自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法
【专利摘要】一种自卵黄萃取γ-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括：(A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品及一无机盐类；(B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及(C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一高纯度的γ-卵黄球蛋白；其中，该缓冲盐类溶液的酸碱值(pH)于4.6至5.4的范围内，且该缓冲盐类溶液的浓度于0.05-0.15M的范围内，及该无机盐类的饱和度为30％至60％。
【专利说明】自卵黄萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法【技术领域】
[0001]本发明系关于一种自卵黄萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，尤其指一种可简单、快速地萃取出高纯度Y-卵黄球蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]在脊椎动物的免疫系统遭遇外来特定抗原时，常会诱发体内产生多种辨识该抗原不同表位(epitopes)的抗体分子,这些抗体分子的集合统称为多株抗体(polyclonalantibodies);由于抗体与其辨识的抗原表位间具有强结合力与高专一性，故常被应用于特定抗原分子的鉴定、分析与纯化等用途。目前于基础研究、一般检验、与医药治疗上，多株抗体已成为不可或缺的工具之一。
[0003]由于动物体内被诱发表现的抗体多分布于血液之中，故多株抗体的生产上，通常会选用中、大体型的兔和羊等动物，伴随的缺点在于:饲养动物的空间需求与饲养耗费较高，且哺乳动物彼此间的亲源关系较接近，不适合用来制造哺乳动物的保守性蛋白质(conserved proteins)的抗体。此外,对动物重复进行侵入性抽血的方式是常被动物福利团体争议的行为，因为动物可能会遭受痛苦、较易被感染而造成身体虚弱甚至死亡。
[0004]鸡只(Gal Ius gal lus)受到免疫刺激后产生的抗体分子以Y -卵黄球蛋白(Y-livetin, IgY)为主，IgY不仅是鸡血中含量最丰富的抗体分子，也是卵黄中唯一存在的抗体种类；又，鸡只的饲养成本较低，产蛋效率又高，且每颗卵黄的IgY含量可高达约lOOmg，甚至比鸡血中的IgY浓度更高。此外，相较于哺乳类之间，鸟类与哺乳类有较大的亲缘差距，故成功产生对应哺乳动物保守性蛋白质的抗体的机会较高；又IgY与哺乳类的免疫球蛋白G (Immunoglobulin G, IgG)分子在Fe部位的序列上有显著差异,不会与哺乳类动物的补体、类风湿性因子、及Fe受体等成分发生作用，故可降低分析哺乳动物样品(尤其是人体样品)时的伪阳性反应。因此，利用鸡只卵黄来生产IgY多株抗体不但生产成本较低、产量较高且稳定、可以对应的哺乳动物抗原种类较多元、分析应用时的伪阳性结果较少、更可免去对动物抽血的需求,而减少社会团体的不必要争议。
[0005]但由于卵黄中含有丰富的脂质(高达34% )和其他多种蛋白质，使IgY的纯化不易，导致目前IgY的应用仍不够普遍。再者，因IgY与IgG在Fe部位的胺基酸序列差异，也使得广泛应用于纯化IgG的A/G蛋白质管柱并无法被用来吸附分离IgY。现有的卵黄IgY萃取方法，皆以去脂步骤开始，包括水稀法、PEG沉淀法、氯仿沉淀法、胶液沉淀法等；随后再由盐析、或过滤、或离子交换管柱、或特定吸附管柱、或前述方法的不同组合将IgY进一步纯化；过程步骤不仅繁琐且耗时冗长。
[0006]因此，目前亟需发展一种简单快速、便宜有效的卵黄IgY分离方法，以获得回收量高且纯度良好的IgY样品。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种自卵黄中萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，以简单快速、成本低廉的方法获得回收量高且纯度良好的IgY样品。
[0008] 为实现上述目的，本发明提供的自卵黄中萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括:
[0009]A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类；
[0010]B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及
[0011]C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一 Y-卵黄球蛋白；
[0012]其中，该缓冲盐类溶液的pH值为4.6至5.4范围内，且该缓冲盐类溶液的浓度为0.05M至0.15M范围内，及该无机盐类的饱和度为30%至60%。
[0013]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄。
[0014]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内。
[0015]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液。
[0016]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液。
[0017]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，于步骤B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品。
[0018]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该搅拌的预定时间为25分钟以上。
[0019]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该无机盐类为硫酸铵。
[0020]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该Y-卵黄球蛋白的纯度为50%至95%。
[0021]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该Y-卵黄球蛋白的产率为45%至98%。
[0022]所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄；该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M的范围内；该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液；于步骤(B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品；该搅拌的预定时间为25分钟或以上；且该无机盐类为硫酸铵。
[0023]本发明的方法不仅步骤最为简单、快速，卵黄IgY的回收率与纯度亦佳，试剂成本更是低廉，且无需使用任何有机溶剂，较符合环保要求。由此，本发明除了可提供至一般实验室的IgY萃取使用外，亦可被应用于产业界的大规模IgY生产目的。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是本发明实施例1的SDS胶体电泳分析结果图。
[0025]图2是本发明实施例2的卵黄粗萃液的外观照片。
[0026]图3是本发明实施例2的SDS胶体电泳分析结果图。
[0027]图4是本发明实施例3的酸碱值变化结果图。
[0028]图5是本发明实施例4的SDS胶体电泳分析结果图。
【具体实施方式】[0029]本发明提供一种自卵黄中萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括:
[0030] (A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类；
[0031](B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及
[0032](C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一纯度提升的Y -卵黄球蛋白样品。
[0033]其中，该卵黄样品无特别限制，可视实验所需或材料取得的便利性而选用；较佳可使用鸡蛋的卵黄，其IgY含量高达约lOOmg，且鸡蛋的取得相当便利。
[0034]在本发明的萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法中，该缓冲盐类溶液的浓度是于0.05M至0.15M的范围内，较佳地是于0.08M至0.12M的范围内。再者，该缓冲盐类溶液不受限，可为酸解离常数(PKa)值约为5.0的醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液；较佳可使用醋酸钠溶液。此外，该缓冲盐类溶液的酸碱值(PH)为4.6至5.4的范围内，可达到最佳的去脂效果。与公知的酸水相比，该缓冲盐类溶液具有较佳的酸碱缓冲效率，可减少去脂作用所需的时间，提升萃取Y-卵黄球蛋白的时效，亦可省去实验期间测量与调整PH的步骤，进而减少电极的去蛋白操作次数以延长其使用寿命。
[0035]于步骤⑶中，该缓冲盐类溶液较佳是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品，然而此稀释倍率可依其他实验条件而做适当地调整；若稀释倍率过高，后续加工程序繁复，会造成较高的成本耗费。并且，该搅拌的预定时间可为25分钟或以上，即此步骤(B)的搅拌时间最短仅需25分钟，即可完成去脂作用。
[0036]此外，该无机盐类可使用如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等公知盐类，较佳可选用硫酸铵；该无机盐类吸引大量水分子与该无机盐类离子水合，使蛋白质表面暴露出来的疏水性区域增加，最后蛋白质彼此间由疏水性作用力而结合，进一步自溶液中沉淀。
[0037]在该无机盐类的饱和度为30%至60%的情况下，所获得的该Y-卵黄球蛋白的纯度为50%至95%、产率为45%至98%。由此，使用饱和度近30%的该无机盐类进行盐析沉淀时，所获得的该Y-卵黄球蛋白的纯度较高(约95%)、产率适中(约45%);反之，使用饱和度近60%的该无机盐类进行盐析沉淀时，所获得的该Y-卵黄球蛋白的纯度适中(约50%)、产率较高(约98%)。故各实验室可依据Y-卵黄球蛋白的后续用途而适当地选择该无机盐类的饱和度，例如若需在短时效内快速获得高纯度的IgY样品，则可选择30%饱和度的硫酸铵添加量；若后续需要由抗原管柱来进一步纯化专一的IgY抗体，则可选择60%饱和度的硫酸铵先沉淀大部分的IgY，再进行后续专一性抗体的纯化。
[0038]由此，在本发明的萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法中，可使用浓度于0.08M至0.12M的范围内、且酸碱值(pH)于4.6至5.4的范围内的醋酸钠溶液，以8至10倍稀释倍率稀释鸡蛋的卵黄，搅拌至少25分钟后，离心以获得一上清液；再使用饱和度系为30%至60%的硫酸铵对该上清液进行盐析沉淀，以获得纯度为50%至95%、产率为45%至98%的Y-卵黄球蛋白。
[0039]与公知技术相比，现今最常用的PEG沉淀法或水稀法，均需搭配其他多重的步骤，并且耗时冗长，才能获得纯度及产率可与使用本发明方法所得的Y-卵黄球蛋白相比拟的Y -卵黄球蛋白；近期发展较快速方法是以含果胶(gum pectin)、卡拉胶(K -carrageenan)和氯化钙(CaCl2)的溶液进行卵黄的去脂作用，再搭配两次不同饱和度的硫酸铵沉淀步骤，可于5小时内从I颗卵黄中分离得到60mg、纯度达80%的IgY样品，且试剂花费仅需约5美元。然而，本发明的萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法为一仅有两步骤的萃取方法，先以醋酸钠溶液进行卵黄的去脂作用，再由硫酸铵盐析沉淀IgY样品，完成萃取仅需约两小时，即可从卵黄中分离得到高纯度及高产率的IgY，比已知技术更加快速，并且试剂花费估计仅为1.5美元。
[0040]以下实施例使用的鸡蛋来源为实验室自行饲养的白色莱亨蛋用鸡(WhiteLeghorn laying hens)。敲破蛋壳，将分离的卵黄置于不锈钢滤网中，再将滤网浸入去离子水中，以洗去卵黄表面残留的蛋白液；随后以纸巾从滤网外侧将多余的水分吸干，再用解剖针搓破卵黄膜，并以量筒收集卵黄液。以下实施例使用的鸡蛋其卵黄液体积约为13至15mL0
[0041]以下实施例使用的统计分析，对两两比较的实验结果，是以Student’ s T_test来分析其是否具显著差异；对多组比较的实验结果，则是以单因子变异数分析(ANOVA)来检测组间的差异性，并以P < 0.05做为显著的标准。
[0042][实施例1-粗萃取卵黄IgY的搅拌时间测试]
[0043][卵黄IgY的粗萃取]
[0044]取定量体积的卵黄液，加入9倍体积的0.1M，pH5.0的醋酸钠溶液，混合均匀后，置于4°C中以四种不同搅拌时间(0.5h、lh、3h、6h)搅拌，接着以12，000Xg，4°C离心30分钟，而收集到的上清液即为卵黄的粗萃液(crude extract)，量测体积后，加入NaN3至最终浓度为0.02% (w/v)，并保存于4°C中供后续分析使用。
[0045][IgY的定量分析]
[0046]以酵素连结免疫吸附法(enzyme-linkedimmuno-sorbent assay ；ELISA)来测定分析样品中的IgY含量。首先将IgY标准品(Jackson，003-000-003)与待测样品分别以0.2M硼酸盐进行一系列稀释，再各取50 μ L分注至ELISA盘(Costar Eff-01959-20)的样品孔中，经6h(室温)或隔夜(4°C)的吸附作用后，以洗涤缓冲液(wash buffer)冲洗三次，再加入180 μ L封闭缓冲液(blocking buffer)，并于室温下反应两小时或于4°C中隔夜反应；之后，以洗漆缓冲液冲洗三次，并于各孔加入50 μ L兔子抗鸡IgY(rabbit ant1-chickenIgY, Jackson 303-005-003 ；1μ g/ml)，在室温下反应2h后，以洗涤缓冲液冲洗三次，再于各孔中加入50 μ L山羊抗兔子抗体-碱性磷酸酶(goat ant1-rabbit antibody-alkalinephosphatase, Sigma A3687 ;使用10，000倍稀释液)，随后于室温下反应两小时，以洗涤缓冲液冲洗三次，各孔分别加入50 μ L ρΝΡΡ受质以进行30至60分钟的呈色反应，最后以酵素免疫分析测读仪(ELISA reader, BIO-TEK MQX220)测定吸光值(OD405_490)。利用系列稀释的IgY标准品读值，推估待测样品的IgY含量。
[0047][蛋白质定量]
[0048]由Bradford测定法来估测分析样品中的蛋白质含量，并以牛血清白蛋白(BSA，Sigma A7906)做为蛋白质标准品。先将BSA(2mg/mL)与待测样品进彳丁系列稀释，并各取50 μ L分别加注于96孔盘中，随后各孔加入200 μ L Bradford试剂，静置十分钟后，以酵素免疫分析测读仪(ELISA reader, BIO-TEK MQX220)测定OD595的读值。取BSA系列稀释样品的读值做一标准曲线，用以估算待测样品的蛋白质浓度。
[0049]如下表一所示，四种不同搅拌时间(0.5h、lh、3h、6h)的处理下，每毫升卵黄所能萃得的IgY含量(6.0~7.2mg)及蛋白质含量(21.7~24.9mg)，经ANOVA分析后(p >0.05)并无统计上的差异，表示仅需0.5小时就足够完成去脂程序。
[0050]表一
[0051]
【权利要求】
1.一种自卵黄中萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，包括: A)提供一缓冲盐类溶液、一卵黄样品、及一无机盐类； B)使用该缓冲盐类溶液稀释该卵黄样品，搅拌一预定时间后，离心以获得一上清液；以及 C)使用该无机盐类对该上清液进行盐析沉淀，以获得一Y-卵黄球蛋白； 其中，该缓冲盐类溶液的PH值为4.6至5.4范围内，且该缓冲盐类溶液的浓度为0.05M至0.15M范围内，及该无机盐类的饱和度为30%至60%。
2.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄。
3.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内。
4.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸系盐类溶液或柠檬酸系盐类溶液。
5.如权利要求4所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液。
6.如权利要求5所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，于步骤B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品。
7.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该搅拌的预定时间为25分钟以上。
8.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该无机盐类为硫酸铵。
9.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该Y-卵黄球蛋白的纯度为50%至95%。
10.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该Y-卵黄球蛋白的产率为45%至98%。
11.如权利要求1所述萃取Y-卵黄球蛋白(IgY)的方法，其中，该卵黄样品为鸡蛋的卵黄；该缓冲盐类溶液的浓度为0.08M至0.12M范围内；该缓冲盐类溶液为醋酸钠溶液；于步骤(B)中，该缓冲盐类溶液是以8至10倍稀释倍率稀释该卵黄样品；该搅拌的预定时间为25分钟或以上；且该无机盐类为硫酸铵。
【文档编号】C07K16/02GK103570829SQ201210271561
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年8月1日 优先权日:2012年8月1日
【发明者】王玉麒, 汪宗明 申请人:王玉麒