专利名称：缀合蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰的蛋白质。特别地，本发明涉及与疏水侧基缀合的蛋白质例如凝血因子。此外，本发明涉及这类分子的用途以及用于产生这类分子的方法。
背景技术：
A型血友病是一种遗传性出血病症，由凝血因子VIII (FVIII)活性缺乏或功能障碍引起。临床表现不在于初期止血一血凝块形成正常发生一而在于因缺乏相继的凝血酶形成导致血块不稳定。通过静脉内注射从血液分离或重组产生的凝血因子FVIII来治疗该疾病。具有抑制物的A型血友病患者可通过按需给予因子Vila (FVIIa)来治疗。B型血友病由凝血因子IX (FIX)活性缺乏或功能障碍引起，可通过按需给予因子IX (FIX)治疗患者。现行治疗建议从传统的按需治疗转向预防。与冯维勒布兰德因子(von Willebrandt factor)结合的内源性FVIII的循环半衰期为12-14小时，因此一周进行几次预防性治疗，从而使患者获得实际上无症状的生活。内源性因子VII的循环半衰期小于2小时。内源性因子IX的循环半衰期为19-24小时。对于许多人，尤其儿童和未成年人，静脉内给药与明显的不方便和/或疼痛有关。因此本领域需要延长重组凝血因子的循环半衰期。同样地，本领域需要以部位定向方式延长多种其它治疗性蛋白质和肽的半衰期，优选产生相对均质和定义明确的产物。已将多种方法应用于开发总体上循环半衰期显著延长的凝血因子和药用蛋白质。许多这类方法涉及与亲水聚合物例如PEG (聚乙二醇)缀合。一方面，由于这类基团可在体内完全降解的事实，与疏水侧链缀合的确是有吸引力的方法。另一方面，蛋白质与一个或多个定义明确的疏水部分缀合至今都未成为用于延长相对大的蛋白质(包括凝血因子例如FVIII)的半衰期的有吸引力方法。实际上，这种疏水部分与蛋白质缀合不应视为实际可行的方法，这是因为1)大的蛋白质例如FVIII只在缺乏有机溶剂的水性缓冲液中稳定；2)亲脂性部分(例如脂肪酸)在这种水性缓冲液中不溶解；3)难以确定相对小的亲脂性部分的连接可引起大得多的蛋白质(例如FVIII)半衰期的任何显著延长；4)亲脂性部分当与通常是蛋白质亲水表面连接时，由于聚集或在能量上是有利的但是破坏性的解折叠所致，可能干扰其稳定性；和5)可以以导致生物活性降低的类似方式，干扰蛋白质与其天然结合配偶体的相互作用。发明概述
本发明涉及重组蛋白质分子，例如抗体的抗原结合片段、FVII、FVIII和FIX，其中所述蛋白质分子通过唾液酸与至少一个疏水侧基共价缀合。本发明此外还涉及用于制备这类缀合物的方法以及这类缀合物的用途。这类缀合物具有改进的循环半衰期并且的确优选具有相对均质的结构。此外，缀合物保持生物活性，并优选在不使用任何有机溶剂的情况下产生。然而，可采用这样的制备这类分子的方法其中所述方法包括使用痕量有机溶剂。发明描述 定义蛋白质
本发明范围内的蛋白质和肽优选为适于治疗性治疗的蛋白质/肽。这类蛋白质包括但不限于血清蛋白质例如血液凝固凝血因子、血红蛋白、免疫球蛋白、抗体、抗体的抗原结合片段(例如Fab片段)、细胞因子(例如白介素、α干扰素、β干扰素和Y干扰素)、TNF受体家族的成员(例如DR3、TNF1R、TNF2R、⑶27和⑶30)、集落刺激因子(包括粒细胞集落刺激因子)、血小板衍生生长因子和磷脂酶活化蛋白(PUP)。其它蛋白质包括胰岛素、GLP-1、GLP-2、植物蛋白质(例如凝集素和蓖麻毒蛋白)、肿瘤坏死因子和相关等位基因、肿瘤坏死因子受体的可溶形式、白介素受体和白介素受体的可溶形式、人生长激素、生长因子(例如组织生长因子，例如TGFa或TGFp和表皮生长因子)、激素、生长调节素、红细胞生成素、色素激素、下丘脑释放因子、抗利尿激素、催乳素、绒毛膜促性腺激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、组织纤溶酶原激活物等。目标免疫球蛋白包括IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及其片段。本发明的蛋白质可在结构上类似于天然蛋白质，可通过以下方式衍生自天然蛋白 质将一个或多个氨基酸加入天然蛋白质的C端和N端任一端或两端、在天然氨基酸序列的一个或多个不同位点处取代一个或多个氨基酸、在天然蛋白质的任一端或两端或者在氨基酸序列中的一个或几个位点处缺失一个或多个氨基酸、或者在天然氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸。本文所用术语“抗述”、“单克隆抗体”和“mAb”，意欲指具有与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子及其片段。全长抗体包含4条多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链通过二硫键互相连接。每条重链由重链可变区(本文简写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文简写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由I个结构域CL组成。还可将VH和VL区进一步细分为超变区，称为互补决定区(CDR)，其散布有更保守的称为构架区(FR)的区域。每条VH和VL由3个⑶R和4个FR组成，按下列顺序从氨基端至羧基端排列FRUDR1、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3、FR4。全长抗体通常是双价或二价的，即它具有用两个“臂”与抗原结合的能力。相比之下，本发明的单价抗体只包含一个对抗原有特异性的结合部位。“Fab区”/ “Fab结构域”/ “Fab片段”含有限定抗体可结合的具体靶标的可变区段(variable section)。Fab片段是本发明的单特异性/单价抗体的实例。与未经翻译后修饰的Fab片段相比，本发明的缀合Fab片段的循环半衰期通常显著延长。因此，抗体的Fab片段和其它抗原结合片段特别可用于调节免疫系统，从而治疗例如癌症和免疫相关病症，例如自身炎性疾病(包括银屑病、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’ s disease)、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(Crohn’s disease)、溃疡性结肠炎、肠易激综合征、多发性硬化、类风湿性关节炎(RA)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、全身性硬皮病、银屑病关节炎、骨关节炎、特应性皮炎、白斑、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征(Sj5ogrens’ssyndrome)、自身免疫性肾炎、肺出血_肾炎综合征(Goodpasture，s syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、变态反应、哮喘和其它自身免疫病)。本发明的单价抗体的实例包括Fab片段；由VL、VH、CL和CH I结构域组成的单价片段；包含在铰链区例如通过二硫键连接的2个Fab片段的二价片段，其中这些Fab片段中只有一个对其抗原有特异性；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的 VL 和 VH 结构域组成的 Fv 片段，(V) dAb 片段(Ward 等(1989) Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)分离的互补决定区(CDR);和(V)对其抗原是单价的双特异性抗体。凝血因子凝血因子参与继发件血块(secondary clot)的形成。凝血因子包括下列因子vWF、因子I、因子II (凝血酶原)、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII和因子XIII。本发明的凝血因子变体具有凝血因子活性，即分子活性为天然凝血因子活性的至少25%，优选为天然凝血因子活性的至少50%、更优选至少75%、最优选至少90%。因子VII (FVII)是主要在肝脏中产生的糖蛋白。成熟蛋白质包括406个氨基酸残基，并且由通过同源性限定的4个结构域组成。有一个N端Gla结构域，接着是2个表皮生长因子(EGF)样结构域和C端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII作为单链分子在血浆中循环。在活化FVII (FVIIa)激活时，该分子在残基Argl52和Ilel53之间被切割，产生通过二硫键结合在一起的二链蛋白质。轻链含有Gla和EGF样结构域，而重链是蛋白酶结构域。FVIIa需要与其细胞表面辅因子组织因子结合才具有生物活性。 因子VII (a)可以是血浆来源的或采用众所周知的生产和纯化方法重组产生的。糖基化、Y-羧化和其它翻译后修饰的程度和位置可随所选择的宿主细胞及其生长条件而变化。术语“因子VII多肽”可指酶原以及因子VII的活化形式。术语“因子VII(a)多肽”在本文是指野生型因子VIIa分子以及FVII (a)变体、FVII (a)衍生物和FVII (a)缀合物。与野生型人因子VIIa相比，这类变体、衍生物和缀合物可具有基本相同的或改进的生物活性。本发明的“FVII/FVII变体”包含具有SEQ ID NO: I序列的因子FVII，其中母蛋白质(parent protein)的一个或多个氨基酸被另一个氨基酸取代和/或其中母蛋白质的一个或多个氨基酸缺失和/或其中一个或多个氨基酸插入蛋白质中和/或其中一个或多个氨基酸添加到母蛋白质中。此外，FVII变体包含具有与野生型因子VIIa相比基本相同或改进生物活性的FVII多肽，其中母肽的一个或多个氨基酸经遗传修饰和/或化学修饰和/或酶修饰，例如通过烷基化、糖基化、聚乙二醇化、酰化、酯形成、二硫键形成或酰胺形成。SEQ ID NO. I :野生型人凝血因子VII
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Y:表示Y-羧化Glu ( ’ )残基。可如下测定FVIIa缀合物活性
凝血酶原和FX用抑制剂的混合物处理，以中和痕量的活性酶。将FX (135 nM终浓度)、凝血酶原(I. 2 μ M)、TF途径抑制剂(O. I μ g/ml)和抗凝血酶(AT，2. 5 μ M)与CaCl2(3 mM) 一起混合，并在4°C下保存过夜。将健康志愿者的外周血抽到柠檬酸盐中。按照M.Kjalke Thromb· Heamostasis 78,1202-1208,1997中所述,通过密度梯度离心和凝胶过滤分离血小板，并通过与50 μ g/ml凝血酶受体激动剂肽(SFLLRN) —起在37°C下温育15分钟将其激活。将等分试样的血小板悬液转移到TruCount管(Becton Dickinson)中，按照生产商所述，通过使用突光珠作为标准品，在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)上测定血小板密度。使用约100，000个/ μ I的最终血小板密度。将因子V (终浓度7 μ g/ml)加入蛋白质/Ca2+混合物中。然后加入FVIIa缀合物(50 nM)，接着加入血小板，得到200μ I的最终体积。在定时的间隔，将等分试样的10 μ I转移到90 μ I O. 5mM ChromozymTH (Roche Molecular Biochemicals) /20 mM Hepes (pH 7. 4)(含有 150 mM NaCl> I mg/ml BSA> I mM EDTA 和 50 μ M Pefabloc Xa (Pentapharm, Basel))中。20 分钟后，通过加Λ 100 μ I 50%乙酸，终止底物水解，测量405 nm下的吸 光度。根据凝血酶标准曲线计算凝血酶浓度。用于表征FVIIa活性的其它测定可参见WO 07031559或Person，/WA 98(24)13583-13588,2001和文中引述的参考文献。因子VIII分子FVIII/因子VIII是一种大的复合糖蛋白，主要通过肝细胞产生。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，并含有由同源性限定的几个不同的结构域。有3个A结构域、一个独特的B结构域和2个C结构域。结构域顺序可列为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII作为在B-A3边界被分隔开的2条链在血浆中循环。该链通过二价金属离子束缚连接。A1-A2-B链称为重链(HC)，而A3-C1-C2称为轻链(LC)。内源性因子VIII分子在体内作为具有各种大小的B结构域的分子库(pool)循环。体内可能发生的是逐渐地酶促去除B结构域，产生具有各种大小的B结构域的分子库。一般认为，在第740位的切割(由其去除B结构域的最后部分)连同凝血酶活化一起发生。然而，不能排除这种可能性，其中例如第740位的切割位点已受损的因子VIII变体可能有活性。本文所用的“因子VIII”或“FVIII”是指这样的人血浆糖蛋白其是固有凝血途径的成员且是血液凝固所必需的。“天然FVIII”是如SEQ ID NO. 2所示的全长人FVIII分子(氨基酸1-2332)。B结构域跨越SEQ ID NO 2中的氨基酸741-1648。SEQ ID NO 2
权利要求
1.一种重组蛋白质，其中所述蛋白质与至少一个疏水侧基共价缀合，其中所述疏水侧基通过唾液酸与所述蛋白质连接。
2.权利要求I的蛋白质，其中所述蛋白质是凝血因子。
3.权利要求2的凝血因子，其中所述凝血因子是FVII分子。
4.权利要求2的凝血因子，其中所述凝血因子是FVIII分子。
5.权利要求2的凝血因子，其中所述凝血因子是FIX分子。
6.权利要求I的重组蛋白质，其中所述蛋白质是抗体的抗原结合片段。
7.前述权利要求中任一项的重组蛋白质，其中所述疏水侧基选自以下一种或多种月旨肪酸和脂肪二酸。
8.权利要求4的FVIII分子，其中所述FVIII分子的vWF结合能力降低。
9.权利要求4和权利要求8中任一项的FVIII分子，其中所述疏水侧基与O-聚糖通过唾液酸共价缀合，其中所述O-聚糖位于截短的B结构域中，且其中因子VIII活化导致所述疏水侧基脱去。
10.权利要求4和8-9中任一项的FVIII分子，其中所述FVIII分子还与至少一种亲水聚合物缀合。
11.一种制备权利要求1-10中任一项的分子的方法，其中所述方法包括通过唾液酸转移酶催化的反应使疏水侧基与重组蛋白质连接。
12.权利要求1-10中任一项的分子作为药物的用途。
13.权利要求6的抗体的抗原结合片段用于治疗炎性疾病的用途。
14.权利要求1-5和7-10中任一项的分子用于治疗血友病的用途。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1-10中任一项的分子。
全文摘要
本发明涉及经修饰的治疗性蛋白质，例如凝血因子。特别地，本发明涉及包含疏水侧基的缀合因子VIII分子，例如FVII、FVIII或FIX。
文档编号C07K14/755GK102812039SQ201180009866
公开日2012年12月5日 申请日期2011年2月9日 优先权日2010年2月16日
发明者J.布查特, C.贝伦斯 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司