用淋巴毒素(lt)途径抑制物治疗滤泡性淋巴瘤的制作方法

专利名称：用淋巴毒素(lt)途径抑制物治疗滤泡性淋巴瘤的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗肿瘤，尤其治疗生发中心衍生淋巴瘤(滤泡性淋巴瘤)的淋巴毒素途径抑制物的组合物和治疗性应用。
背景技术：
肿瘤坏死因子(TNF)相关细胞因子均可介导宿主防御和免疫调节。该家族的成员以膜锚着形式存在，通过细胞与细胞间的直接接触而局部发挥作用，或作为可扩散至更远目标的分泌蛋白。与之对应的受体家族对这些分子的存在进行信号传导，导致启动靶组织中细胞的死亡或增殖和分化。到目前为止，TNF配体和受体家族已经认识的受体-配体对至少11对，包括TNFTNF-R；LT-αTNF-R；LT-α／βLT-β-R；FasLFas；CD40LCD40；CD30LCD30CD27LCD27；OX40LOX40和4-1BBL4-1BB。
对TNF家族成员的最佳描述是它是免疫系统中控制细胞存活和分化的主要开关。只有TNF和LTα是目前公认的分泌型细胞因子，而TNF家族中的其它成员主要是膜锚着成员。膜形式的TNF已得到很好地鉴别并可能具有独特的生物学意义，而分泌型TNF则可向离触发事件更远处的细胞发出一般性警告信号。因此，TNF的分泌可使事件放大，导致血管内层(vasculature lining)已详尽描述的变化和细胞的炎性状态。与之对照，家族中的膜结合成员只对直接接触的细胞通过TNF型受体传送信号。例如，T细胞只对通过同源TCR相互作用而直接接触的那些B细胞提供CD40介导的“辅助作用”。类似的细胞与细胞直接接触对诱导细胞死亡之能力的限制适用于已得到深入研究的Fas系统。
大多数膜相关LTα／β复合物(“表面LT”)具有LTα1／β2的化学配比。(Browning等，细胞，72，第847-56页(1993)；Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))。表面LT配体与TNF-R不以高亲和力结合，而且不能活化TNF-R的信号传递。但LTβ受体(LTβ-R)能与这些表面淋巴毒素复合物以高亲和力结合(Crowe等，科学264，第707-10页(1994))。
LTβ-R的信号传递象TNF-R的信号传递一样，具有抗增殖效应并对肿瘤细胞有细胞毒性。在申请人的共同未决的美国专利申请流水号08／378，968中，公开了用LTβ-R活化剂选择性刺激LTβ-R的组合物和方法。LTβ-R活化剂对抑制肿瘤细胞生长很有效，但不会协同刺激TNF-R诱导的促炎途径或免疫调节途径。
近期的基因打靶研究提示LTα／β在次级淋巴器官发育中有作用。(Banks等，免疫学杂志，155，第1685-1693页(1995)；De Togni等，科学，264，第703-706页(1994))。事实上，LTα缺陷型小鼠缺乏淋巴结(LN)和淋巴集结(PP)。此外，它们的脾脏体系结构被瓦解，脾边缘区细胞上的功能性标志物的表达被改变。(Banks等，1995；De Togni等，科学，264，第703-706页(1994)，Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。这些特征无一出现在对任一种TNF受体基因敲除小鼠的描述中。(Erickson等，自然，372，第560-563页(1994)；Pfeffer等，细胞73，第457-467页(1993)；Rothe等，自然，364，第798-802页(1993))。申请人最近的研究显示，在怀孕期接受了可溶形式的、与人类IgG1 Fc部分融合的小鼠LTβ-R(LTβ-R-Ig)注射的小鼠，其后代缺乏大部分淋巴结并显示脾脏结构瓦解，从而确定了膜LTα／β复合物在次级淋巴器官发育中的作用。(Rennert等，1996，“表面淋巴毒素α／β复合物是外周淋巴器官发育所必需的”，实验医学杂志，1841999-2006)。在另一项研究中，在出生3天后开始表达的类似LTβ-R-Ig构建体的转基因小鼠显示有LN。但它们的脾脏结构被瓦解，而且脾边缘区细胞的数种标志物没有表达(Ettinger等，“表达可溶性LTβ-R／IgG1融合蛋白的小鼠体内脾脏结构被瓦解，但有正常的淋巴结发育”，美国国家科学院学报，9313102-7)。所有这些数据说明，对膜LT功能有一个时间性要求，以达到对次级淋巴器官发育的影响，但对脾脏结构的作用没这样的要求。
TNF系统还可能在脾脏的发育中起作用。TNF缺陷型小鼠的脾边缘区细胞不表达巨噬细胞标志物或MAdCAM-1(Alexopoulou等，第60届国际TNF大会，欧洲细胞因子网络，第228页(1996)；Pasparakis等，第60届国际TNF大会，欧洲细胞因子网络，第239页(1996))。TNF-R55缺陷型小鼠脾边缘区也缺乏MAdCAM-1染色(但不缺乏MOMA-1)。(Neumann等，实验医学杂志，184，第259-264页(1996)，Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。如在TNF-R75缺陷型小鼠脾脏中所见，这些标志物的表达表现正常。(Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996))。
淋巴样组织不只作为发育过程的一部分而产生，还在某些病理情况如慢性炎症，一种最近称为新淋巴器官发生(neolymphoorganogenesis)的过程中出现。(Picker＆Butcher，免疫学年鉴，10，第561-591页(1992)，Kratz等，实验医学杂志，183，第1461-1471页(1996))。TNF家族成员明显对这类过程有影响。由大鼠胰岛素启动子驱动的LTα基因(RIP-LT)的转基因小鼠出现LT诱导的慢性炎性损伤，其特征为出现有组织的淋巴组织。(Kratz等，实验医学杂志，1183，第1461-1471页(1996)；Picarella等，美国国家科学院学报，89，第10036-10040页(1992))。
用LTα缺陷型小鼠对依赖T细胞的免疫应答期间LT功能的评估显示，LT对于GC形成、可能维持有组织的滤泡树突细胞(FDC)结构和体液免疫应答是必需的。(Banks等，免疫学杂志，155，第1685-1693页(1995)；Matsumoto等，科学，271，第1289-1291页(1996)；Matsumoto等，自然，382，第462-466页(1996))。TNF-R55缺陷型小鼠也缺乏FDC，不能形成GC，也不能对绵羊红细胞(SRBC)产生最佳抗体应答。这说明，在大多数这类应答中，TNF-R55可能通过可溶性LT或TNF信号而被触发(Le Hir等，实验医学杂志，183，第2367-2372页(1996)，Alexopoulou等，第60届国际TNF大会，欧洲细胞因子网络，第228页(1996)；Pasparakis等，第60届国际TNF大会，欧洲细胞因子网络，第239页(1996))。
LTβ受体，作为TNF家族的受体成员，可特异性结合表面LT配体。LTβ-R可结合LT异聚体复合物(主要是LTα1／β2和LTα2／β1)但不结合TNF或LTα(Crowe等，科学，264，第707-10页(1994))。LTβ-R mRNA在人类脾脏、胸腺和与免疫系统有关的普通器官中出现。尽管对LTβ-R表达的研究还处于早期，LTβ-R表达模式似乎与TNF-R55的有关报道相似，只是LTβ-R很少在外周血T和B细胞以及T和B细胞系中出现。
细胞表面淋巴毒素(LT)复合物已在表达高水平LT的CD4+T细胞杂交瘤细胞(II-23．D7)中得到鉴别(Browning等，免疫学杂志，147，第1230-37页(1991)；Androlewicz等，生物化学杂志，267，第2542-47(1992)，两篇文献均全文引入本文作为参考)。LTβ-R、LT亚单位和表面LT复合物的表达和生物学功能已由C．F．Ware等，“淋巴毒素系统的配体和受体”，在细胞裂解途径，微生物学及免疫学最新课题一书中，Springer-Verlag，第175-218页(1995)综述，特别引入本文作为参考。
LTα的表达受诱导，LTα主要由活化T淋巴细胞和B淋巴细胞以及自然杀伤(NK)细胞分泌。在T辅助细胞群中，LTα似乎由Th1而非Th2细胞产生。LTα也可在黑色素细胞中测出。多发性硬化症病人损伤处的小神经胶质细胞和T细胞也可用抗LTα抗血清染色(Selmaj等，临床调研杂志，87，第949-954页(1991))。
淋巴毒素β(亦称p33)表达在人类和小鼠T淋巴细胞、T细胞系、B细胞系和淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)的细胞表面。LTβ是申请人的共同未决的、于1992年1月9日作为WO92／00329公开的国际专利申请PCT／US91／04588和于1994年6月23日作为WO94／13808公开的国际专利申请PCT／US93／11669(均引入本文作为参考)的主题。
表面LT复合物主要由活化的T淋巴细胞(T辅助细胞、Th1和杀伤细胞)和B淋巴细胞以及自然杀伤细胞(NK)表达，如FACS分析或用抗LT抗体或可溶性LTβ-R-Ig融合蛋白进行的免疫组化分析所确定的那样。在申请人共同未决的于1995年7月21日提交的美国专利申请流水号08／505，606中，公开了用可溶性LTβ受体和抗LTβ受体和配体特异性抗体作为治疗剂用于治疗由Th1细胞介导的免疫性疾病的组合物和方法。表面LT还出现在人类细胞毒T淋巴细胞(CTL)克隆上、活化的外周血单核淋巴细胞(PML)上、IL-2活化的外周血淋巴细胞(LAK细胞)上、美洲商陆有丝分裂原活化的或抗CD40活化的外周血B淋巴细胞(PBL)上和T、B细胞谱系的各种淋巴样肿瘤上。带同种抗原的靶细胞的参与通过CD8+和CD4+CTL克隆而特异性诱导表面LT表达。
申请人已在本文中描述了表面LT的数种免疫学功能，并显示了LTα／β结合剂对免疫球蛋白应答的产生和特征、次级淋巴组织细胞组构的维持(包括对滤泡树突细胞分化状态的影响以及对生发中心形成的影响)、及影响细胞交流的地址素(addressin)表达水平的效应。申请人说明了表面LTα／β以及LTα受体结合剂的治疗性应用。
研究表明，B细胞遇到各种抗原后在淋巴结(LN)和脾脏中活化。在称为生发中心、形成于LN和脾脏的B细胞富集区的特殊结构中，B细胞变得成熟并形成记忆性B细胞1。B细胞在其发育阶段的大多数时候可转化成肿瘤2。B细胞的转化导致淋巴瘤，那些由生发中心的B细胞衍生的淋巴瘤常称为滤泡性淋巴瘤。对各种淋巴瘤亚型的准确描述仍在变化，因为越来越多的表面标志物被发现，使得可对细胞起源作更精确的命名。滤泡性淋巴瘤可根据B细胞增殖的阶段或类型分为数个亚群，其预后因细胞类型的不同而各异。常规化疗方案能使大多数有低级类型细胞的病人治愈。然而，这些病人中一部分对化疗不敏感，预后很差。
因此，尽管对肿瘤的治疗已取得一定进展，仍需要针对通常抗化疗的那些肿瘤，尤其滤泡性淋巴瘤的治疗方法，还需要相对于现有治疗具有较小副作用的治疗方案。
发明简述本发明提供用于治疗肿瘤如滤泡性淋巴瘤的方法和组合物，它们克服了现有治疗的某些问题，并为抗传统化疗的肿瘤病人提供了替代疗法。
在特定实施方案中，要求保护的本发明涉及对患有滤泡性淋巴瘤的受试者进行治疗的方法，该方法包括给予受试者有效量的、可阻断LT-α／β异聚体与其受体相互作用的组合物。各种实施方案中优选的组合物包括，但不限于，可溶性淋巴毒素-β受体、针对LT-β受体的抗体、以及针对表面LT配体的抗体。更优选为带有可选择性结合表面LT配体的配体结合区的可溶性淋巴毒素-β受体，如与人类免疫球蛋白Fc区融合的可溶性LTβ-R形式。另外，优选的组合物包括针对LT-β受体的单克隆抗体，包括人源化抗体、嵌合抗体或其它已改变形式的抗体。
在本发明的其它实施方案中，所要求专利保护的权利包括对患有滤泡性肿瘤的受试者进行治疗的方法，其中持续给予阻断剂直至发现肿瘤退化或肿瘤生长受抑制为止。在某些实施方案中，LT途径的阻断剂与其它已知可用于处理肿瘤的试剂，如化疗剂联合应用。此外，本发明的方法可能在某些实施方案中进一步包含对受试者进行放疗或骨髓移植。
在其它实施方案中，所要求专利保护的方法包括联合给与LTβ-R阻断剂与TNF家族其它成员的途径阻断剂。例如，TNF阻断剂可与已要求权利的本发明的阻断剂同时或相继联合给药。
发明详述本发明提供用于治疗肿瘤，如滤泡性肿瘤，尤其滤泡性淋巴瘤的方法和组合物。
术语“免疫球蛋白应答”或“体液应答”在本文中指动物针对外来抗原产生相应抗体的免疫应答。T辅助细胞中Th2亚类对高亲和力抗体的有效产生十分重要。
术语“生发中心”在本文中指抗原免疫后形成的次级B细胞滤泡。这一组织学部位的出现与最佳记忆的产生、同种型转换、体细胞超变和因此而致的抗体应答的亲和力成熟有关。
术语“边缘区”或“边缘区类型区域”指组织学描述的次级淋巴组织区间，主要包括边缘区巨噬细胞(MZM)、嗜金属巨噬细胞(MM)、边缘区B细胞和网状细胞，以及T细胞和树突细胞。动脉血流经边缘窦，从而使抗原直接接触这些细胞并在此部位刺激针对抗原的细胞反应。
术语“T辅助(Th)细胞”在本文中指T细胞中辅助产生细胞毒T细胞并与B细胞合作刺激抗体产生的功能性亚类。辅助T细胞识别II类MHC分子相关性抗原并向效应细胞提供接触依赖性和接触非依赖性信号(细胞因子)。
术语抗体的“Fc区”指该分子中包含铰链区、CH2区和CH3区，但缺乏抗原结合位点的部分。该术语还包括IgM或其它同种型抗体等价区。
术语“抗LTβ受体抗体”指特异性结合LTβ受体至少一个表位的任何抗体。
术语“抗LT抗体”指特异性结合LTα、LTβ或LTα／β复合物的至少一个表位的任何抗体。
术语“LTβ-R信号传递”指与LTβ-R途径有关的分子反应和由此引起的后续分子反应。
术语“LTβR阻断剂”指能减少配体结合LTβ-R、细胞表面LTβ-R聚集或LTβ-R信号传递，或可影响LTβ-R信号在细胞内的编辑过程的试剂。
在配体-受体结合时发挥作用的LTβ-R阻断剂可使LT配体与LTβ-R的结合抑制至少20％。LTβ-R阻断剂的实例包括可溶性LTβ-R-Fc分子、抗LTα、抗LTβ、抗LTα／β和抗LTβ-R的抗体。优选地，这些抗体不与分泌型LTα交叉反应。
术语“LTβ-R生物活性”指1)LTβ-R分子或衍生物与可溶性或表面LTβ-R分子竞争结合可溶性或表面LT配体的能力；或2)天然LT活性如刺激免疫调节应答或细胞毒活性的能力。
术语“LT配体”指可特异性结合LTβ受体的LTα／β异聚体复合物或其衍生物。
术语“LTβ-R配体结合区”指LTβ-R上涉及特异性识别LT配体以及与LT配体相互作用的一个或多个部分。
术语“表面LT”和“表面LT复合物”指展示于细胞表面上的包含LTα和膜结合LTβ亚单位…包括一或多种亚单位的突变体、修饰形式或嵌合形式…的复合物。“表面LT配体”指可特异性结合LTβ受体的表面LT复合物或其衍生物。
术语“受试者”指动物，或来自动物的一或多个细胞。优选该动物是哺乳动物。细胞可以是任何形式，包括但不限于保留在组织中的细胞、细胞簇、无限增殖细胞、转染细胞或转化细胞、来自已被生理性或表型性改变之动物的细胞。
如上述，B细胞的转化导致淋巴瘤，生发中心(淋巴结和脾脏的B细胞富集区中发现的特殊结构)衍生的B细胞的转化均称为滤泡性淋巴瘤。生发中心B细胞的成熟和增殖需要特定环境，而滤泡树突细胞为生发中心的B细胞提供抗原并很可能还有可触发成熟、存活和增殖的特定信号。对可自发形成网状细胞肉瘤(RCS，这类肿瘤的早期命名)的SJL小鼠的研究得到可移植也可体外生长的RCS细胞系(CRCS)，它们可作为宿主与肿瘤相互作用的模型3，4。这些RCS常在SJL小鼠的LN中发生并常为异质性，其中包含各种造血干细胞。很多迹象表明，这些淋巴瘤均源自生发中心，并需要由宿主提供各种信号或因子才能存活和增殖5，6。对这些存活信号进行处理的能力为控制这些肿瘤的生长提供了一种方法。
据信一种称之为滤泡树突细胞(FDC)的细胞类型在生发中心的形成和功能中起最重要作用。已知很多不同因素涉及生发中心B细胞的存活和维持。值得注意的是，细胞因子中TNF家族成员均为信号传递的表面配体，均相关于B细胞侧如CD40和FDC侧如TNF以及淋巴毒素(LT)受体。有LT或TNF轴缺陷的小鼠，其FDC也有缺陷并因此缺乏生发中心7。据信TNF轴是FDC发育的关键，但可能还有下游作用。LT轴似乎对维持FDC的功能状态更为关键。LT系统涉及将信号从各种配体阳性淋巴细胞传递至很可能是非骨髓来源，即可能是FDC衍生的受体阳性细胞，从而使FDC保持具有完全功能的成熟状态。申请人发现，用如LT配体的抗体或可溶性受体-免疫球蛋白融合蛋白阻断这一途径，可导致成熟FDC的丧失(Mackay＆Browning，1998自然，第395卷，第26-27页，“关闭滤泡树突细胞”)。此外，对LT途径的抑制将导致生发中心不能形成以及脾脏的某种程度的瓦解8。
申请人首次在本文中称，LT途径抑制物可阻断滤泡性B细胞淋巴瘤与其环境，即FDC间的相互作用，并使肿瘤生长减慢或受阻。因此，这类抑制物可用于处理难治的淋巴瘤或作为主要疗法，或作为传统化疗方案的补充疗法。特别地，尽管本领域有人提出，肿瘤治疗中可以涉及LT途径的活化，但申请人很惊讶地发现，对LT途径的暂时性阻断可使肿瘤，包括如滤泡性淋巴瘤的生长减慢或受阻。
本发明的范围较广的实施方案中包含有对患肿瘤或淋巴瘤，特别是滤泡性淋巴瘤的受试者，通过给予有效量的、可抑制LT途径的组合物而进行治疗的方法。具有的抑制组合物可包括可溶性LT-β受体、含LTβ-R的融合蛋白、LTβ-R的抗体和LT配体的抗体。这类抑制组合物优选包括药学可接受的载体。优选应用中的受试者为哺乳动物，更优选为人类。
本发明的方法包括，对受试者给予本发明的组合物直至肿瘤出现一定程度的退化或抑制。治疗时间差异很大，整个疗程可能持续数周至数月，或对某些病例可能时间更长。本领域技术人员能确定何时肿瘤出现退化或受阻，并且任何已知方法均可使用。用FACS标志物对B淋巴瘤的进一步亚型分类已大大改进，可以预计某些亚型的淋巴瘤对这类治疗可能很敏感。
其它免疫系统调节分子如TNF家族其它成员也可能与免疫器官结构的维持有关，并因此可为淋巴瘤增生提供适宜环境。因此，对LT和其它途径的联合抑制可能对某些受试者是有效治疗。例如，有的人可以结合使用LT途径抑制物及例如，CD40／CD40配体途径的阻断剂。可阻断目标途径的任何组合物均可应用，如，抗体、可溶性配体或受体。优选将LT途径抑制物与抗CD40配体之抗体联合给药。若给予TNF成员途径的不止一种阻断剂，则这些组合物可基本同时给予，或者，一种阻断剂可紧随另一种阻断剂给予。本领域技术人员可很容易根据待治疗的具体肿瘤以及受试者的情况确定针对具体受试者的最有效治疗。
常规化疗方案可用来消除本发明组合物治疗后残余的肿瘤实体，或在某些病例中二者可同时使用，或在本发明组合物之前使用。LT途径抑制物可在开始常规化疗方案之前用于阻止淋巴瘤生长。似乎生长／存活刺激信号的丧失可使淋巴瘤对化疗剂更敏感，因此优选在给予传统化疗剂之前先给予LT途径抑制物。
实施例1用LT途径抑制物治疗SJL RCS肿瘤，使总LN／肿瘤体积减小用0．3-0．4mg小鼠LTBR-hIgG1融合蛋白经腹膜内给药途径处理SJL小鼠，给药在肿瘤移植的3天前(D-3)，移植当天(D0)，或移植的3天后(D3)进行。肿瘤移植基本按文献进行9。5×106个已耗尽T细胞的RCS细胞经静脉注射，使之接种于器官内并生长。5-7天后，解剖肠系膜LN、臂LN和腋下LN并计算它们的重量相对于总体重的百分率。表I显示，所有实验中LN大小均减小。3项实验中有1项脾脏的大小也减小，但脾脏重量的减少不明显。LN重量的减小从单剂治疗的约50％至多剂治疗的80-90％不等。
表ILTBR-Ig对正常SJL小鼠体内RCS生长的抑制效应用以下药物注射的小鼠(天剂量mg) LNWta(n) p 脾脏重量a(n) p实验1huIgG对照(5天后处死) 2．70+／-0．37(7) 3．18+／-0．37(7)mLTβR-Igc(D 0，+30．4，0．3) 1．42+／-0．15(4)＜0001 3．29+／-0．18(4) NSb实验2huIgG对照(7天后杀死) 3．35+／-0．21(3) 4．04+／-0．34(3)mLTβR-Ig(D 0，+3；0．3，0．2) 2．37+／-0．24(4)0．00243．04+／-0．19(4) 0．004↓实验3huIgG对照(6天后杀死) 2．34+／-0．11(5) 2．93+／-0．57(5)mLTβR-Ig(D-30．4) 1．10+／-0．38(3) 0．0024 2．27+／-1．39(3) NSmLTBR-Ig(D-3，00．4，0．3) 0．78+／-0．02(3)＜0．0001 3．95+／-0．53(3) 0．046↑mLTβR-Ig(D00．3) 0．92+／-0．10(3)＜0．0001 3．25+／-0．15(3)NSa以总体重百分率表示的器官重量。未处理的LN重量通常为总体重的0．5％。
bNS=不显著。
cmLTBR-Ig为mLTBR胞外区与hIgG1的CH2和CH3区的融合蛋白。
在其它实施方案中，可同时、或先于或后于放疗而给予LT途径的抑制物。对本领域技术人员而言，根据个体差异如病人的情况和待治疗的肿瘤，何为优选疗法是很明显的。
抑制性抗LTβ-R抗体和其它LT-β-R阻断剂可用本领域前述方法鉴定。(共同未决的美国专利申请流水号08／378，968)。
本发明一个实施方案中的LTβ-R阻断剂包含可溶性LT-β受体分子。已知人类LTβ-R胞外部分的序列编码配体结合区(见

图1)。应用图1所示序列资料及本领域已知的重组DNA技术，可将编码LTβ-R配体结合区的功能性片段克隆至载体中并在适当宿主中表达，从而产生可溶性LTβ-R分子。
包含选自图1所示氨基酸序列的可溶性LT-β受体可连接一或多个异源蛋白区(“融合区”)以提高受体融合蛋白的体内稳定性，或调节其生物活性或定位。
优选地，可用稳定的血浆蛋白(通常血循环半衰期超过20个小时)构建受体融合蛋白。这类血浆蛋白包括但不限于免疫球蛋白、血清白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白和转铁蛋白。还可将能够引导可溶性LTβ-R分子靶向特定类型细胞或组织的序列与LTβ-R配体结合区连接以产生特异性定位的可溶性LTβ-R融合蛋白。
包含LTβ-R配体结合区的LTβ-R整个胞外区或其功能性部分(图1)可与免疫球蛋白恒定区如人类IgG1重链Fc区融合(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))。优选可溶性受体-IgG融合蛋白，它们是常用的免疫学试剂，它们的构建方法为本领域已知(参见如，已全文引入作为参考的美国专利第5，225，538号)。
功能性LTβ-R配体结合区可与衍生自除IgG1以外的其它免疫球蛋白类或亚类的免疫球蛋白(Ig)Fc区融合。抗体中属于不同Ig类或亚类的Fc区可活化多种次级效应物的功能。活化作用发生在Fc区被相应Fc受体结合时。次级效应物功能包括活化补体系统的能力、通过胎盘的能力及与各种微生物蛋白质结合的能力。
损伤或杀死带LT配体的靶细胞如果是有利的，则可选择活性很强的Fc区(IgG1)制备LTβ-R-Fc融合蛋白。或者，若希望将LTβ-R-Fc融合体靶向细胞而不激活补体系统，则可选择失活的IgG4 Fc区。
使结合Fc受体和活化补体的能力减小或消除的Fc区突变已有报道(S．Morrison，免疫学年鉴，10，第239-65页(1992))。这些或其它突变可单独或联合应用，以使用于构建LTβ-R-Fc融合蛋白的Fc区具有最佳活性。
构成受体-Ig融合蛋白连接点的不同氨基酸残基可改变可溶性LT-β受体融合蛋白的结构、稳定性及最终生物活性。可在所选LTβ-R片段的C末端添加一或多个氨基酸以修饰与所选融合区的连接点。
LTβ-融合蛋白的N末端的变化也可通过改变所选LTβ-R DNA片段5’端将被切割以插入重组表达载体的位点而实现。每种LTβ-R融合蛋白的稳定性和活性可进行检验，并用常规实验和用于筛选本文所述LTβ-R阻断剂的试验优化。
应用图1所示LTβ-R胞外区内部的配体结合区序列，还可构建氨基酸序列变体以改变可溶性LT-β受体或融合蛋白对LT配体的亲和力。本发明可溶性LTβ-R分子可与内源性细胞表面L1-β受体竞争结合表面LT配体。可以理解，包含可与细胞表面LT-β受体竞争结合LT配体的LTβ-R配体结合区的任何可溶性分子即是包括在本发明范围内的LTβ-R阻断剂。
在本发明的另一实施方案中，针对人类LT-β受体的抗体(抗LT-β-R抗体)可作为LTβ-R阻断剂发挥作用。本发明的抗LTβ-R抗体可以是多克隆或单克隆形式(mAb)，并可经修饰使它们的阻断LTβ-R信号传递之能力、体内生物可用性、稳定性或其它所需特性最优化。
针对人类LT-β受体的多克隆抗体血清可用常规技术制备，即对诸如山羊、兔、大鼠、仓鼠或小鼠之类的动物皮下注射人类LT-β受体-Fc融合蛋白(实施例1)的完全弗氏佐剂制剂，接着用不完全弗氏佐剂制剂经腹膜内或皮下加强注射。含所需针对LT-β受体之抗体的多克隆抗血清通过常规免疫学方法筛选。
针对人类LT-β受体-Fc融合蛋白的小鼠单克隆抗体(mAb)如实施例5所述制备。产生小鼠抗人LT-β-R mAb BDA8的杂交瘤细胞系(BD．A8．AB9)已根据布达佩斯条约的规定，于1995年1月12日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD)，保藏号为ATCC录入号HB11798。对公众使用上述ATCC保藏物的所有限制在本专利申请得到授权后都将不复存在。
应用标准的重组DNA技术还可制备抗LTβ-R抗体的各种形式(Winter＆Milstein，自然，349，第293-99页(1991))。例如，可构建“嵌合抗体”，其中将动物抗体的抗原结合区与人类恒定区相连(如Cabilly等，美国专利第4，816，567号；Morrison等，美国国家科学院学报，81，第6851-55页(1984))。嵌合抗体可减少动物抗体用于人类临床治疗时出现的免疫应答。
此外，可合成识别LT-β-R的重组“人源化抗体”。人源化抗体是主要包含人类IgG序列、但其中已插入了负责特异性抗原结合的区域的嵌合体(如WO94／04679)。用所选抗原免疫动物、分离相应抗体、取出可变区序列中负责特异性抗原结合的部分。然后将动物源性抗原结合区克隆至已删除抗原结合区的人类抗体基因中的相应部位。人源化抗体使人类抗体中异源(种间)序列的应用减至最小，更不太可能在接受处理的受试者体内激发免疫应答。
不同类重组抗LT-β-R抗体的构建还可通过制备包含抗LT-β-R可变区和分离自不同类免疫球蛋白的人类恒定区(CHl、CH2、CH3)的嵌合抗体或人源化抗体而完成。例如，可将抗原结合位点克隆至携带人类T链恒定区的载体中而重组产生抗原结合位点价数增加了的抗LT-β-R IgM抗体(Arulanandam等，实验医学杂志，177，第1439-50(1993)；Lane等，欧洲免疫学杂志，22，第2573-78页(1993)；Traunecker等，自然，339，第68-70页(1989))。
此外，可用标准的重组DNA技术改变抗原结合位点邻近的氨基酸残基，从而改变重组抗体与它们的抗原相结合的亲和力。人源化抗体的抗原结合亲和力可通过基于分子模拟的诱变技术而提高(Queen等，美国国家科学院学报，86，第10029-33页(1989)；WO94／04679)。
可能需要根据所靶向组织类型或所预计的具体治疗方案而增大或减小抗LTβ-R抗体对LTβ-R的亲和力。例如，用恒定水平的经由LT-β途径传递信号的能力降低的抗LTβ-R抗体治疗病人将有利于半预防性治疗。相似地，对LTβ-R亲和力增加的抑制性抗LTβ-R抗体将有利于短期治疗。
抗LT-β-R抗体作为LT-β-R阻断剂可通过测试对肿瘤细胞中LTβ-R所诱导的细胞毒性进行抑制的能力筛选可作为LTβ-R阻断剂的抗LT-β-R抗体。应用常规实验和本文所述试验测试针对人类LTβ受体的其它抗体，有可能鉴别人类中具有LTβ-R阻断剂功能的其它抗LT-β-R抗体。
本发明另一优选实施方案涉及包含针对LT配体、可作为LT-β-R阻断剂的抗体的组合物和方法。如上有关抗LTβ-R抗体之述，可作为LTβ-R阻断剂的抗LT配体抗体可以是多克隆或单克隆形式，并可按常规方法修饰它们，以调整其抗原结合特性和免疫原性。
本发明的抗LT抗体可只针对两种LT亚单位中的任一种产生，包括可溶性、突变型、修饰的和嵌合形式的LT亚单位。若LT亚单位作为抗原使用，优选它们是LT-β亚单位。若应用LT-α亚单位，优选所得抗LT-α抗体可结合表面LT配体且不与分泌型LT-α有交叉反应，并不能调节TNF-R活性。
或者，可产生针对包含一或多个LT亚单位的同聚体(LT-β)或异聚体(LT-α／β)复合物的抗体，并筛选它们作为LT-β-R阻断剂的活性。优选地，用LT-α1／β2复合物作为抗原。如上述，优选所得抗LT-α1／β2抗体可与表面LT配体结合、不与分泌型LT-α结合、不影响TNF-R活性。
多克隆抗人类LT-α抗体的产生如申请人的共同未决的专利申请(WO94／13808)所述。单克隆抗LT-α抗体和单克隆抗LT-β抗体已有文献描述(Browning等，免疫学杂志，154，第33-46页(1995))。
化合物可用于本发明方法的治疗性化合物包括可阻断LT-β与LT-β受体相互作用并因此抑制LT途径的任何化合物。具体涉及的抗LT化合物包括多克隆抗体和单克隆抗体(mAb)，以及抗体衍生物如嵌合分子、人源化分子、效应物功能减弱的分子、双特异性分子以及抗体的偶联物。
本发明还包括抗LT-β和抗LT-β受体的其它类型，如能阻断LT途径的完整Fab片段、F(ab’)2化合物、VH区、Fv区、单链抗体(参见如WO96／23071)、多肽、多肽的融合构建体、LT-β受体的融合体、以及小分子化合物如小分子半肽化合物或非肽化合物。
用标准的重组DNA技术还可产生抗体的各种形式(Winter＆Milstein，自然，349，第293-99页，1991)。例如，可构建“嵌合抗体”，其中动物抗体来源的抗原结合区与人类恒定区相连(最初来自非人类哺乳动物的抗体，其中应用重组DNA技术使铰链区和重链恒定区和／或轻链恒定区的全部或部分由人类免疫球蛋白轻链或重链的相应区取代)(参见如，Cabilly等，美国专利第4，816，567号；Morrison等，美国国家科学院学报，81，第6851-55页，1984)。嵌合抗体可减少动物抗体用于人类临床治疗时激发的免疫应答。
此外，可合成重组“人源化”抗体。人源化抗体是最初衍生自非人类哺乳动物的抗体，但其中应用重组DNA技术使与抗原结合无关的部分或所有氨基酸被人类免疫球蛋白轻或重链相应区的氨基酸取代(主要包含人类IgG序列、而其中已插入负责特异性抗原结合的区域的嵌合体)(参见如PCT专利申请WO94／04679)。用所选抗原免疫动物、分离相应抗体、去除可变区序列中负责特异性抗原结合的部分。然后将动物源性抗原结合区克隆至已删除抗原结合区的人类抗体基因的适当部位。人源化抗体使人类抗体中异源(种间)序列的应用减至最小，更不太可能在接受处理的受试者体内激发免疫应答。
本发明的方法和组合物中还可应用灵长类抗体或灵长类化抗体。
本发明的方法和组合物中还可应用抗体片段和单价抗体。单价抗体包含与第二重链Fc(或主干)区结合的重链／轻链二聚体。Fab区指与包含重链Y分支部分的序列和完整轻链序列大体相当或类似，且相连(聚集)后可表现抗体活性的链部分。Fab蛋白包括一条重链与一条轻链的聚集体(通常称为Fab’)，还包括相应于Y型抗体两个分支区段的四聚体(通常称为F(ab)2)，上述各种类型可以是共价或非共价聚集，只要聚集体可与特定抗原或抗原家族选择性反应即可。
此外，可用标准的重组DNA技术改变抗原结合位点邻近区的氨基酸残基，从而改变重组抗体与它们的抗原结合的亲和力。
受试者本发明方法针对的受试者患有滤泡性淋巴瘤。
给药途径本发明的化合物可用医学上能接受的任何方式给药。这包括经非胃肠道途径如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌肉内、肿瘤内、腹膜内、心室内、硬膜外表皮内(intraepidural)注射、或其它方式如口服、鼻内、眼内、直肠、或局部给药。本发明还特别包括缓释给药，如缓释型注射。LT阻断化合物的某些形式适于口服给药，可制成悬液或药丸剂型。
治疗剂量及频率对一种具体的免疫复合物疾病，给病人施用任何特定化合物的量和用药频率应由病人的医生根据很多因素作出判断。一般性剂量由临床前和临床期试验(包括用以确定化合物不同剂量对病人的有利和有害影响的大量试验)确立。甚至在有了这类建议后，医生还根据不同病人情况的变化，如病人年龄、病情、体重、性别、及同时用于治疗的其它药物而改变这些剂量。对用于治疗滤泡性淋巴瘤的每种LT阻断化合物最佳剂量进行确定是医药领域技术人员的常规工作。
一般，用药频率由主治医师确定，可以只用一剂、或每日重复给药、间隔2-6天、每周一次、两周一次或每月一次给药。
根据本发明的治疗滤泡性淋巴瘤的联合疗法中，可联合使用靶向这类淋巴瘤的其它方法，包括如放疗、化疗或本领域技术人员已知的其它疗法。
本发明的LT阻断化合物可以药学可接受之组合物的形式施用于病人，其中该组合物包括药学可接受的载体。这类载体在阻断化合物或其它活性组分保持有效活性的相应浓度下对病人相对无毒性并且无害，从而使载体可能带来的任何副作用不会损及组合物中活性组分的有利效应。组合物中可包括其它相容性物质；相容，在本文中指药物组合物的组分能与LT阻断化合物混合，并相互混合，其混合方式不会对药物的治疗效力造成实质性的不利影响。本发明适于口服的制剂可以是离散单位的形式，如胶囊、扁形蚀囊剂、片剂、丸剂或锭剂，它们各包含预定量的强效化合物粉末或颗粒；或者是脂质体形式；或含水或非水性液体中的悬液，如糖浆、酏剂、乳剂或饮剂。
本发明的组合物可包装在容器中以适于维持无菌，在经销和贮存期间保护有效组分的活性，并使组合物便于对病人施用并达到有效部位。如果LT阻断化合物是可注射剂型，则供应时可装在适于用针或注射器抽出内容物的塞紧小瓶中。小瓶既可单独使用，也可多次使用。组合物也可以预装填的注射器形式提供。在某些例子中，内容物可为液体剂型，其它例子中可提供为干燥或冻干形式，此时需用标准的或配备的稀释剂恢复成液体状态。如果化合物以用于静脉注射的液体形式提供，则它可提供在适于与静脉用药线或导管连接的无菌袋或容器中。如果阻断化合物是口服的片剂或丸剂形式，则可提供在带有可取下之盖子的小瓶中。容器上应标明相关信息，如化合物类型、厂家或经销商名称、说明书、建议剂量、正确保存的建议、或用药建议。
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序列表SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度197个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑构型线性(ii)分子类型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Ser Gln Pro Gln Ala Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys1 5 10 15Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys Cys20 25 30Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile35 40 45Arg Asp Thr Val Cys Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His50 55 60Trp Asn Tyr Leu Thr Ile Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val65 70 75 80Met Gly Leu Glu Glu Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln85 90 95Cys Arg Cys Gln Pro Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys100 105 110Thr His Cys Glu Leu Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu115 120 125Leu Lys Asp Glu Val Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys130 135 140Ala Gly His Phe Gln Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro145 150 155160His Thr Arg Cys Glu Asn Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr165 170 175Ala Gln Ser Asp Thr Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro180 185 190Glu Met Ser Gly Thr19权利要求
1．一种抑制或减缓肿瘤的进展、严重性或影响的方法，该方法包括给予受试者有效量的可抑制LT-β与其受体间相互作用的组合物。
2．权利要求1的方法，其中所述肿瘤是滤泡性淋巴瘤。
3．权利要求2的方法，其中所述组合物选自下组可溶性LT-β受体、抗LT-α抗体、抗LT-β抗体和抗LT-β-R抗体。
4．权利要求3的方法，其中所述组合物是可溶性LT-β受体。
5．权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
6．权利要求5的方法，其中所述受试者是人类。
7．权利要求4的方法，其中可溶性淋巴毒素-β受体包含可选择性结合表面LT配体的配体结合区。
8．权利要求7的方法，其中LT-β受体包含人类免疫球蛋白Fc区。
9．权利要求3的方法，其中所述组合物包含针对LT-β受体的单克隆抗体。
10．权利要求9的方法，其中所述单克隆抗体为人源化或嵌合型抗体。
11．可阻断LT-β与其受体的相互作用、可用于治疗患有滤泡性淋巴瘤的受试者的一种组合物。
12．权利要求1的方法，其中包括给予所述受试者至少一种化疗剂。
13．权利要求1的方法，其中包括给予所述受试者另一TNF途径的抑制物。
14．权利要求13的方法，其中包括施用可抑制CD40／CD40配体途径的组合物。
15．权利要求14的方法，其中包括施用抗CD40配体的抗体。
16．权利要求1的方法，其中包括对所述受试者进行放射治疗。
17．权利要求1的方法，其中进一步包括对所述受试者进行放射治疗或骨髓移植。
18．一种改变受试者体内滤泡树突细胞的存活力或维持力的方法，包括施用LT-β与其受体间相互作用的抑制物。
19．一种改变免疫系统器官的结构的方法，包括施用(a)LT-β与其受体间相互作用的抑制物；和(b)TNF配体和受体家庭另一成员的信号传递途径的抑制物。
全文摘要
淋巴毒素途径抑制物在肿瘤治疗,尤其是滤泡性淋巴瘤治疗中的应用。
文档编号C07K14/525GK1289252SQ99802490
公开日2001年3月28日 申请日期1999年1月29日 优先权日1998年1月30日
发明者J·布朗宁, J·索贝克, V·茨阿格比 申请人:拜奥根有限公司, 纽约大学