一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，首先将含有IgA抗原20mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂；然后羊免疫第一针，在羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，足底部2个注射点平均注射，然后间隔二十天注射第二针，再每次间隔10天注射3、4、5针，间隔五天对免疫的羊动脉采血，血液放入水箱中1小时温度40℃，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，本发明将IgA抗原经皮下注入羊腹股沟外并进行多次加强免疫，使其产生高效羊抗IgA抗体可达1∶32以上。为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使羊产生了高的效益。
【专利说明】一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种羊抗人血清生产方法，具体涉及一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白(immunoglobulin, ig)是一组具有抗体活性的蛋白质,ig由楽;细胞产生，主要存在于生物体血液和其他体液(包括组织液和外分泌液)中，约占血浆蛋白总量的20%;还可分布在b细胞表面。人血浆内的免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白(Y-球蛋白)中；IgA，在体液免疫中发挥作是生物试剂的重要原料，现有的生产方法采用传统的免疫方式，产量与效价较低，已无法满足日益增长的使用需求。
【发明内容】
[0003]发明目的:为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种可提高产量与效价的利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法。
[0004]技术方案:为解决上述技术问题，本发明提供的一种可提高产量与效价的利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，包括以下步骤:
[0005]I)免疫原乳剂的制备，将含有IgA抗原20mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂；
[0006]2)羊免疫第一针，在羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，足底部2个注射点平均注射；
[0007]3)与步骤2)间隔二十天注射第二针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射占.
[0008]4)与步骤3)间隔十天注射第三针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射占.
[0009]5)与步骤4)间隔十天注射第四针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射占.
[0010]6)与步骤5)间隔十天注射第五针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射占.
[0011]7)与步骤6)间隔五天对免疫的羊动脉采血，血液放入水箱中I小时温度40°C，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱保存温度在4°C一8°C之间；
[0012]8)对步骤7)所得抗血清进行效价测定。
[0013]作为优选，所述步骤I)所述抗原量是指每二头羊的免疫抗原量。
[0014]所述步骤2)中注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂。
[0015]作为优选，所述步骤3)、4)、5)、6)中注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂。
[0016]作为优选，所述步骤7)的效价测定采用的方法为琼扩方法。
[0017]有益效果:本发明将IgA抗原经皮下注入羊腹股沟外并进行多次加强免疫，使其产生高效羊抗IgA抗体可达1:32以上。为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使湖羊产生了高的效益。
【具体实施方式】
[0018]实施例:实验动物选用湖羊公羊25只，体重35公斤左右健康羊，免疫前全部打上耳标，羊群采用圈养，结合放养，保持正常体况，避免羊只过肥，提高免疫力，自动饮水器，每天牧草供给，适量添加精料、醋糟、麸皮和维生素等。
[0019]人的IgA接种0.1ml (合抗原50mg) 1.9ml无菌PBS完全弗氏(或不完全)佐剂2ml制成免疫原乳剂备用。
[0020]湖羊免疫第一针，前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下下注射，颈部两侧2个注射点平均注射。
[0021]第二针，间隔二十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。
[0022]第三针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。
[0023]第四针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。
[0024]第五针，间隔十天，前后腹股沟分2个点注射，总共12个注射点，后腹股沟淋巴结左右2个点。
[0025]其中第一针即第一次免疫注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂。
[0026]其余免疫中即第二、三、四、五针注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂。
[0027]五天后对免疫的湖羊动脉采血，血液放入水箱中I小时温度40°C，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱保存温度在4°C~8°C之间；
[0028]采用琼扩方法对所得抗血清进行效价测定
[0029]1.配制琼脂:称取1.2g琼脂粉，加入10ml生理盐水中，水浴加热溶解后，以115°C灭菌10分钟；
[0030]灭菌结束后，取出琼脂溶液，冷却至70°C左右，用吸管吸取琼脂液，加入干净的平皿中，每块平皿16ml，待冷却后收起平皿，放于2~8°C冰箱中保存，可保存2周；
[0031]用前在平皿上用梅花打孔器打孔，中间孔加入抗原，外周孔加稀释后的待检血清。
[0032]2.样品血清稀释:取出96孔细胞培养板或血凝板，在每孔中加入25 μ I生理盐水或 PBS ；
[0033]在每行的第I列孔中加入25 μ I样品血清，从第I孔向后倍比稀释至第10孔。
[0034]3.加样检测:取出打好梅花孔的琼脂平皿，在外周孔中按顺序加入倍比稀释的样品血清，每孔约加20 μ 1，以孔加满为宜；
[0035]在梅花孔的中央孔中加入上述分离出的抗血清；
[0036]将加好样的琼脂平皿放入湿盒中，置37°C过夜；
[0037]4.血清效价评定:
[0038]观察外周孔与中央孔沉淀线出现位置，计算样品血清的效价。测得第5孔有沉淀线(凝集反应)说明测定此批次抗血清的效价为1:32。
【权利要求】
1.一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)免疫原乳剂的制备:将含有IgA抗原20mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂； 2)羊免疫第一针，在羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，足底部2个注射点平均注射； 3)与步骤2)间隔二十天注射第二针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点； 4)与步骤3)间隔十天注射第三针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点； 5)与步骤4)间隔十天注射第四针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点； 6)与步骤5)间隔十天注射第五针，前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点； 7)与步骤6)间隔五天对免疫的羊动脉采血，血液放入水箱中I小时温度40°C，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱保存温度在4°C一8°C之间； 8)对步骤7)所得抗血清进行效价测定。
2.如权利要求1所述的一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，其特征在于，步骤I)所述抗原量是指每二头羊的免疫抗原量。
3.如权利要求1或2所述的一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，其特征在于，所述步骤2)中注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂，所述步骤3)、4)、5)、6)中注射的免疫 原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂。
4.如权利要求1或2所述的一种利用多免疫途径生产羊抗IgA多抗血清的方法，其特征在于，所述步骤8)的效价测定采用的方法为琼扩方法。
【文档编号】C07K16/06GK104177498SQ201410413762
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月20日 优先权日:2014年8月20日
【发明者】徐志伟, 刘伟忠, 刘照亭, 鲁群 申请人:镇江万山红遍农业园