐。目前，现有技术中对帕曲星A的分离纯化主要还是采用传统的有机溶剂萃取和活性炭吸附等方法。美国专利3，773，925中阐述了帕曲星A的分离纯化过程。主要利用的是帕曲星A 在不同溶剂中溶解度的差异，多步骤的反复萃取后，再利用活性炭吸附进行富集纯化。该方法的缺点是采用了大量的溶剂，对环境造成很大的压力，且步骤中不可避免的需要采用活性炭，而活性炭的吸附性能并不是很稳定，即使同一个生产厂家生产的活性炭，生产批次的不同，因而会造成最终产品的质量不稳定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有分离帕曲星A方法使用大量溶剂对环境造成很大的压力，步骤中不可避免的需要采用活性炭，而活性炭的吸附性能不稳定会造成最终产品的质量不稳定的缺陷，提供了一种操作简单，成本较低，不会产生过多溶剂造成环境压力，产品质量稳定，适合大规模工业化生产的帕曲星A的分离方法。本发明的帕曲星A的分离方法包括如下步骤(1)将含帕曲星发酵液调pH为3 5，静置并过滤，将滤饼用极性有机溶剂浸泡， 之后过滤取滤液；(2)将滤液调pH为9 10，之后于25°C 35°C下浓缩至溶液含水体积百分比 30% 35%，静置，过滤得帕曲星粗品；(3)将帕曲星粗品溶解于含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，先用含水体积百分比18% 23%的甲醇溶液洗脱除杂，然后再用含水体积百分比13% 17%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度>80%的帕曲星A洗脱液；(4)将收集的帕曲星A洗脱液浓缩至溶液为含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液，再上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，用含水体积百分比17% 19%的甲醇溶液洗脱除杂，再用含水体积百分比10% 14%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集洗脱液即可。
下面，进一步的对本发明的帕曲星A的分离方法进行详细介绍(1)将含帕曲星发酵液调pH为3 5，静置并过滤，将滤饼用极性有机溶剂浸泡， 之后过滤取滤液。其中，所述的含帕曲星发酵液为本领域常规制备帕曲星的微生物菌发酵液，一般由生金链霉菌Mi^ptomyces aureofaciens经过本领域常规方法发酵培养获得。所述的生金链霉菌具体菌种没有特殊限定，常规能够生产帕曲星的菌种均可使用，如生金链霉菌 Streptomyces aureofaciens NRRL 3878等。其中，所述的生金链霉菌经培养发酵获得含帕曲星发酵液具体菌种不受限定是因为帕曲星是生金链霉菌Mi^ptomyces aureofaciens的次级代谢产物，不同的具体菌株虽然在帕曲星的产量、杂质的比例上有所不同，但发酵液的主要成分相对固定，因此不同具体菌种生金链霉菌Sti^ptomyces aureofaciens制备的发酵液均适用本发明方法。其中，所述的调pH试剂为本领域常规调pH的酸，较佳的为草酸和/或盐酸，更佳的为草酸。其中，所述的静置的作用为充分除去发酵液中的活菌，所述的静置的时间较佳的为> 2小时，更佳的为2 4小时。其中，所述的极性有机溶剂为本领域常规所述极性有机溶剂，较佳的为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或多种，更佳的为甲醇。其中，所述的极性有机溶剂的用量较佳的为2 4倍滤饼体积。其中，所述的浸泡的作用是充分提取滤饼中的帕曲星。所述的浸泡的时间较佳的为> 2小时，更佳的为2 4小时。其中，所述的浸泡以及过滤操作较佳地还可以重复操作1 2次，之后合并滤液。(2)将滤液调pH为9 10，之后于25°C 35°C下浓缩至溶液含水体积百分比 30% ；35%，静置，过滤得帕曲星粗品。 其中，所述的调pH试剂为本领域常规调pH的碱，较佳的为氢氧化钠和/或氢氧化钾。其中，由于步骤(1)中的滤饼含水，导致步骤O)中的滤液中含水量也较大，因而需要进一步浓缩。所述的浓缩的温度较佳的为30°C。所述的浓缩的终点较佳的为滤液中的水含有体积百分比33%。其中，所述的静置作用为使帕曲星充分析出。所述的静置的温度较佳的为0°C 5°C，更佳的为4°C。所述的静置的时间较佳的为> M小时，更佳的为M小时。(3)将帕曲星粗品溶解于含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，先用含水体积百分比18% 23%的甲醇溶液洗脱除杂，然后再用含水体积百分比13% 17%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度彡80% (HPLC纯度)的帕曲星A洗脱液。其中，所述的溶解帕曲星粗品甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比25 %的甲醇溶液。其中，所述的帕曲星粗品与甲醇溶液的用量比较佳的为7mg/mL 9mg/mL，更佳的为 8mg/mL。其中，所述的苯乙烯大孔反相吸附树脂柱的型号较佳的为匪100、HZ-803或微球
其中，所述的帕曲星粗品的上样量较佳的为彡lOmg/mL树脂。其中，所述的帕曲星粗品的上样至苯乙烯大孔反相吸附树脂柱的吸附流速较佳的为0. 2CV/h 0. 3CV/h，其中所述的CV为本领域常规计量术语，全称为树脂柱体积，英文名 column volume。其中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比20 %的甲醇溶液。其中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的用量较佳的为2. 5CV 4CV，更佳的为3CV。其中，所述的洗脱帕曲星A的甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比15%的甲醇溶液。其中，所述的纯度> 80 %的帕曲星A洗脱液的检测可按本领域常规通过高效液相色谱检测确定。所述的高效液相色谱检测可按本领域常规方法。(4)将收集的帕曲星A洗脱液浓缩至溶液为含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液，再上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，用含水体积百分比17% 19%的甲醇溶液洗脱除杂，再用含水体积百分比10% 14%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集洗脱液即可。其中，所述的浓缩的温度较佳的为25°C 35°C，更佳的为30°C。其中，所述的浓缩后的甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比25%的甲醇溶液。其中，所述的苯乙烯大孔反相吸附树脂柱上样量及吸附流速如前所述。其中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比18%的甲醇溶液。其中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的用量较佳的为1. 5CV 3CV，更佳的为2CV。其中，所述的洗脱帕曲星A的甲醇溶液的浓度较佳的为含水体积百分比12%的甲醇溶液。其中，所述的收集洗脱液较佳的为帕曲星A纯度>90%，检测可按本领域常规通过高效液相色谱检测确定。所述的高效液相色谱检测可按本领域常规方法。本发明中，所述的步骤(4)收集的洗脱液进一步除去溶剂，即获得干燥成品。本发明中，涉及使用的甲醇溶液均可回收利用。本发明所用试剂和原料均市售可得。在符合本领域常识的基础上，本发明中上述的各技术特征优选可以任意组合得到本发明较佳实例。本发明的积极进步效果在于本发明帕曲星A的分离方法操作简单，成本较低，不会产生过多溶剂造成环境压力，产品质量稳定，适合大规模工业化生产，分离得到的产品的帕曲星A纯度达93%以上。
具体实施例方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下述实施例中，检测帕曲星A的高效液相色谱检测条件为色谱柱Agilent C185um 250X4. 6mm，流动相为乙腈醋酸铵水溶液(0. 05mol/L,pH5. 5)体积比值为40 60， 温度:35°C，流速 0. 8mL/min,波长 378nm。下述实施例中，苯乙烯大孔反相吸附树脂来源为匪100 苏州纳微科技有限公司HZ803 上海华震树脂公司微球1# 上海华震树脂公司下述实施例中的百分比，除特殊说明外，均为体积百分比。制备实施例制备帕曲星发酵液，使用的菌种为生金链霉菌Mi^ptomyces aureofaciens NRRL 3878 (来源美国农业研究菌种保藏中心)。具体发酵培养条件为1、斜面培养培养7天；培养基(g/L)可溶性淀粉10. 0，MgSO4 · 7H20 1. 0，NaCl 1.0，(MM)2SO4 2.0， FeSO4 · 7H20 0. 001, KzHPO4 1· 0，CaCO3 2. 0，MnCl2 · 7Η20 0. 0012、种子培养 ，28h,摇床转速240rpm ；培养基(g/L)葡萄糖10. 0、蛋白胨10. 0、酵母粉5. 03、发酵培养121°C灭菌20min，接种量10 %，摇瓶装量100mL/750mL，置于恒温旋转式摇床MOrpm摇发酵7天得到最终发酵液；培养基(g/L)葡萄糖40. 0、工业淀粉20. 0、冷黄豆粉20. 0、蚕蛹粉10. 0、酵母粉 2. 0、蛋白胨 2. 0、NaCl 5.0。实施例1 15为生金链霉菌Sti^ptomyces aureofaciens NRRL 3878发酵培养制得的帕曲星发酵液。实施例1将发酵得到的含帕曲星A 543 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为83.4%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为94. 2%的帕曲星A。实施例2将发酵得到的含帕曲星A 528yg/ml的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积丙酮浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出，然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82. 3%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 6%的帕曲星A。实施例3将发酵得到的含帕曲星A 501 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用2倍体积无水乙醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82.9%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 9%的帕曲星A。实施例4将发酵得到的含帕曲星A 513yg/ml的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水30 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82.8%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 9%的帕曲星A。实施例5将发酵得到的含帕曲星A 528yg/ml的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水35 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为81.4%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 1 %的帕曲星A。实施例6将发酵得到的含帕曲星A 567 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过大孔反相吸附树脂HZ-803，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为81.6%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过大孔反相吸附树脂HZ-803，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 3%的帕曲星A。实施例7将发酵得到的含帕曲星A 532 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过大孔反相吸附树脂微球1#，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82.5%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过大孔反相吸附树脂微球1#，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 9%的帕曲星A。实施例8将发酵得到的含帕曲星A 532 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到4. 0，静置池后抽滤，将滤饼用3倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 8，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含27%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82. 3%。
将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 8%的帕曲星A。实施例9将发酵得到的含帕曲星A 493 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到4. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用3倍体积甲醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 8，在30°C下缓慢浓缩至含水33%，此时有一定量的固体析出，然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含30%水的甲醇溶液溶解，并将出现少量的沉淀，过滤掉，滤液通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20% 水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A(HPLC检测)，混合后纯度为81. 6%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 1 %的帕曲星A。实施例10将发酵得到的含帕曲星A 511 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到5. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用3倍体积甲醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 4，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含13 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为83. 1% ο将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 9%的帕曲星A实施例11将发酵得到的含帕曲星A 521 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到5. 0，静置2h后抽滤，将滤饼用3倍体积甲醇浸泡2h，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 4，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含17 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82. 3%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 4%的帕曲星A。
实施例12将发酵得到的含帕曲星A 507 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调PH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33%，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为83. 3%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含10%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 7%的帕曲星A。实施例13将发酵得到的含帕曲星A 548 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 0，静置池后抽滤，将滤饼用2倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 0，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82.8%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含14%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 4%的帕曲星A。实施例14将含帕曲星A 514 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 5，静置池后抽滤，将滤饼用 2. 5倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。将滤液调pH到9. 3，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出， 然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15 %水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80 %的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82.6%。将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含12%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 7%的帕曲星A。实施例15 将含帕曲星A573 μ g/mL的发酵液用草酸调pH到3. 5，静置池后抽滤，将滤饼用2
倍体积甲醇浸泡池，浸泡后过滤取滤液，并将滤饼重复操作一次，合并两次滤液。 将滤液调pH到9. 5，在30°C下缓慢浓缩至含水33 %，此时有一定量的固体析出，然后置于4°C冰箱静置24h使帕曲星充分从母液中析出，将析出物抽滤收集后用含25%水的甲醇溶液溶解，并通过匪100树脂，吸附后先用3CV含20%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含15%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于80%的帕曲星A (HPLC检测)，混合后纯度为82. 7%。 将帕曲星A收集液浓缩至溶液浓度含25%水的甲醇溶液，之后再次通过匪100树月旨，先用2CV含18%水的甲醇溶液预洗除杂，再用含14%水的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度大于90%的帕曲星A流出液(HPLC检测)，混合后得到纯度为93. 8%的帕曲星A。
权利要求
1.一种帕曲星A的分离方法，其特征在于其包括如下步骤(1)将含帕曲星发酵液调PH为3 5，静置并过滤，将滤饼用极性有机溶剂浸泡，之后过滤取滤液；(2)将滤液调pH为9 10，之后于25°C 35°C下浓缩至溶液含水体积百分比30% 35%，静置，过滤得帕曲星粗品；(3)将帕曲星粗品溶解于含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液，之后上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，先用含水体积百分比18% 23%的甲醇溶液洗脱除杂，然后再用含水体积百分比13% 17%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度彡80%的帕曲星A洗脱液；(4)将收集的帕曲星A洗脱液浓缩至溶液为含水体积百分比25% 30%的甲醇溶液， 再上样苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，用含水体积百分比17% 19%的甲醇溶液洗脱除杂， 再用含水体积百分比10% 14%的甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集洗脱液即可。
2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于所述的含帕曲星发酵液由生金链霉菌 Streptomyces aureofaciens经过本领域常规方法发酵培养获得。
3.如权利要求2所述的分离方法，其特征在于所述的生金链霉菌为生金链霉菌 Streptomyces aureofaciens NRRL 3878。
4.如权利要求1 3任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的调 PH试剂为草酸和/或盐酸；和/或所述的静置的时间为> 2小时，较佳的为2 4小时。
5.如权利要求1 4任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇和丙酮中的一种或多种；和/或所述的极性有机溶剂的用量为2 4倍滤饼体积；和/或所述的浸泡的时间为> 2小时，较佳的为2 4小时；和/或所述的浸泡以及过滤操作还重复操作1 2次，之后合并滤液。
6.如权利要求1 5任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述的调 PH试剂为氢氧化钠和/或氢氧化钾；和/或所述的浓缩的温度为30°C ；和/或所述的浓缩的终点为滤液中水的含有体积百分比33% ；和/或所述的静置的温度为0°C 5°C，较佳的为4°C ；和/或所述的静置的时间为> 24小时，较佳的为24小时。
7.如权利要求1 6任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述的溶解帕曲星粗品甲醇溶液的浓度为含水体积百分比25%的甲醇溶液；和/或所述的帕曲星粗品与甲醇溶液的用量比为7mg/mL 9mg/mL，较佳的为8mg/mL ；和/或所述的苯乙烯大孔反相吸附树脂柱的型号为匪100、HZ-803或微球1# ；和/或所述的帕曲星粗品的上样量为 (10mg/mL树脂；和/或所述的帕曲星粗品的上样至苯乙烯大孔反相吸附树脂柱的吸附流速为 0. 2CV/h 0. 3CV/h0
8.如权利要求1 7任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(3)中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的浓度为含水体积百分比20 %的甲醇溶液；和/或所述的洗脱除杂的甲醇溶液的用量为2. 5CV 4CV，较佳的为3CV ；和/或所述的洗脱帕曲星A的甲醇溶液的浓度为含水体积百分比15%的甲醇溶液；和/或所述的纯度>80%的帕曲星A洗脱液的检测通过高效液相色谱检测确定。
9.如权利要求1 8任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述的浓缩的温度为25°C 35°C，较佳的为30°C ；和/或所述的浓缩后的甲醇溶液的浓度为含水体积百分比25%的甲醇溶液；和/或所述的上样量为彡lOmg/mL树脂；和/或所述的上样的吸附流速为0. 2CV/h 0. 3CV/h。
10.如权利要求1 9任一项所述的分离方法，其特征在于所述步骤(4)中，所述的洗脱除杂的甲醇溶液的浓度为含水体积百分比18%的甲醇溶液；和/或所述的洗脱除杂的甲醇溶液的用量为1. 5CV 3CV，较佳的为2CV ；和/或所述的洗脱帕曲星A的甲醇溶液的浓度为含水体积百分比12%的甲醇溶液；和/或所述的收集洗脱液中帕曲星A纯度>90%。
全文摘要
本发明公开帕曲星A的分离方法，包括如下步骤将含帕曲星发酵液调pH，静置并过滤，将滤饼用极性有机溶剂浸泡，过滤取滤液；将滤液调pH，25℃～35℃下浓缩至含水30％～35％，静置、过滤得帕曲星粗品；将粗品溶于含水25％～30％甲醇溶液，上苯乙烯大孔反相吸附树脂柱，用含水18％～23％甲醇溶液洗脱除杂，再用含水13％～17％甲醇溶液洗脱帕曲星A，收集纯度≥80％的帕曲星A洗脱液；将收集的帕曲星A洗脱液浓缩至为含水25％～30％甲醇溶液，再上柱，用含水17％～19％甲醇溶液洗脱除杂，再用含水10％～14％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液即可；百分比为体积百分比。该方法操作简单，成本较低，溶剂少，产品质量稳定，适合大规模工业化生产，分离得到的产品的帕曲星A纯度达93％以上。
文档编号C07H17/08GK102453062SQ20101051433
公开日2012年5月16日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者刘海英, 卢亮, 李继安 申请人:上海医药工业研究院