一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子Ⅷ制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种制备冷沉淀的方法，它包括如下步骤：（1）融化：取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为0～5℃融化血浆；（2）过滤：在融化血浆温度为0～5℃的条件下，过滤，得滤液和滤渣；（3）离心：在滤液温度为0～5℃的条件下，离心，得沉淀；（4）合并步骤（2）得到的滤渣和步骤（3）得到的沉淀，即为冷沉淀。本发明制备方法简单，制备的冷沉淀收率高，人凝血因子Ⅷ含量高，工业应用前景良好。
【专利说明】—种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子WI制剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及血液制品的制备方法，特别涉及一种冷沉淀的制备方法以及用其制备凝血因子珊的方法。
【背景技术】
[0002]冷沉淀是新鲜冰冻血浆在低温条件下不溶解的白色沉淀物，主要含有第珊因子、纤维蛋白原、血管性血友病因子(VWF)、第XIII因子以及纤连蛋白等成分，是制备人凝血因子VDI制剂的原料。
[0003]目前，血浆的冷沉淀制备方法有两种:快速融化离心法和虹吸法。虹吸法制得的冷沉淀中，人凝血因子VIII含量低，目前通常采用快速融化离心法。
[0004]快速融化离心法的具体步骤为:取出待制备冷沉淀的新鲜冰冻血浆，置4±2°C冰箱中过夜融化或在4 ± 2°C水浴装置中融化；当血浆基本融化时，取出血浆，在4± 2°C的环境下离心，离心的沉淀即为冷沉淀。但是，该方法制得的冷沉淀的量较少，通常每吨血浆仅得到8.9kg冷沉淀，冷沉淀中人凝血因子珊的含量为39.951IU/g (见营长永等，“人凝血因子VIII分离纯化工艺研究”，山东大学硕士学位论文)，对冷沉淀进一步分离纯化制得的人凝血因子VDI制剂的量也比较少，造成血浆资源的浪费。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明提供了一种新的冷沉淀制备方法。
[0006]本发明制备冷沉淀`的方法，它包括如下步骤:
[0007]( I)融化:取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为O~5°C融化血浆；
[0008](2)过滤:在融化血浆温度为O~5°C的条件下，过滤，得滤液和滤渣；
[0009](3)离心:在滤液温度为O~5°C的条件下，离心，得沉淀；
[0010](4)合并步骤(2)得到的滤渣和步骤(3)得到的沉淀，即为冷沉淀。
[0011]步骤(1)所述融化包括如下两个步骤:
[0012]a、预融化:将新鲜冰冻血浆静置于O~2°C环境中，使血浆升温至-10°C~0°C ；
[0013]b、融化:再升温，得O~5 °C融化血浆。
[0014]步骤a中，所述环境温度为0°C。
[0015]步骤b中，所述升温的方法是25~37°C水浴。
[0016]步骤(2)中，所述过滤采用堰式滤器过滤。
[0017]步骤(3)中，所述离心的离心力为14000~15900g。优选地，所述离心采用型号为GQ142的高速管式离心机离心。
[0018]本发明制备凝血因子VDI的方法，它包括如下步骤:
[0019]a、按照前述方法制备冷沉淀；
[0020]b、溶解冷沉淀；[0021]C、用聚乙二醇沉淀法沉淀，离心，得上清；
[0022]d、SD法病毒灭活；
[0023]e、采用离子交换层析法或者用氯化钠/甘氨酸盐析法纯化；
[0024]f、除菌、分装、冻干、干热灭活，即可。
[0025]步骤b中，溶解冷沉淀采用的缓冲液为0.02MTris缓冲液。
[0026]步骤c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇沉淀。
[0027]步骤e中，所述离子交换层析采用的凝胶为Toyopearl DEAE650M,缓冲液为0.0OlM~0.05M的枸橼酸钠缓冲液。
[0028]步骤e中，所述盐析法采用氯化钠/甘氨酸沉淀。
[0029]采用本发明方法制备冷沉淀，每吨血浆可以制备得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子珊的含量为39.43IU/g，有效提高了单位血浆制得的冷沉淀的量，也提高了单位血浆制得的人凝血因子珊制剂的量，经济效益好，充分利用了血浆资源，具有良好的市场应用前
景
[0030]显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0031]以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【具体实施方式】
[0032]实施例1用本发明方法制备冷沉淀
[0033]1、实验仪器
[0034]堰式滤器:型号是FL-2023堰式罐形过滤器；
[0035]连续离心机:GQ142的高速管式离心机离心。
[0036]2、实验方法
[0037]( I)新鲜健康人血浆采集后，-20 V保存，不超过3年；
[0038](2)预融化:将新鲜冰冻血浆2500L (即2575Kg，人凝血因子VDI的含量为2500，000IU)，放置在环境温度为0°C的条件下，升温至-10°c~o°c ；
[0039](3)融化:在25°C水浴中融化，将血浆升温至O~5°C，得融化血浆；
[0040](4)过滤:在维持融化血浆温度为O~5°C条件下，采用堰式滤器过滤过滤，得滤液和滤渣；
[0041](5)离心:在维持滤液温度为O~5°C条件下，采用连续离心机对滤液进行离心，离心力为15900g，得沉淀；
[0042](6)合并步骤(4)得到的滤渣和步骤(5)得到的沉淀，即为冷沉淀。
[0043]称量冷沉淀的重量,检测冷沉淀中人凝血因子VDI的含量。
[0044]2、检测结果
[0045]经过检测,步骤(4)的滤洛重量为6.18kg,其人凝血因子VDI的含量为41IU/g,步骤
(5)的沉淀中，滤渣重量为22.5kg，其人凝血因子VDI的含量为39IU/g，将二者合并后得到的本发明冷沉淀，总重量为28.68Kg，冷沉淀中人凝血因子VDI的含量为39.43IU/g。[0046]因此，采用本发明方法制备冷沉淀，每吨血浆可以制备得到11.14kg冷沉淀，其人凝血因子VDI的含量为39.43IU/g，其中，过滤获得冷沉淀为2.4Kg，占比21.55%，其人凝血因子VDI的含量为41IU/g，离心获得冷沉淀为8.74Kg，占比78.45%，其人凝血因子VDI的含量为39IU/g。
[0047]实施例2用本发明方法制备冷沉淀
[0048]1、实验仪器
[0049]堰式滤器:型号是FL-2023堰式罐形过滤器；
[0050]连续离心机:GQ142的高速管式离心机离心。
[0051]2、实验方法
[0052](I)新鲜健康人血浆采集后，-20 V保存，不超过3年；
[0053](2)预融化:将新鲜冰冻血浆2500L (即2575Kg，人凝血因子VDI的含量为2500，000IU)，放置在环境温度为2°C的条件下，升温至-10°c~0°C ；
[0054](3)融化:在37°C水浴中融化，将血浆升温至O~5°C，得融化血浆；
[0055](4)过滤:在维持融化血浆温度为O~5°C条件下，采用堰式滤器过滤过滤，得滤液和滤渣；
[0056](5)离心:在维持滤液温度为O~5°C条件下，采用连续离心机对滤液进行离心，离心力为14000g，得沉淀；
[0057](6)合并步骤(4)得`到的滤渣和步骤(5)得到的沉淀，即为冷沉淀。
[0058]实施例3采用本发明冷沉淀制备人凝血因子VDI制剂
[0059]1、实验方法
[0060]实施例1步骤(4)过滤获得的冷沉淀(滤渣)300g (重复三次)以及实施例1步骤
(5)离心获得的冷沉淀(沉淀)(重量分别为3.8kg、3.525kg、2kg)分别按照如下方法纯化制备人凝血因子VDI:
[0061](I)将冷沉淀用0.02M氨丁三醇(Tris)缓冲液溶解，30%聚乙二醇沉淀，离心，得
上清；
[0062](2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最终浓度分别为1%和0.3%, 250C ±1°C处理6小时，完成第一次病毒灭活(即SD病毒灭活)；
[0063](3)氯化钠/氨基酸盐析:SD病毒灭活结束后，加入液体体积15% (w/v)的氯化钠和7.5% (w/v)的甘氨酸进行沉淀，4000rpm离心,收集沉淀；
[0064](4)超滤配制:用含0.01M枸橼酸钠、0.0OlM氯化钙、0.19M盐酸精氨酸的缓冲液对步骤I获得的洗脱液进行超滤透析，制得的溶液成分为人凝血因子珊、枸橼酸钠、氯化钙和盐酸精氨酸，超滤完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的浓度为8g/L的比例，得超滤液；
[0065](5)再进行除菌、分装、冻干，冻干结束后，作80°C 72小时的干热处理，即得终产品:人凝血因子VIII制剂。
[0066]检测各步骤产物以及终产品的效价，计算效价回收率。
[0067]2、实验结果
[0068]实施例1步骤(4)过滤获得的冷沉淀的检测结果如下表1:
[0069]表1人凝血因子VIII的效价回收[0070]
【权利要求】
1.一种制备冷沉淀的方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)融化:取新鲜冰冻血浆，升温，得温度为O~5°C融化血浆； (2)过滤:在融化血浆温度为O~5°C的条件下，过滤，得滤液和滤渣； (3)离心:在滤液温度为O~5°C的条件下，离心，得沉淀； (4)合并步骤(2)得到的滤渣和步骤(3)得到的沉淀，即为冷沉淀。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(1)所述融化包括如下两个步骤:a、预融化:将新鲜冰冻血浆静置于O~2°C环境中，使血浆升温至-10°C~0°C； b、融化:再升温，得O~5°C融化血浆。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤a中，所述环境温度为0°C。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤b中，所述升温的方法是25~37°C水浴。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(2)中，所述过滤采用堰式滤器过滤。
6.根据 权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(3)中，所述离心的离心力为14000 ~15900g。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于:所述离心采用型号为GQ142的高速管式离心机离心。
8.一种制备凝血因子珊制剂的方法，其特征在于:它包括如下步骤: a、按照权利要求1~7任意一项所述方法制备冷沉淀； b、溶解冷沉淀； C、用聚乙二醇沉淀法沉淀，离心，得上清； d、SD法病毒灭活； e、采用离子交换层析法或者用氯化钠/甘氨酸盐析法纯化； f、除菌、分装、冻干、干热灭活，即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤b中，溶解冷沉淀采用的缓冲液为，0.02MTris 缓冲液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:步骤c中，所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇进行沉淀； 步骤e中，所述离子交换层析采用的凝胶为Toyopearl DEAE650M，缓冲液为0.0OlM~，0.05M的枸橼酸钠缓冲液； 步骤e中，所述氯化钠/甘氨酸盐析法中，溶液中氯化钠的终浓度为15%(w/v)，甘氨酸的终浓度为7.5% (w/v)0
【文档编号】C07K14/755GK103848886SQ201410121302
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2014年3月28日 优先权日:2014年3月28日
【发明者】牟蕾, 鲁涛, 初毅波, 苗松, 邓红, 王黔川, 李伟, 余伟 申请人:成都蓉生药业有限责任公司