专利名称：用杂合前原区域表达神经营养性因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及在真核宿主细胞中构建并表达作为生物活性神经营养性因子的新的嵌合前原蛋白或前原肽。实质上，本发明是基于发现嵌合前原蛋白或前原肽经有效的翻译后加工后，导致有生物活性的第二种神经营养性因子蛋白的表达水平提高，所述的嵌合前原蛋白或前原肽含有与第二种，不同神经营养性因子的成熟蛋白或其部分融合的第一种神经营养因子的前原区。
神经系统的发育和维持依赖于已知称之为神经营养性因子的蛋白。神经营养性因子是一种细胞激活素，一种作为信使并与其他细胞相联系持续地协调和调节生物学功能。神经营养性因子促进神经系统组分的存活和/或分化。普遍的神经细胞死亡伴随着中枢和外周神经系统的正常发育，并在调节可突出到指定靶区域的神经元的数量中起明显的作用(Berg，D.K.，1982，NeuronalDevelopment297-331)。对发育期间外周靶组组的部分切除和移植研究已经表明，为了限制在它们的突出区域产生的存活因子(神经营养性因子)的数量，在神经元之间的竞争引起神经细胞的死亡。目前鉴定的重要的神经营养性因子包括神经生长因子(NGF;Levi-MontalciniandAngeletti，1968，Phys.Rev.48534);促神经营养性激素-3(NT-3;Hohnetal.，1990，Nature344∶339;Maisonpierreetal.，1990，science247∶1446)，脑衍生的神经营养性因子(BDNF;Bardeetal.，1982，EMBOJ.，1549)，促神经营养性激素-4(NT-4;Hallbooketal.，1991，Neuron6∶845-858)，和纤毛神经营养性因子(CNTF;Linet al.，1979，Science.246∶1023)。
在体内，通常合成作为“前原”前体蛋白质的促神经营养性激素。“前原”区域是指前体的NH2-末端，在蛋白质的成熟的，生物活性形式的生物合成中，经蛋白水解作用除去上述末端。“前”区域是指在穿过细胞膜的过程中，通过蛋白水解作用过程，除去正常的信号序列以便产生一种蛋白原;然后通过蛋白水解作用除去“原”区域以产生成熟形式的蛋白质(参见如Darnell et al.，1990，Molecular Cell Biology 2d ed.，Scientific American Books pp.650-657)。
2.1.1神经生长因子神经生长因子(NGF)是迄今为止这些神经营养性分子中特征描述最完全的，并且在体外和体内试验已经表明，在小鸡和大鼠的早期发育中，神经生长因子对于交感和神经脊衍生的感受器神经元的存活是必需的(Levi-MontalciniandAngeletti，1963，Develop.Biol.7∶653-659;Levi-Montalcinietal.，1968，Physiol.Rev.48524-569)。直到最近，对NGF的几乎全部的研究都集中在它在外周神经系统中的作用，但现在发现，在中枢神经系统中，NGF也影响特定神经元群体的发育和维持(Thoerenetal.，1987，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.109∶145-178;WhittemoreandSeiger，1987，BrainRes.Rev.12∶439-464)。
在小鼠下颌腺中富含NGF蛋白质从而允许通过相应的传统的蛋白质化学方法(AngelettiandBradshaw1971，Proc.Natl.Acad.Sci.682417-2420)确定初级氨基酸序列。使用基于由小鼠NGF蛋白质序列能够设计适当的寡核苷酸探针为基础的传统分子生物学术技术，已经从许多种，包括鼠(Scottetal.，1983，Nature302∶538-540)，人(Uilrichetal.，1983，Nature303∶821-825)，牛和小鸡(Meieretal.，1986EMBOJ.5∶1489-1493)和大鼠(Whitte-moreetal.，1988，J.Neurosci.Res.20∶402-410)中克隆了NGF基因。
小鼠NGF基因有约45kb，含数个小5′外显子，通过不同的拼接而产生四种不同的mRNA(Serby et al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶3057-3064)。两种主要的转录产生“长”和“短”NGF前肽原(Edwards，et al.，1986，Nature 319∶784-787;Serby，et al.，1987，Mol Cell.Biol.7∶3057-3064)。“短”前体在NH2-末端含一个位于原区域侧的传统的信号序列(前区域)。“长”前体在其NH2一末端含一个附加的“原区域”(参见如，Suter et al.，1991，EMBO.J.10∶2395-2400，
图1)。到此为止，还未阐明“长”和“短”NGF前原前体之间的功能差异。然而，在大多数组织中。含有更丰富的较短的mRNA转录体(Edwards et al.，1986，J.Biol.Chem.263∶6810-6815)。
小鼠NGF的生物活性形式是一个含一个二聚体的7s复合体，该二聚体是NGF的α-亚单位和γ-亚单位与经过完全加工的β-NGF成熟形式结合，所述的NGF的α-亚单位和γ亚单位是丝氨酸蛋白酶的激肽释放酶家族的两个成员(Varonetal.，Biochemistry7∶1296-1303;Masonetal.，1983，Nature.303∶300-307)。NGF前体的翻译，加工分泌而形成NGF的生物活性形式已了解得很清楚。关于已报告的编码小鼠NGF的cDNA序列长度(Scott，etal.，1983，Nature302∶538-540)，Darling等人(1983，ColdSpringHarborsymp.Quan.Biol.48427-433)利用一个体外无细胞翻译系统鉴定在NGF7S复合体的生物合成中关键的中间体。经蛋白水解处理除去前原NFG前体的信号序列，以便产生一个约31KD的NGF原。NGF原中间体的原区域含一对已知作为内蛋白水解加工位点的精氨酸残基。在这两个残基的任一位点上的蛋白水解加工产生一个附加的大(21KD)和小(18.5KD)的中间体。可以从上述中间体中的任一个经蛋白水解作用得到成熟的NGF。在某些生物合成NGF成熟形式的情况下，蛋白水解释放一个COOH-末端二肽(arg-gly)。
已经表明，在体内γ-亚单位蛋白水解裂解NGF原前体形成成熟的NGF(Edward，etal.，1988，J.Biol.Chem.2636810-6815)。试图在体外模仿上述过程，但未成功，体外模仿导致不可信的NGF原前体的加工。这可能由于体外翻译产物的不正常折叠造成的。Silen和Agard(1989，Nature341∶462-464)证明原区域可有助于α-溶解蛋白酶前体的适当折叠。因此，NGF前体的原区域也可能在内蛋白水解加工前需要适当的折叠，以形成成熟的形式，并连接到有生物活性的7SNGF复合体中。Suter等人(1991，EMBOJ.10∶2395-2400)的描述支持上述假设，他们确定了在NGF原区域中，两个部分保守区域的功能。已证明区域Ⅰ对于NGF在COS细胞中的表达是必需的。另外，发现定位在NGF原区域中，邻近成熟编码区的区域Ⅱ参与蛋白水解加工。
最近已经证明在体内NGF原的内蛋白水解加工由人类的fur基因产物控制，该产物是与膜相连的内蛋白酶，与编码一酵母内蛋白酶(Bresnahan，etal.，1990，J.CellBiol111∶2851-2859)的KEXZ基因有结构同源性。
因此，活性形式的小鼠NGF的生物合成起始阶段包括NGF基因的转录和转录产物可能的可变拼接，以便产生能够翻译长或短的NGF前原前体的mRNA。长或短的前原NGF前体随后进行一系列的内蛋白水解加工过程，该加工过程可能是借助原区域的结构特征，使前体进行适当折叠而诱导，从而形成NGF的成熟形式。
2.1.2来源于脑的神经营养性因子用猪脑为原料，Barde等人(1982，EMBO.J.1∶549-553)报告了一种因子，现称作来源于脑的神经营养性因子(BDNF)，它表现出可促进E10/E11小鸡胚的脊根神经节神经节神经元的存活。在强碱性蛋白(等电点，pI10.1)中存在神经营养性活性，该碱性蛋白在十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶电泳中显示有一个12.3KD的带。应注意到BDNF的强碱性和分子大小与NGF单体很相似。
在互补的未决美国专利申请系列号07/400，591，申请日1989，8.30中第一次描述了完成克隆BDNF基因，该文献引入本文作文参考(也可参见PCT国际公开No.WO91/03568，
公开日1991，3.21)。已对来自各种品种包括人，猪、大鼠和小鼠的完整的CDNA和/或基因组BDNF基因进行克隆，并测定了这些基因的序列。在COS细胞中完成了重组BDNF的表达。
BDNF神经元特异性与NGF的区别的第一个证明是在体外证明纯化的BDNF维持小鸡胚E6，E9或E12的40-50%的与神经基板衍生的结状神经节无关的感觉神经元的存活(Lindsayetal.，1985，J.Cell.Sci.Supp.3∶115-129)。通过其自身或与BDNF偶联，NGF对这些神经元都没有明显的影响。在后来的外植体培养研究中表明BDNF似乎维持来自其他神经基板衍生的感觉神经节，包括岩状神经节，膝状神经节和腹侧三叉神经节的存活和轴突生长(Daviesetal.，1986，J.Neurosci6∶1897-1904)，没有任何一个神经节对NGF敏感，除影响来自外周神经节的培养的神经元外，发现BDNF刺激来自鹑神经脊突的培养细胞的存活和神经原的分化(KalcheimandGendreau，1988，Develop，BrainRes.4179-86)。
两项对BDNF的最新研究(Kalcheim，etal.，1987，EMBOJ.6∶2871-2873;HoferandBarde，1988，Nature311261-262)已经指出在鸟类PNS发育中BDNF的生理作用。除了对神经脊和神经基板源的外周感受器神经原的影响外，已经发现BDNF维持正在发育的CNS神经元的存活，Johnson等人(1986，J.Neurosci63031-3938)提供的资料说明BDNF可维持来自E17大鼠胚的视黄醛神经节培养细胞的存活。
除影响培养中正在发育的神经原的存活外，已经表明，BDNF也影响培养的成熟的外周和中枢神经系统神经元。
分析成熟BDNF的预测的一级结构表明与NGF有惊人的相似;仅具有3个引入NGF序列中的缺口得到最佳匹配，对于各种NGF(从蛇到人)和BDNF共有51个等同物。重要的是，这些等同物包括6个半胱氨酸残基。
2.1.3.促神经营养性激素-3发现了叫做促神经营养性激素-3的促神经营养性激素家族的另一成员，并克隆了来自小鼠、大鼠和人中的NT-3基因(参见美国专利申请系列No.07/490，004，申请日1990，3，7，该文献引入本文作为参考;也参见PCT国际公开No.WO91/03569，
公开日1991，3，21)。发现估算的PI为约9.5，有119个氨基酸组成的成熟小鼠NT-3蛋白质的一般结构与确认的NGF和BDNF的相似;一个假设的含18个氨基酸的信号序列(分别与BDNF和NGF有5和9个氨基酸等同物)后面跟随有含121个氨基酸的原序列(相当于小鼠NGF的103个氨基酸的原序列和小鼠BDNF的含112个氨基酸的原序列)。对成熟的小鼠NGF，BDNF和NT-3进行比较表明它们有54个氨基酸相同。已知在NGF和BDNF中参与形成二硫键(Leibrocketal.，1989，Nature341∶149-152;Angeletti，1973，Biochem.12∶100-115)的全部6个半胱氨酸残基在保守的残基中间。同样，成熟的大鼠NT-3表现出与大鼠NGF有57%的同源性，与大鼠BDNF有58%的同源性;全部3种蛋白质都享有120个残基中的57个(48%)。此外，发现大鼠NGF和BDNF的6个半胱氨酸残基在大鼠NT-3中是绝对保守的，并且这三种蛋白质之间的最大同源区域表现出群集在这些半胱氨酸残基周围。
除在同一种内NT-3，NGF和BDNF之间具有同源性外，在大鼠和人NT-3之间，编码成熟多肽(119个氨基酸)的区域中观察到高度保守的核酸序列。推测的成熟大鼠和人的氨基酸序列(以及小鼠的NT-3)表现出绝对相同使人联想起高度保守的BDNF。在大鼠、小鼠、人和猪之间的成熟多肽的氨基酸序列中表现出完全相同。相反，成熟人的NGF和啮齿类(大鼠和小鼠)的NGF的氨基酸序列有约10%的区别。
研究NT-3的神经营养性活性表明NT-3能促进培养中的游离的脊根神经节神经元的存活和轴突生长。进一步观察NT-3发现，NT-3促进来自结状神经节和交感神经节外植体的轴突生长，而BDNF促进从结状神经节而不是交感神经节突出生长，并且NGF促进交感神经节而不是结状神经节外植体的突出生长。因此，NT-3比BDNF或NGF有更宽的作用特异性。
2.1.4.促神经营养性激素-4最近已经克隆并分离了NGF家族的一个新成员促神经营养性激素-4(Hallbooketal.，1991，Neuron6∶845-858)。已获得了相当于爪蟾属(Xenopus)和蝰蛇的NT-4基因的PCR片段，并随后分离了基因组爪蟾属的克隆。该克隆的核苷酸序列分析表明有一个236个氨基酸蛋白质的开放阅读框架，具有数个与NGF，BDNF和NT-3相似的结构特征。这些特征包括一个推测的氨基酸末端信号序列和一个靠近蛋白水解断裂位点的潜在的N-糖基化作用位点。如NGF，BDNF，和NT-3一样，在一个外显子中编码了全部爪蟾属前-原-NT-4蛋白质。
2.2.生产促神经营养性激素已经试图利用各种表达型载体和宿主生产重组促神经营养性激素。
所有使用动物细胞表达系统(哺乳动物肾细胞)的研究中，Liebrock等人[Nature341∶149(1989)]报道了有生物活性的猪BDNF的表达，且Rosenthal等人[Neuron4∶767(1990)]，Maisonpierre等人[Science247∶1446(1990)]和Hohn等人[Nature344399(1990)]分别报道了有生物活性的各个种的NT-3的表达。另外，Chan等人[EP公开No.370171，
公开日1990.5]报道了通过杆状病毒表达系统，用昆虫细胞表达有生物活性的成熟的人BDNF。
就促神经营养性激素的微生物生产而论，Iwai等人[Chem.Pharm.Bull.344727(1986)]报道了编码人NGF和其融合体的合成“基因”在大肠杆菌中的表达。产物唯一特征在于分子量，在用还原剂处理后，没有任何信息表明有生物活性存在。
Dicou等人[J.NeuroscienceRes.22∶13(1989)]报告了在大肠杆菌中分别表达大鼠和hNGF融合体。Dicou等人(1989，J.Neurosci.Res.22∶13-19)把完整的小鼠前原一神经生长因子DNA序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因的羧基末端融合，并且把相当于人神经生长因子基因11到106密码子的基因组DNA片段β-半乳糖苷酶氨基末端的第五密码子融合。两种细菌载体与表达大量的嵌合蛋白质相关。虽然细菌细胞溶解后，大多数嵌合小鼠前原一神经生长因子表现出是不溶的，但大多数人的嵌合β-神经生长因子似乎存在于上清液中。还未报告神经营养性活性。
最后，Hu等人[Gene70∶57(1988);andAbstract343.16ofthe20thAnn.MeetingoftheSocforNeuroscience(1990)]报告了在大肠杆菌中表达小鼠NGF。
本发明涉及新的含有生物活性神经营养性因子的嵌合前原蛋白质或前原肽，以及使用上述前体和它们的核酸序列生产有一种或多种促神经营养性激素生物活性的蛋白质或肽。由本发明提供的嵌合前原分子包含一个与成熟促神经营养性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的杂合前原区域。根据本发明可使用的成熟促神经营养性激素序列是指包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的同源分子。相似地，可以从包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神经营养性激素分子中得到前原区域。本质上，本发明是基于发现含有与脑衍生的神经营养性因子的成熟部分融合的神经生长因子的前原区域的嵌合前原蛋白或前原肽(前原NGF/BDNF)比同源前源脑衍生的神经营养性因子(前源BDNF)可更有效地经真核宿主细胞加工。
本发明进一步基于发现能表达嵌合前原NGF/BDNF的经稳定的转染和扩增的真核宿主细胞仅把BDNF的成熟形式分泌到培养基中。根据本发明，可以用NGF的“长”或“短”的前原区域构建嵌合的神经营养性基因。
本发明也以发现含有与脑衍生的神经营养性因子的成熟编码区融合的NT-3的前原区域的嵌合前原蛋白质或前原肽(前原NT-3/BDNF)比同源前原脑衍生的神经营养性因子(前原BDNF)可更有效地加工为基础。本发明进一步以发现表达嵌合NT-3/BDNF经稳定转染和扩增的真核宿主细胞仅把BDNF的成熟形式分泌到培养基中为基础。
本发明提供编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸，以及通过使用上述核酸表达这些嵌合神经营养性蛋白和肽的方法。
图1重组BDNF，NGF，和嵌合前体形式的聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳辨别用各种构建体稳定转染的代谢标记的CHO-DG44细胞的细胞上清液，并通过放射自显影方法观察。第1泳道野生型对照CHO-DG44细胞，使用下列构建体含人NGF基因的表达型载体pCDM8(第2泳道);短前原BDNF构建体(第3泳道);长前原NGF/BDNF嵌合物构件体(第4泳道);泳道5分子量标记物。
图2重组BDNF的生物活性。用胚(E8)小鸡脊根神经节检测来自转染的CHO细胞系的粗上清液记录轴突突出物。密封的实心菱形DGC-N/B-2.5-＃23细胞系(含长前原NGF/BDNF嵌合构建体)。带点的方块DGZ1000-B-3-2.5细胞系(含短前原BDNF构建体)。
图3人BDNFCDNA序列(SEQIDNO∶1)和推导出的氨基酸序列(SEQIDNO∶2)，和来自猪(SEQIDNO∶3和SEQIDNO∶4)，大鼠(SEQIDNO∶5和SEQIDNO∶6)及鸡(SEQIDNO∶7和SEQIDNO∶8)的DNA序列比较。该图来自PCT国际公开NO.WO91/03568，
公开日1991.3.21。
图4人NGF的核苷酸(SEQIDNO∶9)和推导出的氨基酸(SEQIDNO∶10)序列。-187至-1表明长前原区。序列资料来自EP公开121，338，
公开日1984.10.10，由Gray和Ullrich提供。
图5大鼠(SEQIDNO∶11)和人(SEQIDNO∶13)NT-3基因的校对的DNA序列。由“PREPRO--”表明预测的翻译起始位点，用“MATURE--”表明预测的成熟NT-3的起始位点。成熟大鼠(SEQIDNO∶12)和人(SEQIDNO∶14)NT-3蛋白质有相同的氨基酸序列，而它们的前原区域在下面划线的11位不同。该图所示来自PCT国际公开NO.WO91/03569，
公开日1991，3，21。
图6在NT-3/BDNF嵌合构建体中使用的DNA片段3(SEQIDNO∶15和16)，它们相当于NT-3前原区的35个氨基酸(SEQIDNO∶17)。
图7Western印迹分析来自CHO细胞的限制性培养基，CHO细胞表达原始的前原BDNF(第2-11泳道)或嵌合前原NT-3/BDNF(第12-19泳道)第1泳道是用450ng纯化的成熟人BDNF载样。第20泳道是用来自BRL的预染色的低分子量标记物载样。第8泳道和第16泳道代表来自每个转染体的非生产克隆。
本发明涉及新的含生物活性神经营养性因子的嵌合前原蛋白质或前原肽，以及使用上述前体和它们的核酸序列生产有一种或多种促神经营养性激素生物活性的蛋白质或肽。本发明提供的嵌合前原分子含有与成熟促神经营养性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的一种杂合前原区域。根据本发明可使用的成熟促神经营养性激素序列是包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的同源分子。相似地，可以从包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神经营养性激素分子中得到前原区域。本质上，本发明基于发现嵌合前原蛋白质或前原肽可比同源前原脑衍生的神经营养性因子(前原BDNF)能更有效地经真核宿主细胞加工，所述的嵌合前原蛋白质或前原肽含有神经生长因子的前原区域和源于脑的神经营养性因子的成熟分部分(前原NGF/BDNF)或者NT-3的前原区域和成熟部分的脑衍生神经营养性因子(前原NT-3/BDNF)。本发明进一步以发现表达嵌合前原NGF/BDNF或NT-3/BDNF的经稳定转染和扩增的真核宿主细胞仅向培养基中分泌BDNF的成熟形式。同源前原BDNF的翻译后加工是高度无效的。相反，可有效地加工同一神经营养基因家族的成员之一NGF。暂留转染后，仅把NGF的成熟生物活性形式分泌到宿主细胞培养基中。为了生产成熟的生物活性BDNF，通过稳定宿主细胞系的繁殖解决BDNF加工问题。通过表达嵌合构建体，本发明提供了一种新的解决加工问题的方法，在一个特殊的实施方案中，嵌合构建体含有融合在成熟BDNF框架中的NGF的长前原区域，并且在另一特殊的实施方案中，它含有融合在成熟BDNF框架中的NT-3的前原区域。
本发明提供编码嵌合神经营养性前原蛋白质或前原肽的核酸，以及通过使用上述核酸表达这些嵌合神经营养性蛋白质和肽的方法。
根据本发明的编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸的表达比使用编码同源神经营养性前原蛋白或前原肽的表达具有更显著的优点。生产嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽提供提高了表达水平的生物活性神经营养性因子。提高的表达水平另外应提供了比污染的表达的神经营养性因子的未加工形式更好的生物活性神经营养性纯化模式，上述污染的表达神经营养性因子的未加工形式在粗上清液中是不明显的。
5.1本发明的表达产物根据本发明可获得的生物活性蛋白质是天然的神经营养性因子，它们是促神经营养性激素基因家族的成员或生物活性蛋白质或其衍生物。本文所用的术语“生物活性”是指能够显示出成熟促神经营养性激素的一种或多种生物活性。上述促神经营养激素包括但不限于成熟的BDNF，NT-3，NGF和NT-4以及用确定促神经营养性激素基因家族成员所用的方法鉴别类似于上述的其它成员(如，使用分子探针，由PCR生产，相当于家族内同源区域;参见PCT公开WO91/03569)。
可获得用本发明可表达的编码各种促神经营养性激素蛋白质的DNA序列。参见Ullrich等人的(Nature303∶821(1983);E.P.公开121，388，
公开日1984.10.10)关于hNGF编码序列和如Meier等人(EMBOJ.5∶1489(1986))和Schwarz等人(J.Neurochem.52∶1203(1989))关于来自其它各种的NGFcDNA;ATCC质粒菌株phBDNF-C-1(保藏号4068)是关于一个hBDNFcDNA克隆和如，Leibrock等人，在下文，关于一个猪BDNFcDNA;和ATCC质粒菌株pC8-hN3(P1)(保藏号40765)关于一个人的NT-3cDNA克隆和Maisonpierre等人(Science247∶1446(1990))和Hohn等人(Nature344∶339(1990))的关于来自其他各种的NT-3编码序列。已经报告了人(Rosenthaletal.，Neuron4∶767(1990))和大鼠(Maisonpierreet，ol.，见下文)的NT-3基因克隆。进一步说，在PCT公开WO91/03568，
公开日1991，3，21，和互补的待审美国申请系列No.570657，申请日1990.8.20中公开了BDNF的核苷酸和氨基酸序列;在PCT公开WO91/03569
公开日1991.3.21和互补的待审申请系列No.570，189，申请1990.8.20中公开了NT-3的核苷酸和氨基酸序列。另外，本文分别在图3，4和5中展示了BDNF(SEQIDNO∶1-8)，NGF(SEQIDNO∶9-10)和NT-3(SEQIDNO∶11-14)的核苷酸和氨基酸序列。
另外，可用上文所述的方法，用BDNF/NGF/NT-3/NT-4家族任意两个成员共有的同源区域鉴别来自任何有机体的促神经营养性激素基因。例如，但不限于，通过BDNF/NGF/NT-3/NT-4合成的简并寡核苷酸鉴别并克隆一种新的促神经营养性激素，所述的简并寡核苷酸相应于任意两个促神经营养性激素之间高度保守的蛋白质序列片段。然后，在用CDNA模板的多聚酶链反应(PCR)中用这些寡核苷酸作引物，所述的CDNA模板是从推测能表达所需促神经营养性激素的细胞中制备的。然后可以用PCR产物作为探针克隆完整的CDNA和/或基因组基因，可通过标准方法确定它们的序列。通过选择那些除含有与其他已知的促神经营养激素同源的序列外，还含有与其他已知的促神经营养激素不同源的序列(例如，至少含六个相邻核苷酸，其中至少有两个核苷酸不同)的细胞而鉴别新的促神经营养性激素。同样，相应于一个种内促神经营养激素序列的寡核苷酸可用于PCR中生产用于克隆来自其它种的促神经营养性激素基因的探针。
NGF和BDNF是约120个氨基酸的碱性蛋白质它们共有约50%的氨基酸序列相同，包括6个绝对保守的半胱氨酸残基，在活性NGF中，已发现这6个半胱氨酸残基形成3个二硫键(Bradshaw，A.，1978，Ann.Rev.Biochem4]∶191-216;Leibrocketal.，1989Nature341∶149-52)。比较来自进化趋异种的NGF序列发现，在这些半胱氨酸残基侧面的氨基酸含有该分子的大部分高度保守区域(Meieretal.，1986，EMBOJ.5∶1489-93;Selbyetal.，1987，J.Neurosci.Res.18∶293-8)。惊人的是，这些也是BDNF和NGF之间最相似的区域(Leibrocketal.，1989，Nature341∶149-152)。
在本发明的一个优选情况中，通过表达有关本发明的嵌合前原分子，生产一种成熟的人促神经营养性激素。在一个特殊的实施方案中，由一个核酸编码嵌合前原分子，该核酸含融合在成熟BDNF编码序列框架中的NGF的长前原区域。在另一实施方案中，由一核酸编码嵌合前原分子，该核酸含有融合在成熟BDNF编码区框架中的NT-3前原区域。仍在另一实施方案中，NGF的长前原区融合在NT-3编码区的框架中。
如上文讨论的，没有资料证明NGF前体的“长”和“短”前原区域间有明显的生物学区别。在本发明的另一特殊情况中，在构建嵌合神经营养性基因中，可利用“长”或“短”前原区域。当构建本发明的含NGF前原区的嵌合融合体时，本领域专业人员可利用“短”NGF前原区或“长”NGF前原区。
根据本发明可以表达为嵌合前原前体的成熟的促神经营养激素分子实质上也包括有生物活性的等序列，片段或衍生物。
例如，可以通过提供功能分子的取代，添加，或缺失改变促神经营养激素核酸序列。由于核苷酸编码序列的简并，在本发明实施时，也可使用本质上编码同样的促神经营养激素氨基酸序列的其它DNA序列。这些包括但不限于含有全部或部分由不同密码子取代改变的促神经营养激素基因，所述的不同密码子编码序列内功能相同的氨基酸残基，因此产生没有痕迹的改变。同样，本发明的促神经营养激素蛋白或其片段或其衍生物包括但不限于那些含有其部分一级氨基酸序列改变的序列，在改变的序列中，功能相等的氨基酸残基取代序列内的残基，这种取代使序列不产生任何变化。如，用作为功能等同物的相似极性的另一氨基酸取代序列中的一个或多个氨基酸残基不产生任何改变。可从氨基酸所属的该类的其它成员中选择序列内氨基酸的取代物。例如，非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸和蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性的)氨基酸包括精氨酸，赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸也包括在本发明范围内的是通过翻译期间或翻译后修饰，如，通过糖基化作用，蛋白水解裂解，连接到一抗体分子上或其它细胞配体上，乙酰化作用，磷酸化作用，还原作用，裂解，等获得的促神经营激素蛋白或其片段或其衍生物。
另外，可以在体外或体内突变给定的促神经营养激素序列，以便产生和/或破坏翻译，起始，和/或终止序列，或者在编码区产生变异和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏以前存在的限制性位点有利于在体外进一步修饰。可以使用本领域专业人员已知的任何诱变技术，包括但不限于，体外位点特异性诱变(Hutchinson，et al.，1978，J.Biol.Chem.253∶6551)，使用TAB 接头(Pharmacia)，等。
本发明也涉及编码嵌合前原促神经营养激素分子的核酸的表达，并回收成熟的促神经营养激素产物。
5.2构建嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽可以使用标准的重组DNA技术，如通过限制酶消化并连接编码所需前原和成熟区域的核酸序列构建编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸。或者，可以使用化学合成法，如固相氨基磷酸酯技术构建核酸序列。在本发明优选的实施方案中，可以用多聚酶链反应(PCR;Saikietal.，1985，Science230∶1350-1354)通过重叠延伸(Hortonetal.，1989，Gene77∶61-68)完成核酸序列的拼接，并因此产生本发明的编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸(参见，如，在下文第5部分)。
在一优选的情况中，通过使用两个分别用不同模板的不同PCR反应生产本发明的核酸。为了举例说明，如果需要一个X-Y嵌合体，首先，用一个模板，如，X，使用与X完全同源的探针，以及一个既与X有同源区域又与Y有同源区的探针完成PCR反应。然后分离PCR反应产物，并在用Y作为模板的第二个PCR反应中，把它用作探针，以及用第二个完全与Y同源的探针。
进一步期望能在引物中渗入有用的限制性内切酶裂解位点。
另外，可通过利用3个寡核苷酸引物的一步PCR生产嵌合神经营养性因子。例如，通过生产的3个寡核苷酸引物，把编码至少部分所需前原区域(X)的核酸与编码一成熟神经营养性蛋白或肽(Y)的核酸序列连接，所述的三个引物中，一个相当于X序列的一部分(X引物)，另一个相当于Y序列的一部分(Y引物)，第三个含有X和Y序列的第一部分(XY引物)。在一步PCR中，结合这三个寡核苷酸，并X和Y引物的量大于XY引物，如，以X∶XY∶Y为约100∶1∶100的比率。[在PCR中所用的模板可以是编码所需前原区域和成熟神经营养性蛋白或肽的核酸的混和物]通过桥接核苷酸(如，XY引物)确定拼接位点的位置。
可以使用本领域常规使用的条件，如使用标准PCR反应溶液和方法的在94℃1分钟，在约43℃2分钟，在约72℃3分钟进行35次循环。然后用凝胶电泳纯化所得的PCR片段，并用适当的限制性内切酶消化所得的PCR片段，并把它连接到适当的克隆载体中。
构建本发明嵌合体的其它方法对于本领域专业人员来说是显而易见的。
可以用本领域已知的方法克隆DNA反应产物。可以使用本领域已知的任何数量的载体宿主系统。可能的载体包括，但不限于粘性质粒，质粒或修饰过的病毒，但载体系统必须与所用的宿主细胞相匹配。上述载体包括，但不限于，噬菌体如入噬菌体衍生物，或质粒如pBR322，pUC，或Bluescript
(stratagene)质粒衍生物。经转化、转染、感染、电穿孔、等可以把重组分子引入宿主细胞。
5.3表达编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸可以把编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核苷酸序列连接到适当的表达载体中，所述载体即含有对于转录克隆的嵌合DNA序列所必需的元素的载体。利用一个促神经营养激素基因和/或与嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽相应的其两侧的区域也可以提供必需的转录和翻译信号。可以用各种真核宿主-载体系统表达克隆的嵌合DNA序列和所得的mRNA转录体、这些包括但不限于用病毒(如疫苗病毒，腺病毒等)感染的，用其它载体转染的，含本发明染色体整合的核酸的哺乳动物细胞系统，但所用的宿主系统必须有适当的，把前原嵌合体加工成成熟促神经营养激素的细胞机制。改变载体的表达元素的强度和特异性。依据所用的宿主-载体系统，可以使用大量适当的转录和翻译元素中任何一个元素。
可以用以前所述的有关把DNA片段插入到载体中的任意方法构建含有编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽序列的表达型载体，该载体包括在嵌合DNA序列上游含有适当的转录/翻译控制信号。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(基因重组)。可以通过第二个核酸序列调节编码嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的核酸序列的表达，以便在用重组DNA分子转化的宿主中表达嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽。例如可以用本领域已知的在哺乳动物细胞中有活性的启动子/增强子元素控制表达。可以用于控制嵌合神经营养性因子表达的启动子包括，但不限于细胞肥大病毒(CMV)启动子，SV40早期启动子区域(BernoistandChambon，1981，Nature290∶304-310)，在劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复所含的启动子(Yamamoto，etal.，1980，Cell22∶787-797)，疱疹胸苷激酶启动子(Wagneretal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶144-1445)，金属硫熏，基因的调节序列(Brinsteretal.，1982，Nature296∶39-42);以及表现组织特异性并已在转基因动物中使用的下列动物转录控制区域，在胰腺泡细胞中有活性的胰肽酶EI基因控制区域(Swiftetal.，1984，Cell.38639-646，Ornitzetal.，1986，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.50∶399-409;MacDonald，1987，Hepatology7∶425-515);在胰β细胞中有活性的胰岛素基因控制区域(Hanahan，1985，Nature315∶115-122);在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区域(Grosschedletal.，1984，Cell38∶647-658;Adamesetal.，1985，Nature318∶533-538;Alexanderetal.，1987Molo.Cell.Biol.7∶1436-1444);在睾丸、乳房淋巴样和肥大细胞中有活性的小鼠乳汁肿瘤病毒控制区域(Lederetal.，1986，Cell45∶485-495)，在肝中有活性的清蛋白基因控制区域(Pinkertetal.，1987，GenesandDevel1∶268-276)，在肝中有活性的α1-胎儿球蛋白基因控制区域(Krumlaufetal.，1985，Mol.Cell.Biol.5∶1639-1648;Hammer，etal.，1987，Science235∶53-58);在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区域(Kelseyetal.，1987，GenesandDevel.1∶161-171)，在髓样细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区域(Mogrametal.，1985，Nature315∶338-340，Kolliasetal.，1986，Cell46∶89-94);在脑的少突神经胶质细胞中有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区域(Readheadetal.，1987，Cell48∶703-712);在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区域(Sani，1985，Nature314∶283-286);在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区域(Masonetal.，1986，Science234∶1372-1378)。
可以使用的表达型载体的特殊实施例是CDM8.(Seed，1987，Nature329∶840-842;SeedandAruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶3365-3369;Aruffo＆Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84∶8573-8577);另一个实施例是pCMX(参见共有未决申请系列No.678，408，申请日1991，3，28)。
可以通过3种一般方法鉴别含有嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽基因的表达型载体(a)DNA-DNA杂交，(b)存在或不存在“标记物”基因功能，和(c)表达插入序列。在第一种方法中，通过使用探针的DNA-DNA杂交，检测插入到表达型载体中外源基因的存在，所述的探针含有与至少部分插入的嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽基因同源的序列。在第二种方法中，可以在某种“标记”基因功能(如，胸苷激酶活性，转化表型，等)存在或不存在的基础上鉴别并选择重组载体/宿主系统，所述的某种“标记”基因功能是由载体中外源基因的插入的。例如，如果把嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的编码序列插入到载体的标记基因序列中，那么通过没有标记基因功能，可以鉴别含嵌合插入序列的重组体。在第三种方法中，可以通过检测由重组体表达的外源基因产生鉴别重组表达型载体。例如，上述检测可以以如上文5.4部分中描述的生物检测系统中，神经营养性因子基因产物的物理或功能特性为基础。
一旦鉴别和分离了一个特定的重组DNA分子，就可以用本领域已知的几种方法进行繁殖。一旦建立了适宜的宿主系统和生长条件，就可以大量地繁殖并制备重组表达型载体。
在某些诱导子存在的情况下，可以增加某种启动子的表达;因此，可以控制经过遗传工程加工的嵌合神经营养性前原蛋白或前原肽的表达。此外，对于蛋白质的翻译和翻译后加工及修饰(如，糖基化，裂解)，不同的宿主细胞有特有的和特殊的机制。为了确保必要的加工(如，由裂解除去前原区)和任何所需的修饰，应选择适当的细胞系或宿主系统。因此，哺乳动物宿主细胞如猴，人或牛是优选的。
在本发明的特殊实施方案中，根据上文列出的方法，可以在CHO细胞系统中表达编码嵌合促神经营养激素的DNA。一旦鉴别了表达嵌合促神经营养激素的重组体，就应分析成熟的基因产物。通过以产物的物理或功能特性为基础的分析，可以完成上述分析。参见上文5.4部分。
一旦鉴别了成熟的神经营养性因子蛋白或肽，就可以通过包括层析(如，离子交换、亲和性和大小柱层析)，离心，不同的溶解性的标准方法，或纯化蛋白质的任何其它标准方法分离并纯化上述的神经营养性因子蛋白或肽。
5.4神经营养性因子检测方法根据本发明生产的促神经营养激素蛋白或肽能够表现出一种或多种包括但不限于神经营养活性，通过抗体与促神经营养激素结合，与同源受体结合等等的生物活性。应把本文所用的术语“神经营养性活性”解释成一种涉及对神经系统细胞的生物效应，所述的神经系统细胞包括，但不限于神经元，星形胶质细胞，胶质细胞，少突神经胶质细胞，小胶质细胞和施旺代细胞。对于没有直接或间接地受到嵌合神经营养性因子作用的神经系统细胞，生物效应是可在神经系统细胞的结构和/或生理学方面改变的。生物效应的例子是延长存活，轴突突起，维持和发展分化功能(如表达一种酶，如胆碱乙酰转移酶，或酪氨酸羟化酶)或，相反地，细胞死亡或衰老，或去分化。
可以使用任何已知的检测上述活性的检测方法以及将来可发展的系统确定神经营养性活性的存在。检测系统可以包括体外测试系统，如使用组织外植体的组织培养生物检测系统，从组织制备的细胞，或不死的细胞系，如从脑，脊髓、或外周神经系统得到的，以及体内测试系统，其中可以给动物服用神经营养性因子;可以使用上述动物，通过完成化学的，组织学或行为测试，确定在上述动物中的神经营养性效应。另外，在非人的转基因动物中，可以掺入作为转基因的神经营养性因子，并可以检测在所述动物中的生物学效应。
例如，但不限于，可以用下列已知的生物检测系统测量神经营养性活性(ⅰ)在Bardeetal.，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.77∶1199-1203中描述的脊根神经节检测系统，该文献全部引入本文作为参考;
(ⅱ)由Lindsayetal.，1985，Dev.Biol.112∶319-328，描述的结状神经节检测系统，该文献全部引入本文作为参考;
(ⅲ)在Bardeetal.，1982，EMBOJ.1∶549-553中描述的交感神经节检测系统，该文献全部引入本文作为参考;
(ⅳ)脊髓神经元。简单地，从检测动物中无菌移出脊髓，然后分离尾部到延髓部分，并除去感觉神经节和脑脊膜。然后，可再把索分成腹部和中背部片段，分别进行培养，把组织切成小碎片，并经研磨通过Pasteur吸管在50%DMEM(Gibco)和50%的Ham′s营养混和物F12(Gibco)中离解，50%的Ham′s营养混和物用33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，15mM NaHCO3，10mM HEPES，25μg/ml胰岛素100μg/ml转铁蛋白，60μm丁二胺，20nM黄体酮，30nM亚硒酸钠，0.5μg/ml青霉素G，0.5μg/ml链霉素，和2.5μg/ml小牛血清白蛋白补充。然后可重复研究两次，并收集上清液，用40μm的Tetko过滤器过滤。然后将离解的腹部细胞以每35mm培养皿0.5百万个细胞的密度铺在用多聚-D-赖氨酸覆盖的(10μg/ml)培养皿中。可以每35mm培养皿1.5百万个细胞的密度，把离解的中背部细胞铺在用多聚-D-赖氨酸(10μg/ml)，多聚-L-鸟氨酸(10μg/ml)或多聚-L-鸟氨酸加昆布氨酸(laminin)(5μg/ml)覆盖的培养皿中。
(ⅴ)基部前脑胆碱能神经元检测方法(参见PCT公开WO91/03568，
公开日1991，3.21);
(ⅵ)腹部中脑dopaminergic神经元检测系统(参见PCT公开WO91/03568，
公开日1991，3，21);和(ⅶ)PC12细胞检测系统6.实施例构建并表达前原-NGF/成熟-BDNF嵌合体6.1.用多聚酶链反应构建嵌合核酸分子用多聚酶链反应克隆(PCR，Saikietal.，1985，Science230∶1350-1354)构建前原NGF/成熟BDNF嵌合体，该嵌合体由与成熟人BDNF序列融合的小鼠NGF的长前原形式组成。
为了完成上述内容，合成两个PCR引物。5′引物(5′-CTC-GTC-GAC-AGC-CGG-CAC-TCT-GAC-CCT-GCG-CGC-CGA-3′)[SEQIDNO∶17]编码BDNF的前7个氨基酸，并包括两个唯一的通过使用修饰密码子产生的限制位点，NaeⅠ，和BssH2。3′PCR引物是一个3′pCDM8寡核苷酸，该寡核苷酸相当于来自在pC8hB中BDNF序列3′末端的多聚连接子序列的下游区域[5′-CAA-AGA-TCC-TCT-AGA-GTC-G-(C)-3′][SEQIDNO∶18]。多聚连接子含有一个NotⅠ限制位点。在同pC8hB(hBDNF在PCDM8中)DNA作模板的PCR中，使用这两个引物。用5微克pC8hB与各500ng的引物进行5个PCR循环。同时用Nael和Notl消化PCR产物，并用凝胶电泳分离365bp的消化产物。通过用Eco47和Not1消化pC81mN(在pCDM8中的长小鼠NGF)完成载体的制备，并通过凝胶电泳分离4.6kb的载体片段。把365bp的片段连接到pC81mN的Eco47/Not1位点。这种连接导致小鼠NGF前原区与成熟BDNF编码区在框架中直接融合。通过用BssH2消化，通过估计在亚克隆中Eco47位点的损失，并最后经DNA定序诊断检测构建体。
6.2.表达嵌合分子用CHO-DG44细胞生产稳定的细胞系以生产有生物活性的BDNF。CHO-DG44细胞(从在Columbia University的Dr.L.chasin得到)缺两拷贝的二氢叶酸还原酶基因(Urlaub and chasin 1980，Proc.Natl.Acad Sci USA.77∶4216-4220)。已经预先描述了表达BDNF的稳定转染的CHO-DG44细胞系(PCT国际公开No.WO 91/03568，
公开日1991，3，21)。通过用pC8hB DNA转染而生产这些细胞系，pC8hB DNA编码包括克隆到表达型载体pCDM8中的前原区的人BDNF基因。采用磷酸钙共沉淀方法将20μg NGF/BDNF嵌合体(pC81mN/B)与0.2μg质粒p410共转染CHO-DG44细胞(1×106细胞/100mm平皿)，所述的质粒p410编码一个减弱的二氢叶酸还原酶基因(dhfr.)。转染48小时后，细胞在选择培养基(没有次黄嘌呤和胸苷的，含10%可透析的胎牛血清及各1%青霉素和链霉素的Ham′s F12;-HT培养基)上传代培养。用氨甲喋呤(MTX)处理-HT-抗性克隆收集物，以便用于扩增。在2.5μM MTX中处理用0.05μM MTX获得的克隆收集物，进行进一步扩增，将首先在0.5μM MTX中然后在2.5μM MTX(因此扩增两循环)中选择的克隆分离(DGC-N/B-2.5-＃23)，如通过生物活性和代谢标记估计的一样，证明该克隆是BDNF的最高效生产者。通过记录鸡胚(E8)脊根神经节(DRG)的轴突生长，评估生物活性(Maisopierre et al.，1990，Science247∶1446-1451)。
7.实施例比较在同源前原BDNF和前原NGF/BDNF嵌合体之间的加工效率通过实验直接比较在CHO细胞中前原BDNF与前原NGF/BDNF的加工和表达。
7.1.代谢标记代谢标记比较用pC8hB或pC81mN/B转染并用2.5μM氨甲喋呤扩增的CHO-DG44细胞系(图1)。为完成该标记实验，把从短前原BDNF构建体(细胞系＝DGZ1000-B-3-2.5)或长小鼠前原NGF/BDNF嵌合构建体(细胞系＝DGC-N/B-2.5＃23)表达BDNF的CHO-DG44细胞，在标记前等密度(在6-孔平皿中2×105细胞/孔)培养24小时。然后在无血清的条件下，用35S-半胱氨酸和35S-甲硫氨酸将细胞标记4小时。用SDS聚丙烯酰胺凝胶(15%凝胶)电泳分析30μl标记细胞上清液样品，并把标记的蛋白质转移到尼龙膜上，并通过放射自显影肉眼观察。如在图1中观察到的，用在表达型载体pCDM8中的人NGF基因稳定转染的CHO-DG44细胞表达NGF的成熟形式，该NGF的成熟形式迁移成约12，300分子量(图2，第二泳道)。在第一泳道中所示的是用野生型CHO-DG44细胞作对照。在稳定转染的细胞系DGZ1000-B-3-2.5(用与细胞系DGC-N/B-2.5＃23相似的MTX选择和扩增方法获得)(图1，第三泳道中，检测未加工的BDNF原(31KD)，已加工的BDNF原前体的原部分(16KD)以及短前原BDNF蛋白的成熟形式(14KD)。仅在用长NGF/BDNF原嵌合构建体稳定转染的DGC-N/B-2.5-＃23中检测到经蛋白水解加工的BDNF的成熟形式(14KD)(图1，第四泳道)。在限制培养基中，从该细胞系未检测到没有加工的NGF/BDNF原。我们估计成熟BDNF的标记密度，细胞系DGC-N/B-2.5-＃23比较短BDNF原构建体构建的细胞系DGZ-1000-B-3-2.5每个细胞多产生约5倍的成熟BDNF蛋白。
7.2.生物活性比较上述两个CHO细胞系中产生的BDNF的活性。用鸡胚(E8)脊根神经节检测粗上清液并记录轴突的生长。与代谢标记实验一致，细胞系DGC-N/B-2.5＃23比细胞系DGZ1000-B-3-2.5多产生约5倍的成熟BDNF。例如，当需要50μl的DGZ1000-β-3-2.5上清液以便达到最大DRG生物活性时，用10μl的DGC-N/B-2.5-＃23细胞上清液就可得到最大轴突生长效果(图2.)7.3.比较用长和短NGF前原区的NGF的表达用前原NGF转染COS细胞，该前原NGF含长(“1mNGF”)或短(“smNGF”)NGF前原区和成熟NGF编码区。转染48小时后，收集培养上清液，并将DRG外植块与纯化的NGF和假转染的COS细胞上清液一起检测。在表1中，列出了用各构建体的三种不同浓度得到的结果表明，用前原区的长或短形式表达的NGF有显著的生物活性。
表1各种COS上清液对DRG外植体的影响
7.4.结论我们从上述研究中得出结论，NGF的长原部分比BDNF的短原部分更适于在CHO细胞中加工BDNF。因此，嵌合NGF原/成熟BDNF基因构建体的优点是，它可以允许在哺乳动物细胞中以每个细胞为基础，高水平表达BDNF。另外，由于在粗上清液中污染的BDNF的未加工形式不明显，所以能提供更好的纯化方法。
另外，使用NGF的长或短前原区导致有生物活性的NGF的表达。这表明，可以在嵌合神经营养性基因构建体中，使用NGF的长或短前原区。
8.实施例构建并表达前原-NT-3/BDNF嵌合体8.1构建嵌合核酸分子从用相应限制酶消化的pC8hB中，得到含有前原和成熟人BDNF整个编码区的HindⅢ-xholDNA片段。通过把包括完整前原区的人BDNF编码序列克隆到表达型载体pCDM8(上文讨论的)中，而得到质粒pC8hB。把该片段连接到pDSRα2(参见公开的欧洲专利申请90305433.6;EPO公开No.0398753A2，该文献全部引入本文作为参考)中。预先消化质粒pDSRα2，以便得到用于与人BDNF片段连接的克隆位点5′-HindⅢ和3′-SalⅠ。所得的质粒叫做pDSRα2(BDNF)。
为了得到含前原NT-3序列和成熟BDNF序列的嵌合质粒，按如下步骤制备三个DNA片段，然后把制备的DNA片段以特定的方向连接。用限制酶消化，从上述的表达型质粒pDSRα2(BDNF)中缺失一个约400bp的含全部前原人BDNF序列的5′-HindⅢ/3′NarⅠ片段。从这些消化产物中回收的DNA片段包含全部表达型载体pDSRα2和成熟的人BDNF序列，并以5′-HindⅢ和3′-NarⅠ位点(标记的DNA片段No.1)为末端。从用相应的限制酶消化的质粒pC8hN3中得到一个约300个碱基对的，含人NT-3前原区的5′-HindⅢ/3′-SacⅡDNA片段。消化结果，SacⅡ位点下游缺失相当于前原NT-3区域的35个氨基酸残基的编码序列。通过把包括完整前原区的人NT-3编码序列克隆到表达型载体pCDM8中，得到质粒pC8hN3。把300个碱基对的5′-HindⅢ/3′-SacⅡ片段标记成DNA片段No.2。最后，为了再产生上述丢失的35个氨基酸残基，制备DNA片段No.3，它是一个合成的寡核苷酸连接子(图6和SEQIDNO∶15-17)。该连接子还包含5′-SacⅡ和3′-NarⅠ限制位点的一半位点，以便促使上文公开的DNA片段Nos1和2的连接。这种连接导致产生表达型载体pDSRα2(NT-3/BDNF)，其中，通过寡核苷酸连接子(片段No.3，图6和SEQIDNO∶15)把NT-3的前原区(片段No.2)与成熟BDNF(片段No.1)连接。
8.2在COS细胞中表达并鉴定NT-3/BDNF嵌合体用CHO-D(-)细胞(ATCC保藏号CCL61)制备用于生产有生物活性BDNF的稳定的细胞系。CHO-D(-1)细胞是编码二氢叶酸还原酶基因缺陷型的，并在Dulbecco改良的Eagle培养基(D-MEM)中维持，Dulbecco改良的Eagle培养基是用MEM非必需氨基酸，各1%的青霉素和链霉素，10%胎牛血清，次黄嘌呤和胸苷补充，用2.5μgNT-3/BDNF嵌合构建体[pDSRα2(NT-3/BDNF)]，通过磷酸钙共沉淀方法转染CHO-D(-)细胞，上述的NT-3/BDNF嵌合构建体预先用限制酶Pvul消化而线性化。上述载体(pDSRα2)编码小鼠二氢叶酸还原酶小基因(dhfr)，该基因表达后能够使转染的CHO-D(-)细胞克服dhfr基因缺陷并在没有核苷酸次黄嘌呤和胸苷的情况下生长。通过载体pDSRα2不能成功地转染的亲本CHO-D(-)细胞不能在选择培养基中存活，除用经透析的胎牛血清代替胎牛血清，并省略了次黄嘌呤和胸苷外，所述的选择培养基与上述的维持培养基的组分相同。用胰酶消化细胞，并在转染后，以1×105细胞/100mm平皿的密度，将细胞在选择培养基中培养48小时。两星期后，用圆筒状克隆筛选机挑出单个菌落。然后把每个克隆扩散到100mm平皿上。当培养物达到会合时，吸出原来的含血清培养基并用3ml无血清培养基代替加入。收集限制性培养基(CM)并把各50μl的培养物放在15%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，进行凝胶电泳。用对天然BDNF特异的兔抗血清进行Western凝胶印迹。如在图7中所示，表达来自pDSRα2(BDNF)的原始BDNF的所有克隆除分泌已加工的BDNF外还分泌多形式的未加工BDNF。未加工形式与加工形式的比率是2∶1。相反，表达来自pDSRα2(BDNF)的嵌合NT-3/BDNF的所有克隆仅分泌完全加工过的，BDNF的成熟形式，这种BDNF带有不能检测到的部分加工过的前体。
来自嵌合NT-3/BDNF克隆的1升无血清限制性培养基经传代纯化，所述的传代经S-Sepharose柱，接着通过SephacrylS-20o大小的筛析栓。SDS-PAGE分析和氨基酸序列测定表明，获得了一个分子量为14KD(预测的成熟人BDNF)的同源蛋白质，该同源蛋白质有唯一与成熟人BDNF的N-末端序列一致的N-末端序列。此外，经鸡脊根神经节检测(上文对NGF/BDNF嵌合体描述的)表明是纯化的BDNF，并有完全的生物活性。
8.3NT-3/BDNF嵌合体在COS细胞中的表达及其生物活性用COS-7细胞(ATCC保藏号CRL1651)作为暂留表达系统，检测有生物活性的BDNF的生产。按常规方法将COS-7细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素抗生素的D-MEM中保持。用分别为20μg的pDSRα2，pDSRα2(BDNF)和pDSRα2(NT-3/BDNF)单独在1600伏，经0.4微秒，通过电穿孔转染COS-7细胞(5×106细胞/ml)。以2×106细胞/60mm平皿的密度将转染的COS-7细胞进行平皿培养。收集转染后24和72小时之间积累的限制性培养基。通过记录鸡胚(E8)脊根神经节(与NGF/BDNF嵌合体)的轴突生长，估计生物活性。如在表2中所示，嵌合pDSRα2(NT-3/BDNF)的克隆分离物CI 1和CI 20比来自pDSRα2(BDNF)的表达的成熟BDNF的活性高约5倍，后者含不变的DBNF前原区。
表2检测用质粒DNA转染的COS细胞的限制性培养基的鸡DRG外植体
8.4结论这些研究表明，用NT-3前原区取代BDNF前原区有利于前原区的蛋白水解加工，并且显著地提高了成熟BDNF的净产量。此外，通过宿主细胞在成熟的经加工过的BDNF的N-末端没有任何改变就可以精确地识别在前原NT-3和成熟BDNFDNA序列之间重建的裂解位点。与嵌合NGF/BDNF基因构建体一样，嵌合NT-3/BDNF基因构建体以哺乳动物的每个细胞为基础，产生高水平的加工过的BDNF，并且通过减少污染的未加工形式，可以更好地进行纯化。
本发明不限于本文所述特殊实施方案。的确，从上面的描述和附图中，除本文中描述的外，本发明的其它各种修饰物对于本领域专业人员来说是显而易见的。上述的修饰也包括在本发明权利要求范围内。
本文引述的各种公开和专利申请，其公开的内容全部引入本文作为参考。
权利要求
1.一种嵌合前原蛋白或前原肽，含有(a)第一种促神经营养性激素的前原区；和(b)基本上等于第二种促神经营养性激素成熟形式的氨基酸序列，其中，第一和第二种促神经营养性激素是不同的。
2.一种嵌合前原蛋白或前原肽，含有(a)第一种促神经营养性激素的前原区;和(b)基本上等于第二种促神经营养性激素的部分成熟形成的生物活性氨基酸序列，其中，第一和第二种促神经营养性激素是不同的。
3.根据权利要求1的嵌合前原蛋白，其中第一和第二种促神经营养性激素选自神经生长因子，脑衍生物的神经营养性因子，和促神经营养性激素-3。
4.根据权利要求2的嵌合前原蛋白，其中第一和第二种促神经促神经营养性激素选自神经生长因子，脑衍生的神经营养性因子，和促神经营养性激素-3。
5.根据权利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原区是神经生长因子的长前原区。
6.根据权利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原区是神经生长因子的长前原区。
7.根据权利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原区是神经生长因子的短前原区。
8.根据权利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，前原区是神经生长因子的短前原区。
9.根据权利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一种促神经营养性激素是促神经营养性激素-3。
10.根据权利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一种促神经营养性激素是促神经营养性激素-3。
11.根据权利要求1的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一种促神经营养性激素是脑衍生物的神经营养性因子。
12.根据权利要求2的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第一种促神经营养性激素是脑衍生的神经营养性因子。
13.根据权利要求5或6的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二种促神经营养性激素是脑衍生的神经营养性因子。
14.根据权利要求7或8的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二种促神经营养性激素是脑衍生的神经营养性因子。
15.根据权利要求9或10的嵌合前原蛋白或前原肽，其中，第二种促神经营养性激素是脑衍生的神经营养性因子。
16.一种核酸分子，含有编码权利要求1嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
17.一种核酸分子，含有编码权利要求2嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
18.一种核酸分子，含有编码权利要求3嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
19.一种核酸分子，含有编码权利要求4嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
20.一种核酸分子，含有编码权利要求5嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
21.一种核酸分子，含有编码权利要求6嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
22.一种核酸分子，含有编码权利要求7嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
23.一种核酸分子，含有编码权利要求8嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
24.一种核酸分子，含有编码权利要求9嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
25.一种核酸分子，含有编码权利要求10嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
26.一种核酸分子，含有编码权利要求11嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
27.一种核酸分子，含有编码权利要求12嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
28.一种核酸分子，含有编码权利要求13嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
29.一种核酸分子，含有编码权利要求14嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
30.一种核酸分子，含有编码权利要求15嵌合前原蛋白或前原肽的核苷酸序列。
31.根据权利要求16或17的核酸分子，它是一个载体。
32.根据权利要求18或19的核酸分子，它是一个载体。
33.一种含权利要求31的载体的重组细胞。
34.一种含权利要求32的载体的重组细胞。
35.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求1的核酸分子的重组细胞生长。
36.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求2的核酸分子的重组细胞生长。
37.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求3的核酸分子的重组细胞生长。
38.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产的第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求4的核酸分子的重组细胞生长。
39.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求5的核酸分子的重组细胞生长。
40.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求6的核酸分子的重组细胞生长。
41.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求6的核酸分子的重组细胞生长。
42.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求8的核酸分子的重组细胞生长。
43.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求9的核酸分子的重组细胞生长。
44.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求10的核酸分子的重组细胞生长。
45.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求11的核酸分子的重组细胞生长。
46.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素部分成熟形式的条件下，使含权利要求12的核酸分子的重组细胞生长。
47.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求13的核酸分子的重组细胞生长。
48.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求14的核酸分子的重组细胞生长。
49.一种生产促神经营养性激素的方法，包括在允许细胞表达并加工嵌合前原蛋白或肽以生产第二种促神经营养性激素成熟形式的条件下，使含权利要求15的核酸分子的重组细胞生长。
50.根据权利要求35或36的方法，其中生产的第二种促神经营养性激素的成熟形式或其部分能够表现出神经营养性活性。
全文摘要
本发明涉及含有神经营养性因子的前原蛋白或前原肽，以及用上述前体和它们的核酸序列生产有一种或多种促神经营养性激素生物活性的蛋白或肽。本发明提供的嵌合前原分子含有与促神经营养性激素序列或其生物活性部分或其衍生物融合的杂合前原区域。根据本发明可以使用的成熟促神经营养性激素序列是包括但不限于NGF、BDNF，NT-3和NT-4的同源分子的NGF/BDNF家庭成员。相似地，可以从包括但不限于NGF，BDNF，NT-3和NT-4的NGF/BDNF家族的那些促神经营养性激素分子中得到前原区域。
文档编号C07K19/00GK1078493SQ92114889
公开日1993年11月17日 申请日期1992年11月14日 优先权日1991年11月14日
发明者S·P·施奎因托, N·叶, D·吉斯, G·D·扬科普洛斯, S·-F·S·胡 申请人:里珍纳龙药品有限公司, 安姆根有限公司