专利名称：用淋巴母细胞样细胞生产天然干扰素α的制作方法
背景技术：
干扰素在许多脊椎动物中均被发现，它似乎是机体非特异性抵抗病毒感染的主要方法。干扰素通常包括一组脊椎动物的糖蛋白和蛋白质，已知具有各种生物活性，例如抗病毒、抗增殖及免疫调节活性。干扰素均为含大约150个氨基酸残基的多肽，将其试用于治疗肝炎、单纯疱疹、感冒甚至瘤，都取得了试验性的效果。然而使用干扰素存在着一个问题费用巨大，这是由于使用传统方法难以获得大量人类干扰素。
干扰素的命名，通常根据产生该物质的动物细胞种类(如人、鼠、牛等)和细胞类型(如白细胞、淋巴母细胞样细胞、成纤维细胞)，偶尔也根据诱导干扰素产生的诱导物的类型来命名(如病毒、免疫)。一些研究者根据诱导方式，将干扰素不严格地区分为I型和II型，前者包括病毒和核酸诱导产生的干扰素，后者包括抗原和分裂素诱导产生被称为淋巴因子的物质。近来，提出了一种系统命名法，该方法根据抗原特异性对干扰素进行分型，根据这种较新的分类系统，α、β、γ干扰素分别相应于原来的白细胞，成纤维细胞和II型(免疫)干扰素。α和β干扰素通常为抗酸性的，即原来所称的I型干扰素，γ干扰素通常为酸不稳定的，即原来所称的II型干扰素。
用干扰素治疗人类及动物疾病，这是全世界的工业和教育机构的很多试验室正在努力研究的内容。在一些最早的研究活动中，干扰素表现出抗病毒特性，迄今干扰素在临床治疗上最成功的应用是用于治疗与病毒有关的疾病。近来，人们发现外源性干扰素能使一些转移性疾病消退或缓解。有关确定干扰素的活性和潜在的治疗用途的研究和进展报告在文献中极多，大多数报告涉及干扰素的体外活性，或肠道外给药、尤其是肌内或皮内给药后的体内试验结果，局部使用和鼻腔内使用有一些成功的报道。
然而干扰素很少采用静脉内给药。这是由于粗制品，甚至高纯分离物中都存在着杂质，这些杂质有广泛的负作用，尽管重组DNA技术的出现使得纯净干扰素的生产成为可能，但以这种纯净成分进行静脉内给药也不是没有副作用和缺点的。
现在供应的干扰素存在着很多问题。目前，市场上可商购的所有品牌和形式的天然干扰素α均来源于活白细胞(白血细胞)，这种细胞的供应须依靠供血者，因此，任何特定生产者的天然干扰素α的生产均受到其所拥有的供血者数量的限制。并且，来自白细胞的天然干扰素α，除了其费用昂贵之外，其供血者的卫生和遗传状况是否合适使得越来越多的使用者及其家属对此日益不安。
本发明的目的之一是提供一种复合物，它能用来保持分化的细胞株，具体地，是能够产生天然人干扰素α的淋巴母细胞样细胞株。发明概述本发明涉及一种新的复合物，以及使用它保持分化的应答淋巴母细胞样细胞株的方法，具体地，该新的复合物是人胎胸腺抽提物。
在人类机体中，T淋巴细胞是干扰素α的来源。淋巴母细胞样细胞是T淋巴细胞的“幼年细胞”，它是存在的多种白细胞之一，淋巴母细胞样细胞赋予T-淋巴细胞产生干扰素α的特性。
通常，干扰素的生产均以芬兰的Cantell最先发明的方法为基础，其方法基本上就是用不同的非致病仙台病毒刺激白细胞，使白细胞产生干扰素成分。
研究者们一直在讲述一种观点在无菌的实验室条件下，用理想的发育抑制auxostatic培养基培养淋巴母细胞样细胞培养物，运用Cantell方法以刺激这些细胞产生干扰素α，而不必由供血者的血细胞中提取干扰素α。
这种生产技术的巨大优越性是显而易见的。首先，生产成本会大幅度下降；其次，这种生产将不受限制，即仅仅受所拥有的空间和设备的限制；第三，生产将可优选地预见，这意味着在标准、理想的实验室条件下，将能有把握地排除污染的可能性，突变系数也成为统计学上可忽略的因素；第四，这种生产将完全不依赖于供血者，最初的起始培养物细胞将来自一批经仔细筛选的供血者的淋巴细胞样细胞组织，除此之外，无需供血者即可生产天然干扰素α，即移植入人工的理想培养基中的这种细胞培养物的预期寿命相当长，可以预见的间隔方便地进行更换。
然而，上述技术一直存在着一个问题，由于细胞被移植入理想的人工环境中后，其功能需求丧失，换言之，细胞移入一持续的最佳培养基后，可谓无功能目的，这种功能的丧失最终会影响其形态，因而，经过四至五个有丝分裂世代以后，这种培养物中的细胞将会丧失他们的分化，转变为四种初始细胞形式之一，他们将不会表现为分化的特化细胞，而从各方面讲都成为了自由迁移细胞，没有现实目的而活着，所有致力于用淋巴母细胞样细胞培养物生产天然干扰素α的研究中都遇到过这个问题。经过一些世代以后，淋巴母细胞样细胞开始失去其分化状态。一旦其形态变化完成，他们对任何刺激因素都无反应。所有试图阻止细胞分化状态的丧失的努力均告失败，人们尝试过多种方法，从酶或化学物质影响到培养基的周期性改变，都没有效果。
本发明提供的方法在于向含淋巴母细胞样细胞培养物的发育抑制培养基，加入天然物质的混合物，以保持细胞的分化状态，具体地，该物质是人胎胸腺的抽提物，使用人胎细胞而不使用分化的成人细胞，是为了保持更活跃的有丝分裂速率，实际上也就能更经济地生产干扰素。通过运用这种技术，淋巴母细胞样细胞不丧失其分化状态，而对Cantell方法中的刺激保持应答，因而，这些培养物确实能生产无限量的天然干扰素α，而完全无需供血者，这种生产是可确切预见的。其产量仅受能得到的空间和技术设备的限制。优选实施方案的详述为设计一种干扰素的系统命名方法而召开了一次国际会议，会议接受了“干扰素”的以下定义作为干扰素，必须是一种通过牵涉RNA和蛋白质的合成的细胞的代谢过程，至少在同源细胞中表现出非特异性的抗病毒活性的蛋白质，本发明中提及的“干扰素”将被认为符合上述定义，它会是一种蛋白质，包括糖蛋白，而不论其来源于何种细胞。
产生的干扰素可来自人或动物细胞培养物，优选实施方案中的干扰素是α或β干扰素。根据本发明，含有修饰的氨基酸序列，但具有类似天然干扰素的活性的蛋白质，也被认为是有用的。本发明中，被选用于临床的产生的干扰素为人白细胞干扰素和淋巴母细胞样细胞干扰素，它们通过如下方法可大量生产采用淋巴母细胞样细胞培养物，通过Cantell方法诱导干扰素产生，随后由培养基中分离干扰素。
将胎胸腺抽提物加入淋巴母细胞样细胞培养物，胸腺来自经仔细的临床筛选后的供血者。胸腺细胞按照外科无菌操作规程进行抽提然后速冻，用能在极低温下操作的特殊碾磨器碾成oo级冰粉，将冰粉在一大底器皿中摊开成一毫米厚的薄层，在真空条件下室温解冻，解冻后，脱水细胞暴露于酸气流中以破坏它们的膜，暴露的淋巴母细胞样(胸腺)细胞进行超离心，以分离其细胞核中所含的DNA。这样获得的物质用无菌生理盐溶液稀释，加入至发育抑制培养基中，该培养基中含有生长于其上的淋巴母细胞样细胞培养物。
成人淋巴母细胞样细胞培养物体外生长期间，以每100升培养物每48小时加入2毫升的量持续加入人胎胸腺抽提物，这样做是为了防止细胞培养物丧失分化状态。该细胞可成功地用于随后的Cantell干扰素分离过程，只要上述胎儿胸腺抽提物不断加入，细胞即不会死亡，可持续进行有丝分裂。
这些细胞随后可用于生产干扰素。人α-干扰素可通过下述方法制备，该方法即通常所称的Cantell方法，其过程始自大量的人白细胞，这些大量细胞的淡黄色层收集于离心管中，以0.83％氯化铵稀释。所得混合物保温15分钟，间歇摇动，随后2000rpm离心20分钟，上清弃去，细胞沉淀以最小量的无菌药品级阿拉伯树胶重悬。所得混合物以氯化铵稀释，离心后弃去上清，剩下的细胞沉淀用最小量的组织培养基重悬，重悬基质可采用来自KC Biological的基本必需培养基(MEM)，细胞浓度以Coulter计数器确定。
干扰素诱导可于玻璃或塑料瓶中进行。诱导培养基包括MEM，75mM Hepes(来自Calbiochem)，75mM Tricine(来自Sigma Chemical co.)，人γ血清(18mg/ml)和硫酸庆大霉素(来自M.A.Bioproducts；50mcg/ml)。将细胞加入诱导容器中至终浓度为每毫升500-1000万个细胞诱导容器于37℃水溶中保温，加入α-干扰素作为引物。
两小时后，将仙台病毒加入诱导混合物中，白细胞在上清中产生α干扰素。保温12-18小时后，诱导混合物离心，细胞弃去，对上清进行纯化。
干扰素粗制品于冰溶中冷至不高于10℃，加入5摩尔硫氰酸钾至终浓度为0.5M，溶液搅动15分钟，然后加入盐酸使其PH降至3.3，混合物于2800rpm离心30分钟，上清弃去。
沉淀随后重悬于95％乙醇中，搅动15分钟，悬浮液于2800rpm离心20分钟，沉淀弃去。所得混合物搅动10分钟，然后于280rpm离心20分钟，沉淀弃去，上清液PH用氢氧化钠调至8。溶液搅动10分钟，随后2800rpm离心20分钟，上清弃去，沉淀用以0.1M磷酸钠缓冲液配制的0.5M硫氰酸钾重悬，悬浮液于4℃搅动。
随后悬浮液于2800rpm离心20分钟，沉淀弃去，上清液PH以盐酸调至5.3，搅动10分钟后离心，上清液PH用盐酸调至2.8，再搅动20分钟。混合物于2800rpm离心，所得沉淀即为纯化的人α-干扰素。
沉淀用以0.1M磷酸钾缓冲液配制的0.5M硫氰酸钾重悬，PH约为8。然后于4℃下对PBS透析，PBS更换两次，所得混合物离心，沉淀弃去，留下的纯化α干扰素径0.2微米滤膜过滤除菌。
当然，还有其他方法可用来制取干扰素。例如美国专利第4376821号和4460685号公开了制取人γ-干扰素的方法。美国专利第4276282号公开了制取淋巴母细胞样细胞干扰素的方法。一种制取牛成纤维细胞(β)干扰素的方法公开于发明人的美国专利第4462985号，干扰素制品可向Hoffmann-LaRoche.Burroughs-Wellcome和Schering-Plough商购，胎胸腺细胞抽提物也可用于这些方法。
权利要求
1.一种淋巴母细胞样细胞培养物，包括处于分化状态的淋巴母细胞样细胞，能应答干扰素产生刺激物产生干扰素；和一种延长所说的淋巴母细胞样细胞的分化状态的复合物，其中该复合物是一种哺乳动物胎儿胸腺的抽提物。
2.权利要求1的细胞培养物，其中哺乳动物胎儿胸腺抽提物是人胎儿胸腺抽提物。
3.权利要求1的细胞培养物，其中刺激物是一种非致病病毒。
4.权利要求3的细胞培养物，其中非致病病毒是仙台病毒。
5.权利要求1的细胞培养物，其中干扰素是干扰素α。
6.权利要求5的细胞培养物，其中干扰素产生刺激物是一种干扰素α产生刺激物。
7.一种保持能产生干扰素的分化的应答淋巴母细胞样细胞株的方法，包括向淋巴母细胞样细胞加入哺乳动物胎儿胸腺抽提物；向淋巴母细胞样细胞引入干扰素产生刺激物。
8.权利要求7的方法，其中哺乳动物胎儿胸腺抽提物是人胎儿胸腺抽提物。
9.权利要求7的方法，其中干扰素产生刺激物是一种非致病病毒。
10.权利要求8的方法，其中非致病病毒是一种仙台病毒。
11.权利要求7的方法，其中干扰素产生刺激物是干扰素α产生刺激物。
12.一种保持分化的应答淋巴母细胞样细胞株的方法，包括向淋巴母细胞样细胞中引入人胎儿胸腺抽提物。
13.一种淋巴母细胞样细胞培养物，包括处于分化状态的淋巴母细胞样细胞，因引入哺乳动物胎儿胸腺抽提物而保持其分化状态。
14.权利要求13的细胞培养物，其中哺乳动物胎儿胸腺抽提物是人胎儿胸腺抽提物。
全文摘要
一种人胎儿胸腺抽提物，将其加入淋巴母细胞样细胞培养物中，能使细胞保持分化状态，对诱导淋巴母细胞样细胞产生干扰素α的刺激物保持应答。
文档编号C07K14/555GK1148342SQ96190195
公开日1997年4月23日 申请日期1996年3月15日 优先权日1995年3月15日
发明者彼得·罗思柴尔德 申请人:彼得·罗思柴尔德