扩大杀虫蛋白质宿主范围的方法及手段的制作方法

专利名称：扩大杀虫蛋白质宿主范围的方法及手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组体DNA技术的领域。本发明特别是涉及扩大杀虫蛋白质宿主范围和/或增加它们在某些物种中毒性的方法和手段。这些目标可以通过将一种杀虫蛋白质与另一种能够与未成熟的或成熟的靶昆虫的中肠或后肠上皮相互作用的蛋白质节片相融合而达到。本发明涉及这种新的具有扩大的宿主范围和/或增加了毒性的嵌合蛋白质的设计。更具体地，本发明涉及这样一种嵌合蛋白质，它包括具有杀虫活性的第一种蛋白质节片和能与靶昆虫(包括成长阶段的幼虫和成熟的昆虫)的中肠或后肠细胞膜牢固地结合的第二种蛋白质节片，而第一种蛋白质则不能有效地结合在上述细胞膜上。第一种蛋白质节片最好是苏芸金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的结晶蛋白质(δ-内毒素)，或是其具有杀虫活性的片段，而第二种蛋白质节片例如可以是昆虫核多角体病毒的表面糖蛋白。通过将苏芸金芽孢杆菌的杀虫结晶蛋白质与另一种能结合到靶昆虫中肠或后肠上皮的蛋白质节片中相联合，换句话说，被限制苏芸金芽孢杆菌结晶杀虫蛋白质的宿主范围可显著增加，并且毒性可得到改进。本发明涉及与生产和使用这种嵌合蛋白质有关的全部手段和方法。本发明包括增加宿主范围和/或改进杀虫蛋白质毒性而无需构成这种嵌合蛋白质的其它方法。
近四十年来，农业、公共卫生机构和森林工业越来越多地依靠合成化学药品以防止多种害虫。但是，使用这些广谱化学杀虫剂提出了一系列的问题，如环境污染，对非靶动物的不良作用，在食物和水中的残余物，在食物链中化学物质的聚集以及由于反复使用化学杀虫剂而发展了昆虫的抵抗力。公众对环境质量的关注导致了增加对可供选择的安全的害虫控制对策的重视。
多年来，人们对使用在昆虫中致病和显示毒性的病原体，特别是使用病毒和细菌作为合成化学药品取代物以控制昆虫虫害和各种动物和人的疾病载体已有相当大的兴趣。现在，也许最被人们了解的并无疑在商业上取得最大成功的生物学控制剂是革兰氏阳性土壤细菌，即苏芸金芽孢杆菌(B.thuringiensis，Bt)。
已经查明了许多具有不同昆虫宿主范围的苏芸金芽孢杆菌菌株，它们中的大多数对于鳞翅目(Lepidoptera)某些成员的幼虫是活性的，但有一些则对少数双翅目(dipteran)或鞘翅目(coleopteran)物种显示出毒性。苏芸金芽孢杆菌由于其特性已证明是有效的并对环境是无害的，并且因而被认为是传统杀虫剂的取代物。苏芸金芽孢杆菌孢子结晶混合物的配方商业上可以买到。但是，苏芸金芽孢杆菌作为生物学昆虫控制剂的实际使用由于它有限的宿主范围和对许多害虫的不良效果而受到很大的限制。
几家农业生物技术公司目前正耗费他们的主要财力在全世界各个地方筛选土壤试样，期望得到具有增加的毒性和较广泛的或不同宿主范围的新的苏芸金芽孢杆菌分离菌，但只取得有限的成功。
为改进效力和宿主范围的努力已经初步失败，这是因为迄今只有较少的力量用于研究理解苏芸金杆菌苏芸金芽孢杆菌特性的分子基础。
已知苏芸金芽孢杆菌在孢子形成期间产生结晶内含物。当被靶昆虫的幼虫摄食时，这些结晶内含物被溶于幼虫的中肠，释放出一种或多种结晶蛋白质(Cry蛋白质，也称做δ-内毒素)27-140KD，它们呈现出特殊的高杀虫活性。试验结果表明，这些结晶蛋白质的大多数是原毒素(protoxins)，它们在昆虫的中肠内被蛋白水解转化成较小毒性的多肽。“活化的”毒素与感受的昆虫的中肠上皮细胞相互作用。按照最近的模式，该毒素诱导感受细胞膜中小的非特殊管孔(0.5-1nm)的形成，导致离子的净注入并伴随有水的流入。结果该细胞膨胀并溶解(lyse)。
许多杀虫蛋白质，如由苏芸金芽孢杆菌产生的Cry型杀虫蛋白质，它们作为杀虫剂的有效性受到限制，这是由于它们的宿主范围相当窄，一般局限于同属物种。按照H.Hofte和H.R.Whiteley的新近观点[MicrobiologicalReviews53，242-255(1989)]，在现有技术中已对42种苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质编码基因进行了核苷酸序列的报导，其中的14种显然有特殊的区别，而其余的则是相同的或仅稍有不同，因而代表包括其不同变异体的相同基因。Hofte和White-ley提供了这些基因的详细特性，并且根据它们的结构(核苷酸和导出的氨基酸序列)和宿主范围提出了对这些基因和编码的结晶蛋白质的命名和分类表。苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质的特性被认为是由这些蛋白质的超变氨基酸区所确定，从而这些相同蛋白质的毒性部分被认为是基本上相同的并限定在高的保存区内。例如，Hofte和Whiteley(出处同上)比较了所导出的苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质宽范围的氨基酸序列，并且显示了存在有5个高保存区，即类似于并存在于几乎全部结晶蛋白质中的相同氨基酸序列的许多情况中的区域。Ge等人的研究[Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，4037-4041(1989)]目的在于确定苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质的特性区域，他们使用了重组体DNA技术，以便在两种苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质分子之间交换所保存的和可变区域的某些位置(这两种分子对家蚕的幼虫具有显著不同的毒性)。将高毒性蛋白质的毒性部分(在氨基酸90和332之间的保存区)换成具有低毒性蛋白质的相同区域，仍然产生高毒性的蛋白质。
对于这些杀虫蛋白质的宿主范围/特性，可响应的超变氨基酸区域被认为是将该蛋白质结合在昆虫肠上皮的微绒毛(microvillar)细胞膜上的特殊蛋白质受体[Hofmann.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85，7844-7848(1988);VanRieetal.，Science247，72-74(1990)]。将杀虫蛋白质结合到该膜上使得蛋白质的毒性区域能与靶蛋白质接触或形成孔，二者中的任一情况均导致细胞的死亡[HoefteandWhiteley(出处同上)]。但是，这仍然没有完全理解在分子水平上苏芸金芽孢杆菌结晶毒性的确切作用方式。
苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质的杀虫作用已经传统地通过使用孢子-结晶混合物的粗制品被研究过[Burges，H.D.(ed.)“Microbialcontrolofpestsandplantdiseases1970-1980”AcademicPress，Inc.(London)，Ltd.，London]。然而，要解释这些研究结果是困难的，特别是由于许多苏芸金杆菌菌株同时产生一种以上的结晶蛋白质，因而难于确定各个蛋白质的毒性范围和其它特性。迄今，单独的结晶蛋白质已经由苏芸金芽孢杆菌提纯获得[YamamotoandMclaughlin，Biochem.Biophys.Res.Commun.103，414-421(1982)]，或通过在异源宿主中引入或表达相应的基因而获得[参看Hofte和Whiteley的评论文章表2(出处同上)]。
已经作过各种努力，通过引入新的结晶蛋白质基因，例如连接来自其它苏芸金芽孢杆菌菌株的质粒或通过直接转化在苏芸金芽孢杆菌复制子中克隆化的结晶蛋白质基因以改善苏芸金芽孢杆菌菌株的宿主范围[Heiersonetal.，J.Bacteriol.169，1147-1152(1987)]。Carlton，B.C.[ProceedingsoftheConference“Biotechnology，BiologicalPesticidesandNovelPlant-PestResistanceforInsectPestManagement”heldJuly18-20，1988，OrganizedbyInsectPathologyResourceCenter，BoyceThompsonInstituteforPlantResearchatCornellUniversity，Ithaca，NY，USA，pp.38-43]报导了对科罗拉多(Colorado)马铃薯甲虫和蠋昆虫具有活性的双功能苏芸金芽孢杆菌菌株的构成。马铃薯甲虫的活性是由Bt.的天然分离物产生的。对于蠋呈活性的公知菌株与对马铃薯甲虫呈活性的菌株交配，结果产生具有所需特性的转录接合体。
体外试验的数据有力地提出，活化的毒素识别了仅在感性昆虫中肠上皮上的高度亲和性的结合位点(假设的受体)，以及在确定苏芸金芽孢杆菌宿主范围当中这些受体因子的存在、缺失或修饰。然而，迄今这一观察结果并没有以任何方式用于研制具有改进的性能和广泛宿主范围的新型生物杀虫剂。通过使用重组体DNA工艺的技术改善苏芸金芽孢杆菌宿主范围的罕见努力集中在构成新的含有编码毒素的组合基因的苏芸金芽孢杆菌的构成上，该组合基因对各种昆虫宿主显示出活性。
我们已意外地发现，在某些杀虫毒素，例如苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质(Cry蛋白质，δ-内毒素)和某些昆虫肠上皮细胞之间的低效相互反应，可以通过将附加的病毒源的蛋白质区域提供到毒素上而有效地得到改善，使该毒素能够有效地与靶昆虫的肠(通常是中肠或后肠)上皮相互反应。
另外已发现，杀虫毒素宿主范围或毒性的类似增加，可以通过提供对细胞膜的脂类组分具有高度亲和性的细菌蛋白质区域而达到。
这种方法例如可以通过构成嵌合蛋白质而实现，它不仅通过在中肠上皮细胞表面使富集更多的毒素而改进毒性，而且还通过它的受体结合区域而赋于特性。因此，通过构成杀虫活性毒素的嵌合基因和特定的中肠/后肠结合蛋白质，就可产生具有增大宿主范围和毒性的嵌合的毒素蛋白质。
一方面，本发明涉及增大杀虫蛋白质宿主范围或毒性的方法，通过与其宿主范围内的昆虫肠上皮相互作用而发挥它的活性，该方法包括借助于能够结合到靶昆虫肠上皮的其它蛋白质将杀虫剂提供到靶昆虫的肠上皮。其它的蛋白质例如可以是病毒源，或者可以是细菌蛋白质或是对膜的脂类组分具有高亲合性的蛋白质区域。如果靶昆虫是在杀虫蛋白质的原始宿主范围之内，则蛋白质的毒性可以通过对靶昆虫的肠提供一种较好的结合而增加。另一方面这种方法适用于对不包括在其原始宿主范围内的昆虫扩大杀虫蛋白质的宿主范围。
另一方面，本发明涉及包括第一和第二DNA片段的DNA，同时编码一种嵌合蛋白质，该嵌合蛋白质包括具有通过与其宿主范围内的昆虫肠上皮相互反应而发挥杀虫活性的第一蛋白质区域，该区域由第一DNA片段编码，该嵌合蛋白质还包括能结合到靶昆虫肠上皮的第二个病毒或细菌蛋白质区域，该区域由第二DNA片段编码，上述由第一DNA片段编码的蛋白质区域不能或不能有效地结合在该肠上皮上。如果第二DNA片段编码细菌蛋白质区域，则该区域选择对膜的脂类组分具有高亲合性的蛋白质或蛋白质区域。
再一方面，本发明涉及包括具有以上所定DNA序列的表达盒的表达载体。
另外一方面，本发明涉及嵌合蛋白质，它包括具有通过与其宿主范围内的昆虫肠上皮相互反应而发挥杀虫活性的第一蛋白质节片，以及能结合到靶昆虫肠上皮的第二蛋白质节片，上述第一蛋白质节片不能或不能有效地结合在该肠上皮上。如上文所规定的，第二蛋白质节片由第二DNA片段编码。
再一方面，本发明涉及制备这种嵌合蛋白质的方法，该方法包括在重组体宿主细胞中表达如上述所限定的DNA序列，该重组体宿主细胞是用含所需DNA序列的表达载体所转化的一种微生物或细胞培养物。
另一方面，本发明涉及用包括如上所限定的DNA序列的表达载体所转化的重组体微生物。


图1示出了125I-标记的[苜蓿银纹夜蛾多核多角体病病毒(Au-tographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus)(AcMNP)]病毒结合到纹缘膜泡囊(BBMV)上的饱和动力学，该膜泡囊是由Trichoplusia ni.幼虫的肠组织选择分离的。将不同量的置于PBS+Ca+Mg缓冲液中的I-125标记的游离病毒(1-60μl)，加入总体积为100-400μl的膜泡囊(1-2μl/5-10μg蛋白质)中，然后在20℃培养60分钟，再将泡囊成球并洗涤。盛有规定量I-125标记的病毒(1-60μl)但不盛有膜泡囊的对比试管和盛有膜泡囊的试管一起被培养、成球和洗涤，并用闪烁计数器记数。这些本底计数由膜泡囊的结合计数扣除，然后将它们绘出。当用较高量(2-3μl)膜泡囊完成结合时，观察到类似的结合动力学图样。结合到BBMV病毒上的实际读数根据病毒标记(比活性)的效率而变化。初步试验表明，为达到最大的结合，需要用标记病毒至少培养30分钟。
图2示出了在反应混合物中存在有未标记冷病毒颗粒时，结合到纹缘膜泡囊(BBMV)上的125I-标记的病毒的抑制作用。完全按上述图1进行将I-125标记的病毒结合在膜泡囊上，所不同的是正好在加入标记病毒之前，将适当量(1-10μl)的未标记游离病毒以冷态(4℃)加入膜泡囊中，充分混合并在20℃开始培养。游离的未标记病毒通过在1ml匀浆器中搅匀该病毒制剂若干次(15-20X)而获得，在微离心机中以15Krpm旋转该匀浆10分钟，并且只使用上清液。上图是在一定浓度未标记病毒存在时进行的典型结合反应。实际的图形随着培养混合物中存在的未标记游离病毒颗粒的浓度而变化。
图3示出了含有兔血清和预免疫血清的病毒gp64的多克隆抗体对AcMNP病毒与纹缘膜泡囊结合的抑制特性。完全如前所述进行在有或没有血清时，I-125标记的AcMNP病毒的结合。将血清在PBS+Ca+Mg缓冲液(1∶100和1∶500)中稀释，紧接着将病毒加入血清并开始在冰上预培养15分钟。在病毒和血清(总体积15-20μl)在冰上预培养之后，将混合物加入膜泡囊中，充分混合并且开始在20℃培养60分钟。再如上所述进行膜泡囊小球的洗涤。
图4示出了AcMNP病毒gp64蛋白质(非糖基化的)对粉纹夜蛾(Trichoplusiani.)BBMVs的结合。S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸标记的AcMNP病毒外膜蛋白质gp64(非糖基化的)是在体外，通过使用兔网状细胞提取物(Promega)于37℃经两小时将体外制得的mRNA(用SP6RNA聚合酶，Promega)转译而制得的。通过使用具有10K道尔顿(dalton)过滤单位的1.5ml过滤器(Millipore)过滤提取物，用PBS缓冲液3×1.5ml洗涤滤液，将标记的gp64与未结合的S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸分离。过滤和洗涤是在Sorval冷却离心机中于4℃进行的。这一滤液用于全部结合试验。完全按上述进行对BBMV的结合，不同的是培养仅进行15分钟。在一次典型的试验中，1-10μl上述滤液被用于结合。对比试管载有等体积标记的gp64蛋白质但没有BBMV。这些本底计数由试样中扣除然后绘图。1μl滤液含大约100000cpm。
图5示出了被结合到粉纹夜蛾BBMV上的35S甲硫氨酸标记的gp64(非糖基化的)的SDS剖面。如前所述用BBMV培养S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸标记的gp64蛋白质，但对每条分道所述的条件不同。C.输入gp64物料1，3和5本底结合物料结合到盛有加入1μl gp64滤液的试管(在没有BBMV时)。分道2，4和6标记的物料结合到1μl(2，4)和2μl(6)BBMV上。所有的结合反应仅进行15分钟。全部BBMV小球如前所述被洗涤并载在凝胶上。
图6示出了处理结合到BBMV上的gp64蛋白质(非糖基化的)的结果，该BBMV是由粉纹夜蛾的肠组织上分离出来的。完全按上述进行S-35甲硫氨酸和H-3亮氨酸标记的gp64蛋白质(非糖基化的)对BBMV的结合，但对于每个试样提到有变化的除外。试样被重新悬浮在2×SDS凝胶缓冲液中并载在10%聚丙烯酰胺凝胶上。将该凝胶固定，用1.6%水扬酸钠浸渍、干燥并在KodakX射线胶片上曝光。分道(1).在体外制得的gp64蛋白质(用10K道尔顿过滤器过滤之后)。(2).有2μlBBMV存在时在20℃体外培养制得的gp64蛋白质，培养时间经(3)30分钟，(4)60分钟，以及(5)90分钟。试样c-e在20℃培养后载在凝胶上，而不用BBMV洗涤。分道f-h含有用不同量BBMV培养的标记的gp64蛋白质试样，即(6)10μl，(7)15μl以及(8)20μlBBMV，培养时间60分钟，用PBS+Ca+Mg+BSA缓冲液洗涤BBMV3次，并将BBMV小球载在凝胶上。箭头指明了完整的和处理过的gp64蛋白质。
图7示出了在大肠杆菌中表达鞘翅目毒素后获得的SDS凝胶剖面。
图8示出了在大肠杆菌中表达修饰的鞘翅目毒素后获得的SDS凝胶剖面。
图9示出了本发明构成的Btt/gp64基因的融合。
图10示出了通过免疫印迹检测大肠杆菌中Btt/gp64融合蛋白质的结果。
图11示出了用Btt/gp64融合蛋白质处理的粉纹夜蛾存活的新生幼虫与对比例的比较图。
图12示出了由Btt提纯的鞘翅目毒素的SDS-PAGE的分析结果。
图13是质粒pT7-7的限制性核酸内切酶图。
图14示出了AcNPV的gp64病毒细胞膜糖蛋白的DNA序列和推导的氨基酸序列。
图15示出了Btt毒素基因的限制图。
图16示出了嵌合蛋白质pFAV10的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图17示出了嵌合蛋白质PFx7的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图18示出了嵌合蛋白质pFAc13的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图19示出了在其表面带有gp64表面蛋白质和相邻杀虫毒素的蛋白质分子的感染杆状病毒属(Baculovirus)的昆虫细胞。
图20a，20b和20c示出了嵌合BtCry-Cyt，A基因构成。
图21是PG1472KDa+25KDA的核苷酸序列。
图22是PG1472KDa+27KDA的核苷酸序列。
图23示出了用Btt/gp64融合蛋白质处理的棉铃虫属(Heliothis)的幼虫与对比例比较图。
图24示出了融合的和非融合的Btt蛋白质分子的SDS-PAGE分析结果。
在本文中首先使用的术语“肠”指的是靶昆虫的中肠或后肠，这是因为通过与肠上皮相互作用而发挥其活性的杀虫蛋白质的压倒多数是与这些肠的蛋白质相互作用。苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质结合到其宿主范围内的昆虫中肠上皮是已知的。
在权利要求中的贯穿说明书所使用的术语“杀虫蛋白质”指的是这样的蛋白质，它们在昆虫中引起疾病并显示毒性，并且通过与其宿主范围内的昆虫肠细胞表面相互作用而发挥它们的杀虫作用。由于这个原因，术语“蛋白质”包括天然存在的和合成的具有杀虫特性的蛋白质和蛋白质片段。天然存在的杀虫蛋白质例如可以是由任何原生，或后生动物、原核生物、类病毒、立克次氏体、螺旋体、锯天牛属等起源的。
所用的术语“结晶蛋白质”(Cry蛋白质)指的是以结晶内含物存在的，由苏芸金芽孢杆菌的孢子形成细胞产生的蛋白质。在现有技术中，这些蛋白质通常称做delta-内毒素(δ-内毒素)，在本说明书中，这两个术语交替使用。据认为大多数结晶蛋白质是原毒素，它们在昆虫中肠内被蛋白解转化成具有较小毒性的多肽。与结晶蛋白质有关的所用术语“其具有杀虫活性的片段”指的是结晶蛋白质的任意较小片段，它显示出杀虫活性，包括但不限于通过在昆虫中肠内蛋白水解的降解而获得的较小毒性的多肽片段。因此，后一术语特定地包括部分已知的苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质，它被表示为“毒性区域”(作为与“结合”部分对照)。
术语“昆虫”包括不同生长阶段的昆虫，即未成熟和成熟的昆虫。未成熟的靶昆虫通常是处于生长的幼虫阶段，并且是杀虫毒素的一般的靶。但是，本发明提供的方法和手段对于成熟昆虫的对照物是同样适合的，如甲虫、蟑螂、蝗虫、白蚁等，它们造成了显著的经济损失。
本文中使用的术语“表达载体”指的是表达媒介物，它们能够表达本文所包含的DNA序列，这些序列被操作结合到其它能实现其表达的序列上。不言而喻，尽管不总是处于表达状态，但这种表达载体在宿主生物中或是作为附加体，或是作为染色体DNA的整合部分是可复制的。因此，术语“表达载体”具有一个功能性定义，并且任何能够实现本文中排列的特定基因(DNA密码)的DNA序列被包括在这一定义中。表达载体通常是质粒形式，它们是循环的双线DNA分子，在它们的载体形式中，它们不结合到染色体上。尽管质粒是载体的最普通的使用形式，但本发明的意图是包括任何其它形式的表达载体，它们起着等效的作用，并且在现有技术中是已知的或后来在现有技术中对此成为已知的。
在本发明的嵌合蛋白质分子中，第一杀虫蛋白质片段和第二作靶的蛋白质片段可被置于或是嵌合蛋白质的氨基末端上，或是嵌合蛋白质的羧基末端上。
“重组体微生物”是这样一种微生物，它们经重组体DNA工艺技术用载体转化。
编码显示通过昆虫细胞表面的相互作用而产生杀虫活性的蛋白质的DNA序列，在现有技术中是已知的。编码苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质(43和56KD)的DNA序列例如公开在Hofte和Whiteley的文章中(出处同上)，并在此引作参考。Bacillussphaericus的蛋白质(43和56KD)对蚊是有毒的[Bauman，L.，etal.，J.Bacteriol.1702045-2050(1988);Bauman，P.etal.，J.Bacteriol.1694061-4067(1987)]。可以理解的是，杀虫活性的蛋白质序列的自然等位变化由个体到个体存在和发生。这些变化可以通过全部序列中一个或多个氨基酸的区别，或通过在氨基酸序列中的缺失、替代、插入、转化或附加一个或多个氨基酸来表明。编码这种天然存在的杀虫活性蛋白质的变型的DNA序列，是在本发明的范围之内。编码本发明所用的杀虫活性蛋白质的DNA序列可以由它们的天然来源中分离，由载体(质粒)中切离，而该载体是可购得的或者是在科学工作者中广泛传播的、或者换句话说，是可以用现有技术中公知的方法合成的。
胞外形式的AcNPV(苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒)，gp64的病毒细胞膜(表面)糖蛋白已在这一实验室内分离出来并定序。gp64的DNA序列和导出的氨基酸序列首先出现在1988年(AnnualMeetingoftheAmericanSocietyforVirologyintheUniversityofTexasatAustin-June12-16，1988)，在此示于图14。
尽管本发明已通过使用这种特定蛋白质而被说明，但通过肠进入的所有昆虫病毒的表面蛋白质均适用于本发明的实践。
已被发现对细胞膜的大变种显示高亲合性的蛋白质是苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis(BTI)和苏芸金芽孢杆菌亚种morrisoni(BTM)的PG-14菌株的CytA蛋白质。这是一种27.3-KDA的蛋白质，它不显著地显示出与任何苏芸金芽孢杆菌的Cry蛋白质同源的氨基酸。更重要的是，它有极为不同的生物学特性，具有宽广的宿主范围，包括自然条件下的蚊和其它nematocerous蝇，以及对于体外细胞的异常宽广的宿主范围，包括广泛变型的无脊椎动物和脊椎动物细胞[ThomasandEllar，FEBSMicrobiol.Lett.154，362-368(1983);andJ.CellSci.60，181-197(1983);Chilcott，C.N.andD.J.Ellar.JournalofGeneralMicrobiology134，2551-2558(1988);Federicietal.TheparasporalbodyofBTI;Structure，proteincompo-sition，andtoxicity.In“BacterialControlofMosquitoesandBlackfliesBiochemistry，Genetics，andApplicationsofBacil-lusthuringiensisandBacillusSphaericus”(H.DeBarjacandD.Sutherland，editors).RutgersUniversityPress，NewBruns-wick、NewJersey，1990.]。27.3-KDA细胞溶解蛋白质的核苷酸序列例如是由Galjart等人所公开的[Curr.Microbiol.16.171-174(1987)，and，forBTI，byWaalwijk，C.，etal.，NucleicAcidsRes.13，8206-8217(1985)]。
尽管使用特定的表达系统举例解释了本发明在大肠杆菌中某些特定DNA序列的表达，但要理解的是，该表达可以在广泛范围的原核(包括苏芸金芽孢杆菌)和真核生物[包括植物(基因突变)]的细胞中使用广泛范围的载体进行。
通常，对于克隆和表达本发明的DNA序列较佳的是原核，尤其较佳的是细菌细胞，优选大肠杆菌。其它适合的原核包括杆菌，例如枯草杆菌(Bacillussubtilis)，各种假单胞菌属(Pseudomonas)，等等。
真核微生物，如酵母也可用于本发明的实践。啤酒酵母(S.cere-visiae，面包酵母)是最通用的，但是大量其它酵母在现有技术中也是公知的并常规地用于表达外部蛋白质。这种酵母，例如包括methy-lotrophic酵母毕赤氏酵母属pastoris(P.pastoris)，曲霉属(Asper-gillus)nidulans等。
适于转化大肠杆菌的质粒在现有技术中是公知的并在下面实施例中解释。这些质粒必需含启动子，它们能通过微生物被用于表达它自身的蛋白质。这种启动子之一是紫胶启动子，它的用途在实施例中叙述。广泛用于在大肠杆菌中表达外部蛋白质的另一种启动子系统是色氨酸(trp)启动子/操作基因系统[Goeddel等人，NucleicAcidsRes.8，4057(1980)]。虽然这些是最通用的，但在现有技术中其它微生物启动子也是公知和使用的，并且也适用于实施本发明。该表达质粒通常载有供转化细胞中表型选择的标志。在大肠杆菌中，典型的抗生素抗性序列，例如氨苄青霉素和四环素抗性的基因被用于选择。大概最通用的大肠杆菌表达载体是质粒pBR322[Bolivaretal.，Gene2，95(1977)]及其衍生物。
对酵母载体，适宜的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶[Hitzemanetal.，J.Biol.Chem.255，12073(1980)]，酸性磷酸酶的启动子，以及GPD轻便启动子[Bitter，G.A.，MethodsinEnzymology，152，673-684(1987)]。通常，任何含酵母相容启动子的质粒载体，复制和终止序列的起点适于表达本发明的DNA序列，以产生所希望的嵌合蛋白质。
此外，通过这种方法产生的具有新杀虫特性和/或增加毒性的嵌合毒素蛋白质可以在重要的经济作物中表现出来，从而使它们抵抗了不是几种，而是多种昆虫的虫害。由于使用载有CaMV35S启动子的Ti质粒，这些嵌合蛋白质能在植物中象番茄、烟草、棉花、马铃薯等当中表达出来[Vaeck，M.et.al.，Nature，327，6125，33-37(1987);Fischnoff，D.A.etal.，Biotechnology，5，807-813，(1987)]。
在原核或真核微生物中，异源蛋白质的表达在现有技术中是公知的。适宜表达载体(质粒)的构成，用这种质粒载体对本发明的DNA序列的可操作连接是普通技术人员的知识。
由多细胞生物、脊椎动物或无脊椎动物衍生的细胞培养物也可被用作宿主，优选脊椎动物的细胞培养物。适宜的脊椎动物细胞株的例子是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞株，HeLa、COS-7、AGMK、Rat-1细胞株。这些细胞的表达载体通常包括一个复制起点，位于待表达的5′基因的一个启动子，转录终止区序列，以及某些必需的核蛋白体结合位点，多聚腺苷酸位点，等等。
本发明的表达盒的片段是可操作联合的，即DNA序列编码的所期望的嵌合蛋白质对于表达盒的其它片段，如启动子和转录终止序列功能上被定位和定向。该嵌合蛋白质可被表达作融合蛋白质，该蛋白质含有与用作表达的宿主生物同源的蛋白质序列，或表达作非融合的蛋白质产物。能够被处理以活性态提供所需嵌合蛋白质的融合蛋白质也在本发明的范围之内。
转化宿主生物的方法在现有技术中是公知的，并例如已被Mania-tis等人公开[Maniatisetal.，inMolecularCloningALa-boratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork，USA(1982)]。
本发明的嵌合蛋白质可以用各种方法送至昆虫，包括例如象重组体微生物杀虫剂那样的蛋白质饵，以及通过传递基因的植物。使用本发明嵌合蛋白质的杀虫组合物可以以公知的方法，使用现有技术中公知的载体和其它添加物制备。
按照本发明的优选实施方案，编码苏芸金芽孢杆菌δ-内毒素的DNA序列和AcNPV的gp64病毒细胞膜糖蛋白被操作结合，并且结合的DNA序列在宿主生物中表达，以产生嵌合Bt/gp64的嵌合毒素蛋白质。
AcNPV能够感染鳞翅目幼虫的33个物种[同族夜蛾科(Noctuidae)的19个物种]中的11个不同的组织(脂肪体、气管皮膜组织、皮下组织、马尔皮基氏管、肌肉、血细胞、神经节、中肠、后肠、童期组织和睾丸)。该病毒基因产物gp64是一种AcNPV的胞外形式的组分(“包膜子粒”或“刺突”)。后文中的数据表明，这种蛋白质与各种宿主(鳞翅目幼虫)组织的细胞表面受体相互作用，促使病毒进入该细胞。胞外病毒正在使用在各种昆虫幼虫组织中通常普遍存在的受体是已知的。在对与密封形式的AcMNPV相比较的胞外形式AcMNPV的传染性进行估价时，研究人员已经间接指明，通过喂入(口服)胞外形式的AcMNPV，能够以很低的量感染幼虫宿主蠋[Volkma，L.E.，andM.D.Summers，J.Invertebr.Pathal.，30102-103(1977);Keddie，B.A.，andVolkman，L.E.，J.Gen.Virol.，66，1195-1200(1985)]。这些结果间接表明，使用gp64通过受体传递内吞作用(发明人整理的上述数据)至少某些胞外AcMNPV的颗粒可能已经通过中肠上皮细胞进入。尽管在病毒的天然寿命周期中没有赋予gp64与中肠受体相互反应的作用，但是由于这种病毒广泛的组织向性和宿主范围(Vail，P.V.etal.，J.Invertebr.Pathol.，21，198-204(1973);＆IVthInt.Colloq.InsectPathol.1971)，因此可以想见的是，gp64的受体也存在于中肠上皮细胞表面，从而促使胞外AcMNPV的进入。本发明人已经试验发现，中肠上皮细胞也具有AcNPVgp64普遍存在的受体。由于AcNPV的广泛宿主范围和组织向性，所以gp64具有显著的趋势以改进市售微生物杀虫剂的宿主范围和毒性。结合该区域的AcNPVgp64受体与它特定宿主的中肠受体相互作用，从而将较多的嵌合毒素富集在中肠上皮的细胞表面，并且改进了毒性。甚至更重要地，通过提供将区域结合到Btδ-内毒素上的附加受体，特性将被改进，并且Bt毒素的宿主范围可扩大到昆虫，对于这些昆虫它们是无毒性的或是没有足够毒性的。换句话说，gp64基因序列对于细菌内毒素，包括Bt内毒素而言可被用作瞄准中肠的信号。
按照本发明另一个优选实施方案，苏芸金芽孢杆菌毒素与苏芸金芽孢杆菌的27.3-KDA蛋白质(来自亚种israelensis-Bti，以及morrisoni-Btm)结合，该蛋白质以对细胞膜的脂类部分具有高亲合性而公知。这种蛋白质被显示出是高度疏水的[Galjartetal.，(出处同上);andWardandEllar，J.Mol.Biol.191，1-11(1986)]，并且容易以低浓度与细胞膜结合，形成高浓度的集合物，它通过类似除垢剂的作用模式使细胞膜破裂[Chowetal.，Appl.Environm.Microbiol.55，2779-2788(1989)]。这一蛋白质的广泛物种宿主范围由于其具有高的疏水性和对不饱和脂肪酸的亲合性，构成了细胞膜脂类双分子层的主要组分[ThomasandEllar，J.CellSci.60，181-197(1983);andWardetal.，J.Mol.Biol.191，13-22(1986)]。由于这些特性的结果，与任何其它Bt蛋白质不同的是，这一体外蛋白质容易破裂下述细胞，如小鼠的成纤维细胞，大鼠、马、羊和人类的红细胞，以及昆虫细胞如蚊、其它蝇和鳞翅目中许多物种的细胞[ThomasandEllar，FEBSMicrobiol.Lett.154，362-368(1983);DavidsonandYamamoto，CurrentMicrobiol.11，171-174(1984);andChilcottandEllar(出处同上)]。此外，由编码这一蛋白质的克隆基因表达的蛋白质显示出，用125ng/ml的LD50对蚊虫在体内是有毒的[Wardetal.，J.Mol.Biol.191，13-22(1986)]。这种蛋白质的广泛宿主范围的另外表征是在其对线虫的活性中被发现的[Boneetal.，J.Parasitol.73，295-299(1987)]。
在昆虫摄食后，CytA蛋白质通过在碱性条件下的中肠蛋白酶分解成为25-KDA的相对抗性核[Armstrongetal.，J.Bac-teriol.161，39-46(1985);IbarraandFederici，J.Bacteriol.165，527-533(1986)，andGilletal.(出处同上)]。这种核具有27.3-KDA蛋白质的全部生物学特性。但是，由于它在脊椎动物胃中的高度酸性条件下，显然易于降解，所以当摄食时，它对脊椎动物不造成毒性[ThomasandEllar，FEBSMicrobiol(出处同上)]。
上述各分离物的CytA蛋白质在遗传学上十分相似，不同之处仅在于位置310处的碱基[在BTI基因中的胞嘧啶，在BTM基因中的鸟嘌呤;它在BTI中的氨基酸位置82处产生脯氨酸并在BTM中产生丙氨酸;Galjartetal.(出处同上)]。
27.3-KDA蛋白质的结合显然取决于在细胞膜中的脂类部分中不饱和脂肪酸的存在。公知的知识表明，结合可取决于靶细胞膜中特定蛋白质受体的存在。
所有的生学细胞膜被广为公知的一般性能是它们由流体脂类双层组成，它包含着多样的具有不同功能的蛋白质。昆虫肠上皮细胞的微绒毛具有这些相同的性能[Chapman，TheInsects-Structureandfunction，Elsevier，NewYork1971，pp819]。
构成嵌合BTCry-CytA基因的步骤可以概述如下(参看图20a-c)步骤1.编码待融合蛋白质区域的基因为进行融合而被克隆化和制备。
CytA基因(编码27.3-KDa细胞溶解蛋白质)和Cry基因(编码65-72KDa杀虫蛋白质)由适宜的细菌物种克隆。在实施例2所说明的情况下，两种基因均由苏芸金芽孢杆菌亚种mor-risoniPG-14菌株克隆。接着，基因CytA由用EcoRⅠ消化的克隆pM1切割。这种载有整个CytA基因的EcoRⅠ片段在二个定向上被克隆入载体pBUESCRIPT的EcoRⅠ位点，产生克隆PBBe14e和PBBe15e。用EcoRⅤ消化克隆pBBe15e继而连接产生克隆pBBe15eRⅤ。这一步骤缺失原始克隆的非必需区域。基因CryIVD经过用ClaⅠ/EcoRⅤ双重消化由PM1亚克隆化。这种片段在ClaⅠ/EcoRⅤ位点被插入pBR322以产出克隆pBG35。
步骤2.载有初始密码子的基因在其3′端被截断，并在载体的多衔接物中亚克隆化以使在码组中用第二基因克隆。
在实施例2所述的特定情况下，一个3.5kbpHaeⅢ片段，唯一存在于CryIVD基因中的HaeⅢ位点是在终止密码子上游定位的32碱基对。这种消化产生CryIVD基因，除了包括终止密码子的最后的32核苷酸。这种片段被克隆入pBUESCRIPTKS的SmaⅠ位点(在适于使T7RNA聚合酶体外转录和转译的定向上)以产生克隆pBBh13S。
步骤3.在多衔接物中插入基因的3′端和克隆位点的5′端之间的接点被定序，以保证克隆入码组。
此时，在pBUESCRIPTKS多衔接物中CryⅣD的3′端和SmaⅠ位点5′端之间的接点，使用M13-pUC反向引物用Sequenase定序以保证合适的定位和克隆入码组。
步骤4.制备对具有在码组中克隆位点的CytA蛋白质的有关区域编码的基因片段。
将克隆pBBe15eRV用HaeⅢ消化并用作2kbp片段的来源，该片段载有CytA基因的全部编码序列。在CytA基因的编码序列范围内没有HaeⅢ位点。这种酶切割初始密码子上游的35核苷酸，并且HaeⅢ位点和初始密码子之间的序列不含有终止密码子。
步骤5.第二基因的编码在下游被插入具有第一基因编码序列的码组中。
在此情况下，含有CytA基因的整个编码序列的2dbpHaeⅢ片段被插在质粒pBBh13S的EcoRⅤ位点内。该位点被定位在用于插入载有截断的CryIVD基因的HaeⅢ片段的SmaⅠ位点的下游。已经进行了连接并且重组体细菌被筛分以保证该两种基因以适当的定向融合。码组中的克隆将由体外转录和转译确定。
步骤6.编码第二蛋白质的基因被截断以产生编码结合片段的序列，然后克隆入具有第一基因的码组。
在这种情况下，存在于步骤5产生的质粒中的CytA基因用酶Af1Ⅲ切割。这种酶识别这种质粒中的两个位点，即在CytA的编码序列中的一个位点，以及CytA在该处插入的SalⅠ位点下游的pBUESCRIPT419碱基对中的另一位点。在CytA的编码序列中的Af1Ⅲ位点被定位于25-KDa蛋白质序列的精确的开始处。使这一片段克隆入具有CryⅣD基因的码组中将通过将上述Af1Ⅲ片段(在用Klenow修复后)插入多衔接物的Sa1Ⅰ位点(也用Ke-lenow修复)进行。
所得的融合蛋白质将具有97-KDa(72-KDa+25KDa)的尺寸，并将在昆虫中肠内产生58-KDa(33-KDa+25-KDa)的亚单位。
尽管本发明通过嵌合蛋白质的构成，以及使用本发明提供的手段加以解释，但也能设计其它的方法以增大Bt毒素的宿主范围。例如在其表面具有在肠结合蛋白质和杀虫蛋白质的杆状病毒属(任何昆虫的核多角体病毒)可用作昆虫毒素蛋白质的传递媒介物。此外，甚至在其表面具有中肠结合蛋白质和杀虫蛋白质的杆状病毒属感染的昆虫细胞也能被用作昆虫毒素的传递媒介物。这可以例如使用杆状病毒属载体通过表达作为整合的转化细胞膜蛋白质的杀虫毒素蛋白质来进行设计。这种方法产生在其表面含结合区域(例如gp64)和杀虫蛋白质的感染的昆虫细胞。如果这种被感染细胞(冷冻干燥或冷冻的)被喂给蠋，那末gp64将牢固地结合到中肠上皮细胞上，从而将邻近的杀虫毒素蛋白质带到它的靶上或与它的靶相互作用。因而病毒的表面蛋白质可被用作传递媒介物，或用作各种不具有广泛特性的杀虫蛋白质的特性决定因素。所有这些方法都在本发明的范围之内。
本发明的另外的优选实施方案通过下列非限制性的实施例加以解释。
实施例1A.方法a.从肠组织中分离细胞膜泡囊从Wolfersberger，M等人所公开的粉纹夜蛾(Trichoplusiani)[(Hbner)Comp.Biochem.Physiol.86A，301-308(1987)]的幼虫肠组织中分离出细胞膜泡囊。将3-4龄的健康幼虫冷藏在冰上的培养皿中，并用微解剖剪切开外表皮，以最小程度连接周围组织将中肠慢慢拉出。垂直切开长的中肠并在冰冷的缓冲液A(17mMTris-HCl，pH7.5，含300mM甘露醇和5mMEGTA)中冲洗净内部食料，在吸水前冷冻放置，称重并冷冻至-80℃贮存。
通过Wolfersberger，M.等人(出处同上)所公开的下述方法将膜泡囊与纹缘细胞上皮分离。将由粉纹夜蛾幼虫分离的中肠与缓冲液A(19Wt/Vol)混合并用Sorvall Omni混合器混合二次，每次以中等速率经90秒钟，间隔为1分钟。混合后，添加等体积冷的24mM MgCl2，用混合器充份混合90秒，再使其在冰上放置15分钟。然后在Sorvall离心机中用SS-34转动体以2500Xg将该溶液离心分离15分钟。分离上清液并在分离管中用相同转动体以30000Xg分离30分钟。用聚四氟乙烯手动匀浆器将上述高速球丸重新悬浮在0.5倍原始均质体积的缓冲液A中，添加等体积冷的24mM MgCl2，用混合器充份混合90秒种并如前所述使其放置在冰上15分钟，然后如上所述将该匀浆以2500Xg离心分离15分钟，以30000Xg离心分离30分钟。从而将所得的细胞膜泡囊球丸以3-5毫克/毫升重新悬浮在0.5倍浓度的缓冲液A中并以15μl等分部份在-80℃下贮存。在最终球丸中纹缘上皮细胞膜泡囊的富集物表明，在最终球丸中碱性磷酸酶的比活性比最初2500Xg球团的高10倍。在我们的试验中，细胞膜泡囊在经至少4-6个月的结合试验后是活性的，在此之后制备一批新泡囊。
b.AcMNPV表面蛋白质的Ⅰ-125放射性标记按照生产厂商的指南(Pierce)通过使用Iodo-Gen用Ⅰ-125将病毒表面蛋白质标记。Iodo-Gen以0.1mg/ml溶于氯仿中，并将约10μgIodoGen在有为蒸发氯仿供氮的细喷嘴存在其侧壁上时通过缓慢地旋转随意使用的玻璃管涂敷到约1.5cm高的该玻璃管的11mm上。将未用过的涂Iodo-Gen管子在4℃下于干燥器中贮存直至使用(通常为3-4周)。在通风柜中，通过将有0.3-0.5mCi无载体Ⅰ-125存在的涂敷过Iodo-Gen管子中的约50-75μg病毒蛋白质(100μl体积PSB+Ca+Mg缓冲剂)在室温下培养30-40分钟，同时偶而摇动管子进行碘化。通过将试样转移入保存在4℃的8ml贝克曼异质同晶聚合物透明管中而停止标记。通过用6.5ml冷PBS+Ca+Mg缓冲液充满离心管并在4℃下用60Ti转动体以25Krpm将试样离心60分钟从病毒蛋白质中除去游离Iodine-125。用7ml相同的冷缓冲液洗涤病毒球丸二次并每次按上述以25Krpm离心分离60分钟。将无Ⅰ-125的病毒球丸重新悬浮在小体积PBS+Ca+Mg缓冲液(100-300μl)中，用0.5ml盎司玻璃匀浆器(10-15冲程)均质化，在微离心机中于4℃下以13000rpm将样品离心分离10分钟，仔细分离上清液并以100μl等分部份在-20℃下贮存直至使用。
c.结合试验在最终体积400μlPBS+Ca+Mg的缓冲液中用100-200KcpmⅠ-125标记的病毒蛋白质培养纹缘膜泡囊(5-10μg/每次试验)。膜泡囊不加入对比管中。将管子在保持在20℃的水浴中培养60分钟，然后通过在微离心机中于4℃，以13Krpm将试样离心分离5分钟使结合终止。仔细分离上清液并每次以短暂旋转将膜泡囊球丸洗涤二次，重新悬浮在0.5ml含有0.1mg/mlBSA(缓冲液B)的PBS+Ca+Mg缓冲液中，并如上所述离心分离。将洗涤过的球丸重新悬浮在150μl体积的缓冲液B中，加入3mlNugene液体闪烁体，充份混合并在具有全开放能量窗的贝克曼LSS液体闪烁计数器中计数。病毒的结合以结合到膜胞囊/每次试验上的cpm表示。
d.抗Btt的多克隆抗体的产生这一研究的主要工具之一是抗Btt蛋白质的抗体。为了检测大肠杆菌中的Btt和Btt/gp64融合蛋白质，多克隆抗体是必需的并通过以下方法产生。最初，从Btt本身提纯Btt蛋白质并在SDS-PAGE上首次分析提纯的蛋白质(图12)。然后以若干次将这一提纯的蛋白质注射入两只兔子中从而制得多克隆抗体。检查这些抗体并确定其抗Btt和Btt/gp64融合的效价、免疫特性。利用直接酶连接免疫吸着剂试验(ELISA)(Engvall，E.andPerlman，P.，Immunochem.8，871-879(1971))以检测试验血清中的Btt抗体。简言之，首先将抗原Btt或Btt-gp64融合蛋白质吸附在微滴定板的井表面上。将来自兔子试验所放血的血清试样以不同浓度稀释并在分离的抗原涂复的井中培养。在血清试样中存在的抗原特异抗体将结合在抗原上。洗去未结合的血清或上清液组份，然后碱性磷酸酶结合的抗兔IgG被结合在已结合在抗原上的兔子抗体上。洗去过量的结合物，并将底物对硝基苯酚溶液加入每个井中。当通过结合的酶作用于底物时所显现的颜色深度与血清中抗体量成比例。
B.来自Btt的δ-内毒素基因的克隆和表达对这一基因融合研究所需的工具之一是为了得到为来自对鳞翅目(lepidopterans)和鞘翅目(Coleopteran)甲虫有毒的菌株δ-内毒素编码的基因。由于某些原因，我们先于鳞翅目BT毒素选择了鞘翅目BT毒素[苏芸金芽孢杆菌拟步甲虫(tenebrionis)，Btt]。由于gp64来自专门感染鳞翅目宿主的病毒，其中之一是当与鞘翅目毒素融合时，由于其新得到的对鳞翅目幼虫(粉纹夜蛾)的毒性，所以将较易于测定嵌合毒素蛋白质。为了得到对鞘翅目的编码基因，利用已公布的Btt蛋白质序列[Hofte，H.，etal.，NucleicAcidResearch，15，7183(1987)]由SaferInc.，Newton，Massachusetts获得了苏芸金芽孢杆菌拟步甲虫(Btt)。为了合成2.98kbp鞘翅目毒素基因，利用聚合酶链反应(PCR)技术设计并制得了以下序列的二种低核苷酸(26链节和31链节)26链节-5′AAGCTTACAGAGAAATACACGAGGGC-3′;31链节-5′AAGCTTAATTAAAGATAATATCTTTGAATTG-3′。尽管PCR试验开始是成功的，但后来由于TaqDNA聚合酶的不稳定性质，试验失败了。因而利用完全BttDNA的HindⅢ片段建立了重组体pUC13库。一旦为PCR而设计出的这二种低核苷酸(26链节和31链节)被用作筛分Btt-pUC13重组体库菌落的探针。从菌株苏芸金芽孢杆菌tenebrionis(Btt)中分离出总DNA(染色体的和质粒两种)(这一菌株是由SaferInc.得到的)。然后用限制性内切酶HindⅢ消化分离的细菌DNA并将生成的小DNA片段与被消化的HindⅢ脱去磷酸的pUC13质粒DNA载体混合，加入T4DNA连接酶以促使pUC13载体和“外部”DNA片段之间的DNA连接。然后该连接的DNA转化成大肠杆菌菌株MM294并将细菌细胞敷在LB-琼脂平面上。将大约700个转化的大肠杆菌菌落在圆形硝化纤维纸上划线培养为通过将纸放在营养琼脂的顶层使其在营养琼脂平面上生长。在它们生长过夜后，将含有大肠杆菌菌落的硝化纤维纸处理以使释放出的DNA溶解并固定在纸上。然后使用放射性标记(32P)Btt毒素特种低核苷酸(26链节和31链节)作为探针使硝化纤维纸经受DNA杂交。鉴别出杂交在探针(pUC7-1，pUC9-10和pUC12-7)上的三个菌落以便在pUC13的HindⅢ位点上含有具有预计的2.98kbpHindⅢDNA片断的pUC13质粒。在制定了含少量限制性内切酶的这一片段的限制性图后，证实了pUC12-7和pUC9-10在右定向上具有Btt基因而pUC7-1在相反定向上具有该基因。以后对这些克隆(pUC12-7和pUC7-1)进行了毒性试验(用Colorado马铃薯甲虫)，其结果进一步证实了Btt克隆的显著特性(表1)。
表1在四天暴露期间蛋白质提取物对6天龄Colorado马铃薯甲虫幼虫的活性处理平均死亡率%(S.D.)消耗叶子的面积%(S.D.)pUC133.3a(10.6)21.0a(8.1)12-7未诱导的36.7b(24.7)2.7c(1.8)12-7诱导的33.3b(35.0)2.4c(1.8)7-1诱导的30.0b(24.7) 5.1c(4.8)H2O对比 0a 27.0b(8.9)-后面所用类似字母的均值无显著变化(a＝0.05;SNK)。
表2在四天暴露期间蛋白质提取物(用蒸馏水稀释至50%)对6天龄Colorado马铃薯甲虫幼虫的活性处理平均死亡率%(S.D.)消耗叶子的面积%(S.D.)50%12-7末诱导的46.72.8a(1.9)50%12-7诱导的40.03.5a(5.0)50%7-1诱导的13.311.8a(19.0)H2O 对比 - 36.8b(31.4)-后面所用类似字母的均值无显著变化(a＝0.05;SNK)C.大肠杆菌中Btt基因的高水平表达尽管pUC12-7对鞘翅目幼虫是有毒的(表1)，但我们不能测定comasie-Blue染色的SDS-PAGE上的66KD或27KDBtt毒素蛋白质。这向我们表明，由于基因表达是由Btt启动子引发的，所以制得的Btt毒素是极少量。由于以后的试验(Btt/gp64融合)也需要高水平的表达，我们决定在大肠杆菌中使用具有强T7噬菌体启动子的表达质粒PT7-7以大量表达Btt蛋白质(图7和13)。开始，首先将来自pUC12-7的Btt毒素基因亚克隆成PT7-7载体(为表达外部基因的T7启动子基底载体)。而后在大肠杆菌中在体内以具有T7噬菌体基因10蛋白质氨基末端的融合蛋白质(PT7-SX12和PT7-X9)和以非融合天然Btt毒素蛋白质(PT7-4-4)表达翅鞘目毒素。所有这些重组体质粒被转化成载有对T7RNA聚合酶蛋白质编码结构基因的大肠杆菌菌株BL21[Studier，F.W.，＆B.A.Moffatt，J.Mol.Biol.，189，113-130(1986)]。这一基因是在lacZ启动子控制之下，并且重组体Btt可通过用IPTG诱导表达。这些重组体质粒使Btt毒素表达至比pUC12-7更高的水平并且对鞘翅目幼虫也是有毒的(图8和表2)。
表2蛋白质提取物对10天龄CPB幼虫的效能。
Lepzinotarsadecemiineata。幼虫保持在被处理的叶子上经4天。
处理平均消耗面积%(S.D.)死亡率%H2O 40.3(27.6)b 0＃T7-7(100%)36.9(20.3)b0＃X-9(100%)1.9(0.7)a50＃X-9(50%)3.0(1.4)a50＃X-9(10%)6.6(8.5)a0＃4-4(100%)2.0(1.9)a40＃4-4(50%)2.0(0.8)a30＃4-4(10%)6.5(3.9)a10＃12-7(100%)1.1(-)a90＃12-7(50%)2.6(0.7)a40＃12-7(10%)4.0(2.1)a0
后面所用相同字母的均值无显著区别(a＝0.05，SNK)结论尽管由二个对比处理试验得到的值显著较小，但在消耗的面积平均百分数中，各蛋白质提取物之间未观察到任何显著的区别。对＃12-7提取物，幼虫的死亡率显著较高，这表示出了活性毒素。D.Btt/gp64基因融合的结构和表达在构成上述表达大肠杆菌中Btt毒素蛋白质的重组体质粒后，构成了Btt/gp64基因融合。这些重组体DNA融合的方案示于图9。在Btt蛋白质羧基末端的编码区处的单一Xmnl限制性位点被分裂，并且使含有多个限制性位点的聚合衔接物通过DNA连接位于Xmnl位点附近。利用聚合衔接物的限制性位点，构成三种不同的Btt/gp64基因融合(pFAV10，pFX7和pFAC13)并示于图9。所有这些重组体质粒都转化成载有对T7RNA聚合酶蛋白质编码的构造基因的大肠杆菌菌株BL21。这一基因是在lacZ启动子控制之下，并可通过用IPTG诱导表达重组体Btt/gp64基因融合。对这些Btt/gp64融合蛋白质的免疫印迹试验表明，所有这些融合蛋白质都被表达出来，但与Btt本身比较时，是处于低水平的。(图10)。
E.毒性生物检定a)对粉纹夜蛾新生幼虫进行了用Btt/gp64融合蛋白质的毒性生物检定。这些试验基本上是用利马豆人工食料完成的。我们生长了大批表达这些融合蛋白质的大肠杆菌培养物并将相同量的对比大肠杆菌pT7-7和大肠杆菌Btt/gp64pFAV10分别与相同量的利马豆食料混合以保持相同浓度的蛋白质。使粉纹夜蛾的新生幼虫吃这些食料，六天后记录由毒性造成的死亡率。对比pT-7显示出34%死亡率，而表达125KDBtt/gp64融合蛋白质的pFAV10显示出55%死亡率。这些试验仅用一种高剂量完成的。当观察时，在Btt/gp64融合食料上生存的幼虫比较少，有病并且是昏睡的。这些生存的幼虫照片示于图11。我们还在相衬光显微镜下察看了某些生存的幼虫的中肠，并在与对比的喂pT7-7的幼虫比较时，在喂Btt/gp64的幼虫中观察到中肠的广泛损伤，表明了嵌合的Btt/gp64毒素已经穿过膜相互作用并干扰了离子流。正在进行组织病理学的研究以确定肠损伤的确切本质。此外，有关略低浓度Btt/gp64融合蛋白质的较早的毒性生物检定试验也显示了这一毒性。这些试验清楚地表明，Btt/gp64融合蛋白质已对鳞翅目幼虫带来了新的毒性并可能已使肠造成损伤。
b)用提纯的Btt-gp64融合蛋白质的内含体进行了对烟芽夜蛾(HeliothisVirescens)幼虫的毒性生物检定。在大量培养基(5升)中生长相应的含有Btt-gp64表达质粒pSX12T、pFAV10、pFX7和pFAC13的大肠杆菌细胞。使细胞变成球丸，用pH6.0的0.2M磷酸钠缓冲液洗涤，并再悬浮于15ml磷酸盐缓冲液和1mMPMSF中。在FrenchPressure槽中于11000Psi下使细胞溶解，并通过用SS34转动体于15000Xg下将不溶的蛋白质造球30分钟使可溶的蛋白质分离。将球丸再悬浮在30ml含1mMPMSF的磷酸盐缓冲液中，在冰上培养5分钟，并再次离心分离。将内含体球丸再悬浮在Renograffin溶液(被稀释1.8倍)中并将该Renograffin梯度溶液在SW28转动体中以30000Xg离心分离1小时。将Renograffin溶液倾倒通过粗布以除去顶部胶质层，将该梯度溶液的上清液用至少2体积冷的10mMEDTA(pH8.0)稀释。将试样以15000Xg离心分离30分钟(SS34转动体)，随后用10mMEDTA洗涤三次，蒸馏水洗涤一次，将最后的内含体球丸重新悬浮在水中以进行毒性生物检定。
通过布来得福特(Bradford)分析测定各个Btt-gp64融合蛋白质内含体的蛋白质浓度。将40毫克各种蛋白质试样(32.2mgpFAV10)再悬浮在1.0ml水中并加4.0g食料。将新生烟芽夜蛾幼虫放置在食料上并在28℃培养5天。将各个动物称重并确定平均重量。
试样蛋白质平均体重水(对比)56.2mgpSX12T(对比)54.8mgpFAV10融合蛋白质16.3mgpFX730.7mgpFAc1338.3mg这些结果表明，Btt-gp64融合蛋白质对鳞翅目烟芽夜蛾幼虫有毒并且其中pFAV10毒性最大(见图23)。应该注意，在所有融合蛋白质内含体制剂(pFAV10、pFX7和pFAc13)中，由于蛋白质的降解，只有总蛋白质的15%是未降解的全长融合的蛋白质分子。然而，在对比的pSX12T未融合Btt蛋白质中，大约总蛋白质的80%是未降解的全长Btt蛋白质分子(见图24)。因而，Btt-gp64融合蛋白质对鳞翅目幼虫比未融合鞘翅目Btt毒素蛋白质具有更高的毒性。必须进行附加的精密蛋白质工程以进一步提高Btt-gp64融合蛋白质对鳞翅目幼虫的毒性。因此这些试验证明了这样的概念，即结合蛋白质领域的昆虫中肠可增大杀虫蛋白质的宿主范围。
实施例2嵌合BTCry-Cyt基因的构成a.CryⅣD基因的克隆化制备大量(maxipreps)的质粒pM1[Galjartetal.，Curr.Microbiol.16，171-174(1987)]，然后按照标准方法在CsCl梯度提纯(Maniatis.，Supra.)。在渗析后，进行电泳和分光光度分析以保证没有降解并测定样品中质粒DNA的浓度。然后，使用供应商所推荐的缓冲液首先将10μgDNA于37℃(20μl×5)在含50单位EcoRⅤ(BoehringerMannheim)中消化3小时。在用缓冲液调节试样体积至30μl后，使用供应商(BoehringerMannheim)所推荐的缓冲液将试样与50μlClaⅠ在37℃下消化3小时。通过用酚-氯仿-异戊醇的混合物处理以除去蛋白质并用冷乙醇在-80℃将试样DNA沉淀30分钟(Maniatisetal.Supra)，然后将该DNA以浓度为100ng/μl重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。然后以类似的方式用EcoRⅤ和ClaⅠ将10μl质粒pBR322消化。在酚-氯仿-异戊醇萃取和沉淀后，将DNA重新悬浮在20μl无菌二次蒸馏水中。通过在供应商(BoehringerMannheim)所推荐的缓冲液中在37℃培养15分钟，在50℃培养30分钟，使用3单位牛犊肠碱性磷酸酶以最终体积为50μl进行DNA片段终端的脱磷酸作用。在再添加3单位酶后，重复培养周期。通过3次酚-氯仿-异戊醇萃取除去酶，用冷乙醇沉淀DNA并以浓度为100ng/μl重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。使用T4DNA连接酶(Boer-hingerMannheim)于12℃进行连接15小时。在插入物(被EcoRⅤ和ClaⅠ所消化的pM1)和载体(被EcoRⅤ和ClaⅠ所消化的pBR322)之间的摩尔比为5。通过琼脂糖凝胶电泳监测连接。制备感受的细菌细胞(大肠杆菌菌株JM105)，并使用标准方法用连接质粒使其转化。然后使该细菌生长1小时，并在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB-琼脂培养基(Maniatisetal.Supra)上平板培养。将细菌在37℃下生长15小时，个别地收集重组体克隆并在相同位置在含有LB琼脂和氨苄青霉素的平皿上，和在含有LB琼脂和四环素(15μg/ml)的另一平皿上平板培养。由于克隆化位点是位于抗四环素基因范围内，所以载有插入物的克隆是对四环素敏感的。个别地生长四环素敏感-抗氨苄青霉素克隆。使用标准方法得到少量质粒DNA(“minipreps”)。通过用EcoRⅠ消化和用EcoRⅤ和ClaⅠ二次消化，筛分这些DNA以选择载有含基因CryIVD的片段的重组体pBR322质粒。称作pBGG35的所选择的克隆通过大量制备(maxiprep)步骤而大量提纯并在-20℃下贮存。
b.CytA基因的克隆化使用类似于上述对这一酶所利用的推荐的缓冲液的步骤和条件，用EcoRⅠ将质粒pM1消化。在用酚-氯仿-异戊醇分离蛋白质后，用冷乙醇沉淀DNA，并以100ng/μl的浓度重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。用EcoRⅠ消化大肠杆菌质粒载体pBLUESCRIPTKS(Stratagene)，并如上述将该末端脱除磷酸。在萃取蛋白质和沉淀DNA后，将DNA以浓度为100ng/μl重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。按着上述步骤进行细菌的连接和转化，不同的是在这一场合所用的菌株是大肠杆菌菌株XLIBlue。通过添加XGAL(40μg/ml)和IPTG(1μM)进行重组体克隆的选择。由于该聚合衔接物位于LacZ基因范围内，含有重组体质粒的细菌在有IPTG存在时降低了其降解XGAL的能力，因而会产生白色的菌落，而不是用天然质粒得到兰色菌落。在分离每种重组体克隆后，制得少量(minipreps)DNA，并通过利用类似上述的那些条件，每次使用所推荐的缓冲液，用BamHⅠ，EcoRⅤ和PstⅠ(BoehingerMannheim)消化使克隆筛分。将在二个不同定向上载有含基因CytA的EcoRⅠ插入物的二种重组体克隆命名为pBBLe14e和pBBLe15e，通过大量制备(maxiprep)方法大量制备这两种克隆的DNA。然后用10单位EcoRⅤ消化2μg克隆pBBLe15e以除去EcoRⅠ插入物的非必要片段，然后按上面所述进行连接而不用任何预先的脱除磷酸步骤。其后，采用相同的步骤用连接的质粒使XL1Blue大肠杆菌细菌转化并在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB琼脂上平板培养。通过用EcoRⅤ和BamHⅠ消化(如上所述)鉴别一种不含EcoRⅤ片段的克隆并命名为pBBLe15eRV。通过大量制备步骤提纯这一重组体质粒。
c.pBLUESCRIPTKS中截形CryⅣD基因的克隆化利用供给酶的缓冲液用50单位HaeⅢ(BoehringerMannheim)/20μl(5Ⅹ)在37℃将10μg量的质粒pBG35消化3小时。在用琼脂糖凝胶电泳监测消化后，用酚-氯仿-异戊醇混合液萃取蛋白质并用冷乙醇沉淀DNA。然后将DNA以浓度为100ng/ml重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。这一用HaeⅢ对pBG35的消化产生大量的片段，一种载有CryⅣD基因的约3.5kbp的片段在终止密码子以及这一基因的启动子的上游截去32bp。将10μgpBLUES-CRIPTKS以20μl(5Ⅹ)用50单位SmaⅠ于25℃消化3小时，然后用酚-氯仿-异戊醇处理并用冷乙醇沉淀DNA。如前所述进行脱磷酸作用并最终将DNA以浓度100ng/μl重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。使用上述步骤，将DNA插入物(用HaeⅢ消化的pBG35)在载体(用SmaⅠ消化的pBLUESCRIPTKS)中连接，使用插入物和载体之间的摩尔比为5。该重组体质粒转化成感受的XLIBlue大肠杆菌。将该细菌置于含有氨苄青霉素、IPTG和XGAL的LB琼脂上平板培养。单独收集该处的白色菌落并小量制备。通过用StyⅠ(这一酶不截割pBLUESCRIPTKS，但在CryⅣD基因ORF上有其一个分裂位点)和EcoRⅠ消化而筛分这些重组体克隆，以监测定向。在这一基础上选择名为pBBLh13S的一种克隆并通过大量制备方法制得DNA。
d.CryⅣD3′末端和SmaⅠ消化的pBLUESCRIPTKS的5′末端之间融合的定序为了保证Cry ⅣD基因和pBLUESCRIPT KS之间的融合是在编码组中。利用链终止方法使DNA定序。所用的定序体系是SEQUENASE型2.0(美国生化公司)。使用随酶提供的小册子中所述方法用双线DNA进行定序。使用定序M13逆引子(5′-AACAGCTATGACCATG-3′)以引发用dATP-35S(Amersham)标记的补充线的合成。用BRL型S2定序设备分离这些片段。将干燥凝胶放置在Kodax X-OMAT底片上并在曝光过夜后读出序列。在补充线上读得的序列如下5′-∥-CCTGCAGCCCCCGATTCTTTT-∥-3′。这一序列相应于序列5′-∥-AAAAGAATCGGGGGCTGCAGG-∥-3′的相反线，在此时5′-∥-GGGGG-∥3′相应于HaeⅢ位点(5′-GG/CC-3′)和SmaⅠ位点(5′-CCC/GGG-3′)之间的融合。
e.GytA克隆成含CryⅣD码组中的pBLUESCRIPTKS。
将10μg量的pBBLe15eRV在供应商(BoehingerMannheim)所推荐的缓冲液中用50单位HaeⅢ/20μl(5X)在37℃消化3小时。按已述方法进行酚萃取和DNA沉淀，并将DNA以浓度为100ng/μl重新悬浮在无菌二次蒸馏水中。将10μgpBBLh13S在类似于上述的以及为酚萃取乙醇沉淀和脱除磷酸作用的条件下，用50单位EcoRV于20μl(5X)中消化。重新悬浮在无菌二次蒸馏水中的DNA最终浓度也为100ng/μl。使用2单位T4DNA连接酶和所推荐的缓冲液在12℃下进行连接15小时。插入物(用HaeⅢ消化的pBBLe15eRV)和载体(用SmaⅠ消化的pBBLh13S)之间的摩尔比为5。通过琼脂糖凝胶电泳监测连接，并如上所述使感受的XL1Blue大肠杆菌转化并在含氨苄青霉素的LB琼脂上平板培养。在由供应商(BoehringerMannheim)专门说明的条件下使用StyⅠ.PstⅠ和BamHⅠ将在正确定向上载有CryⅣD和CytA的重组体克隆筛分。
尽管已经提到了特别的实施方案，但应当理解，不能认为本发明限于这些方案。保护范围只应该根据待批的权利要求法律上的范围来限定。
权利要求
1.一种增大杀虫蛋白质或蛋白质区域的宿主范围或毒性的方法，通过在其宿主范围内与昆虫的肠上皮相互作用发挥其活性，该方法包括借助于可结合在靶昆虫的肠上皮上的靶蛋白质或蛋白质区域，将所述杀虫蛋白质或蛋白质区域传送给所述的靶昆虫的肠上皮。
2.权利要求1的方法，其中所述的靶蛋白质或蛋白质区域是从除苏芸金芽孢杆菌以外的来源产生的。
3.权利要求1的方法，其中所述的靶昆虫是在所述杀虫蛋白质的宿主范围内。
4.权利要求1的方法，其中所述的靶昆虫是在所述杀虫蛋白质的宿主范围以外。
5.权利要求1的方法，其中所述的杀虫蛋白质是一种杀虫结晶蛋白质或具有杀虫活性的片段。
6.权利要求5的方法，其中所述的杀虫蛋白质是苏芸金芽孢杆菌(B.thuringiensis)的结晶蛋白质，或其具有杀虫活性的片段。
7.权利要求6的方法，其中所述的杀虫蛋白质是鞘翅目种的苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质。
8.权利要求7的方法，其中所述的杀虫蛋白质是苏芸金芽孢杆菌亚种tenebriosis结晶蛋白质的毒性区域。
9.权利要求2的方法，其中所述的靶蛋白质是病毒表面蛋白质或其具有结合昆虫肠能力的片段。
10.权利要求9的方法，其中所述的病毒表面蛋白质是一种核多角体病病毒胞外态的表面糖蛋白。
11.权利要求10的方法，其中所述的表面糖蛋白是苜宿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)胞外态的gp64的糖蛋白。
12.权利要求9的方法，其中所述的病毒蛋白质是一种植物病毒的表面外壳蛋白质。
13.权利要求12的方法，其中所述的植物病毒是一种luteovirus。
14.一种增大杀虫蛋白质或蛋白质区域的宿主范围或毒性的方法，通过在其宿主范围内与昆虫的肠上皮相互作用发挥其活性，该方法包括借助于对膜的脂类组分具有高亲和性的靶细菌蛋白质或蛋白质区域将所述杀虫蛋白质或蛋白质区域传送给靶昆虫的肠上皮。
15.权利要求14的方法，其中所述的杀虫蛋白质是一种苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段。
16.权利要求15的方法，其中所述的杀虫蛋白质包括苏芸金芽孢杆菌tenebriosis结晶蛋白质的毒性区域。
17.权利要求15的方法，其中所述的细菌蛋白质是一种苏芸金芽孢杆菌的约27.3-KDA细胞溶解蛋白质或其对膜的脂类组分具有高亲合性的片段。
18.权利要求17的方法，其中所述的细菌蛋白质苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约25-KDACytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域。
19.权利要求1或14的方法，其中以包含所述杀虫蛋白质或蛋白质区域和所述靶蛋白质的嵌合蛋白质形式将所述的杀虫蛋白质传送给所述靶昆虫的肠上皮。
20.权利要求19的方法，其中所述的嵌合蛋白质包括苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段以及核多角体病病毒胞外态的表面糖蛋白或其具有结合肠能力的片段。
21.权利要求20的方法，其中所述的嵌合蛋白质包括苏芸金芽孢杆菌tenebriosis结晶蛋白质的毒性区域和苜宿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)胞外态的gp64糖蛋白。
22.权利要求19的方法，其中所述的嵌合蛋白质包括苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质的毒性区域和苏芸金芽孢杆菌的约27.3-KDA细胞溶解蛋白质或其对膜的脂类组分具有高亲和性的片段。
23.权利要求22的方法，其中所述的嵌合蛋白质包括苏芸金芽孢杆菌结晶蛋白质的毒性区域和和苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约25-KDACytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域。
24.DNA，包括一起编码一种嵌合蛋白质的第一和第二DNA片段，该嵌合蛋白质包括被所述第一DNA片段编码的，在其宿主范围内通过与昆虫肠上皮相互作用发挥所具有的杀虫活性的第一蛋白质区域和第二，被所述第二DNA片段编码的，能结合在靶昆虫的所述肠上皮上的蛋白质区域，被所述第一DNA片段所编码的蛋白质区域不能或不能有效地结合在该肠上皮上。
25.权利要求24的DNA，其中所述第一DNA片段编码一种杀虫结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段。
26.权利要求25的DNA，其中所述第一DNA片段编码一种苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段。
27.权利要求26的DNA，其中所述第一DNA片段编码鞘翅目种苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质的毒性区域。
28.权利要求27的DNA，其中所述第一DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种tenebriosis结晶蛋白质的毒性区域。
29.权利要求28的DNA，其中所述的第二DNA片段编码核多角体病毒胞外态的表面糖蛋白或其具有结合昆虫肠能力的片段。
30.权利要求29的DNA，其中所述的第二DNA片段编码苜宿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)胞外态的gp64糖蛋白。
31.权利要求24的DNA，其中所述的第一DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis的约72KD结晶蛋白质。
32.权利要求31的DNA，其中所述的第一DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis的约72KD结晶蛋白质的毒性区域。
33.权利要求32的DNA，其中所述的第二DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约27.3-KDA细胞溶解蛋白质或其对细胞膜的脂类组分具有强亲和性的片段。
34.权利要求33的DNA，其中所述的第二DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni约25-KDACytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域。
35.一种表达载体，包括一个含权利要求24DNA的表达盒。
36.权利要求35的表达载体，其中所述的表达盒在转录方向上包括一个启动子区，所述第一和第二DNA片段的融合，和一个转录终止区，所述表达盒的片段是操作结合的。
37.权利要求36的表达载体，其中所述的启动子和所述的转录终止区是细菌或噬菌体起源的。
38.权利要求37的表达载体，其中所述的第一DNA片段编码一种杀虫结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段。
39.权利要求38的表达载体，其中所述的第一DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片断。
40.权利要求39的表达载体，其中所述的第一DNA片断编码鞘翅目种苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质的毒性区域。
41.权利要求40的表达载体，其中所述的第一DNA片断编码苏芸金芽孢杆菌亚种tenebriosis结晶蛋白质的毒性区域。
42.权利要求39的表达载体，其中所述的第一DNA片段编码核多角体病病毒胞外态的表面糖蛋白或其具有结合肠能力的片段。
43.权利要求42的表达载体，其中所述的第二DNA片段编码苜宿银纹夜蛾核多角体病病毒(AcNPV)胞外态的gp64糖蛋白。
44.权利要求43的表达载体，另外还包括可使其在细菌中复制和选择的序列。
45.权利要求44的表达载体，选自由质粒pFAV10、pFX7和pFAC13组成的组。
46.权利要求43的表达载体，其中所述的第二DNA片段编码植物病毒的表面外壳蛋白质。
47.权利要求46的表达载体，其中所述的植物病毒是luteo-virus。
48.权利要求39的表达载体，其中所述的第二DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约27.3-KDA溶解细胞蛋白质或其对膜的脂类组分具有高亲合性的片段。
49.权利要求48的表达载体，其中第二DNA片段编码苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约25-KDACytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域。
50.权利要求49的表达载体，另外包括可使其在细菌中复制和选择的序列。
51.嵌合蛋白质，包括第一蛋白质节片，该节片在其宿主范围内通过与昆虫的肠上皮相互作用具有发挥的杀虫活性，以及可以结合在所述第一蛋白质节片不能或不能有效结合在靶昆虫肠上皮上的第二靶蛋白质节片。
52.权利要求51的嵌合蛋白质，其中所述的第一蛋白质节片是苏芸金芽孢杆菌的结晶蛋白质或其具有杀虫活性的片段。
53.权利要求52的嵌合蛋白质，其中所述的第二蛋白质节片是核多角体病病毒胞外态的表面糖蛋白或其具有结合昆虫肠能力的片段。
54.权利要求53的嵌合蛋白质，其中所述的表面糖蛋白是苜宿银纹夜蛾核多角体病病毒(ACNPV)胞外态的gp64糖蛋白。
55.权利要求54的嵌合蛋白质，具有示于图16、图17或图18的氨基酸序列以及等位基因，氨基酸缺失，插入，替代，转化或其外加变异体。
56.嵌合蛋白质，包括一蛋白质节片，该节片在其宿主范围内通过与昆虫的肠上皮相互作用而具有发挥的杀虫活性，以及第二，对膜的脂类组分具有高亲合性的靶细菌蛋白质节片。
57.权利要求56的嵌合蛋白质，其中所述的第二靶蛋白质节片是苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约27.3-KDA细胞溶解蛋白质或其对膜的脂类组分具有高亲合性的片段。
58.权利要求57的嵌合蛋白质，其中所述的第二蛋白质节片是苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis或morrisoni的约25-KDACytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域。
59.权利要求58的嵌合蛋白质，是一种通过由苏芸金芽孢杆菌亚种morrisoni的CryIVD基因编码的约72-KDa蛋白质与苏芸金芽孢杆菌亚种israelensis的约25-KDaCytA蛋白质，约27.3-KDA细胞溶解蛋白质的抗蛋白酶区域融合得到的约97-KDa蛋白质。
60.制备权利要求51或权利要求56嵌合蛋白质的方法，该方法包括在一个重组体宿主细胞中表达包括一起编码所述嵌合蛋白质的第一和第二DNA片段的DNA序列，所述重组体宿主细胞是微生物或用含所述DNA序列的一种表达载体转化的细胞培养物。
61.权利要求60的方法，另外包括回收所述嵌合蛋白质的步骤。
62.权利要求60的方法，其中所述的微生物是细菌。
63.权利要求62的方法，其中所述的细菌是大肠杆菌。
64.用权利要求35的表达载体转化的重组体微生物。
65.权利要求64的重组体微生物是大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及增大杀虫蛋白质的宿主范围或毒性的方法，通过在其宿主范围内昆虫的肠上皮相互作用发挥其活性，该方法通过借助于另外的可结合在靶昆虫的肠上皮上的靶蛋白质将杀虫蛋白质传送到靶昆虫的肠上皮上。靶蛋白质例如可以是病毒源或有选择地可以是细菌蛋白质或对细胞膜的脂类组分具有高亲合性的蛋白质区域。
文档编号C07K14/325GK1059760SQ91103590
公开日1992年3月25日 申请日期1991年5月3日 优先权日1990年5月3日
发明者纳塔拉珍·西瓦苏布拉马尼安, 布赖恩·A·费代里奇 申请人:加州大学评议会