专利名称：Hgf－nk4的peg－偶联物的制作方法
技术领域：
本发明涉及肝细胞生长因子的含有四个kringle的N-末端片段(NK4)与聚乙二醇(PEG)的偶联物，其药物组合物，制备方法和使用方法。
背景技术：
肝细胞生长因子(HGF/SF)是Nakamura，T.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)22(1984)1450-1459鉴定和纯化的多肽。进一步发现肝细胞生长因子与分散因子(SF)相同，Weidner，K.M.，等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88(1991)7001-7005。HGF是一种分子量100kDa的糖蛋白，其涉及包括增殖，有丝分裂，小管分支的形成和，肿瘤细胞，发病和转移情况下多种细胞表型的发展。有关综述参见Stuart，K.A.，等，世界实验病理学杂志(International Journal of Experimental Pathology)81(2000)17-30。已经对大鼠HGF和人HGF进行测序和克隆(Miyazawa，K.等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)163(1989)967-973；Nakamura，T.，等，Nature 342(1989)440-443；Seki，T.，等，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.and Biophys.Res.Comm.)172(1990)321-327；Tashiro，K.，等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204；Okajima，A.，等，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.) 193(1990)375-381)。Uematsu，Y.，等，药物科学杂志(J.Pharm.Sciences)88(1999)131-135研究了缺失头五个N-末端氨基酸的HGF(dHGF)的药物动力学和药效。发现dHGF血清浓度快速降低，因此与大团剂注射相比，优选输液作为给药途径。
美国专利No.5,977,310描述了PEG-修饰的HGF。这样的PEG-修饰HGF具有长时间的体内清除率，并且具有和HGF相同的生理活性。但是，根据美国专利No.5,977,310，只有可能分别将HGF的半寿期从59.2分钟延长至76.7分钟或95.6分钟(参见美国专利No.5,977,310的实施例5)。该专利中进一步提出可以选择HGF摩尔量5至100倍范围的PEG试剂的摩尔量。在修饰蛋白质的赖氨酸或N-末端的氨基的情况下，PEG试剂优选的摩尔范围是HGF摩尔量的10至25倍。连接的PEG链的分子量是大约10kDa。WO94/13322中还描述了由PEG和多肽例如HGF组成的偶联物的合成方法。根据其发明人所述，在预先确定的位点将这些偶联物连接在一起，随机偶联作用导致向介导期望的治疗或诊断活性的分子的结构域导入聚合物部分。结果，分子获得延长的体内半寿期，并且在杂合蛋白质情况下，降低了免疫原性，但是代价是大大地或者完全丧失了期望的生物活性(参见，例如，Kitamura，K.，等，癌症研究(Cancer Res.)51(1991)4310-4315)和Maiti，P.K.，等，世界癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)3(1988)17-22)。例如，PEG基化IFN-α表明效力只是没有PEG基化IFN-α的7％(Bailon，P.，生物偶联物化学(Bioconjugat Chem.)12(2001)195-202)。
此外，发现由HGF/SF的N-末端发夹序列结构域和四个kringle结构域组成的HGF/SF片段，称为NK4，具有与HGF/SF完全不同的药学性质，并且是HGF/SF影响结肠癌细胞的运动性和发病的拮抗剂，此外，是抑制肿瘤生长和转移的血管生成抑制剂(WO93/235410；Parr，C.，等，世界癌症杂志(Int.J.Cancer) 85(2000)563-570；Kuba，K.，等，癌症研究(Cancer Res.)60(2000)6737-6743；Date，K.，等，FEBS Letters 420(1997)1-6；Date，K.，等，致癌基因(Oncogene)17(1989)3045-3054；Tomioka，D.，等，Cancer Res.61(2001)7518-7524)。
Kuba，K.，等，癌症研究(Cancer Res.)60(2000)6737-6743，在动物实验中，检测NK4对肺转移的影响，揭示NK4必须要连续输液两周。
已知聚合物与某些多肽的连接可以提高这种多肽的血清半寿期。例如对于聚乙二醇化白细胞介素-6(EP 0 442 724)或白细胞介素-2(WO90/07938)和红细胞生成素(WO 01/02017)都发现这种情况。但是，聚乙二醇和其它聚合物连接不必然导致它们的血清半寿期的延长。例如，已知，不同的聚乙二醇与白细胞介素-8，G-CSF和其它白细胞介素结合导致具有削弱性质的分子的产生(Mehvar，R.，制药科学杂志(J.Pharm.Pharm.Sci.)3(1)(2000)125-136)。因此，多肽的聚乙二醇化作用的结果是高度不可预测的。Gaertner，H.F.，和Offord，R.E.，生物偶联物化学(Bioconjugate Chem.)7(1996)38-44描述了PEG与蛋白质的氨基末端的定点连接。Gaertner等指出(上文在WO94/13222中已经提到)，如果不能精确控制连接位点，则聚乙二醇化作用存在一个大问题，因为这可能对蛋白质稳定性和功能具有重要的意义。
Francis，G.E.，等，Int.J.Hematol.68(1998)给出了细胞因子和其它治疗蛋白质的聚乙二醇化作用综述。Francis等阐述使用大多数聚乙二醇化方法，生物活性大大降低(一般是20-95％)。根据Francis等，聚乙二醇化作用总是以试验和误差为基础，并且事实上这样的聚乙二醇化作用的所有的参数对产物的功能具有出人意料的非常深刻的影响。Tsutsumi，Y.，等Thromb.Haemost.77(1997)168-173描述了白细胞介素-6的聚乙二醇化作用。根据Francis等，IL-6中大约54％的赖氨酸氨基与每个PEG基团分子量为5kDa的PEG偶联。Tsutsumi等在Proc.Natl.Acad.Sci.USA97(2000)8548-8553，描述了PEG对免疫毒素的化学修饰。随机聚乙二醇化作用伴随特异性细胞毒性活性的明显损失。Tsutsumi通过使用带有用于PEG偶联的一个或两个另外的半胱氨酸的免疫毒素进行定点PEG化作用。Heinzerling，L.，等，Dermatol.201(2000)154-157描述了PEG与分子量为5kDa的干扰素-α偶联。Tsutsumi，Y.，药物实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)278(1996)1006-1011，描述了TNF-α的PEG修饰作用。因为使用的聚乙二醇化TNF-α具有至少84kDa的分子量(TNF-α分子量是17kDa)，至少有13个5kDa PEG基团与TNF-α连接。
Reddy，K.R.，药物治疗年报(Ann.Pharmacotherapy)34(2000)915-923还对蛋白质的聚乙二醇化作用及其药效作出了综述。阐述治疗性蛋白质的聚乙二醇化作用一定要小心评述。根据Reddy等，每一种不同的蛋白质要求不同的最佳化学条件，因此聚乙二醇化作用的影响是不能预测的。
本发明的一个目的是发现一种改进的具有NK4活性的多肽及其药物组合物，它能作为每周少数几次bolus施用和/或以非常低的剂量施用，并且它能抑制肿瘤生长，血管生成和转移。
发明概述本发明提供了由与一个大约20-40kDa的聚乙二醇(PEG)基团共价连接的NK4组成的NK4偶联物(一聚乙二醇化(monoPEGylated)NK4)，优选通过NK4赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基连接。最优选地，在由NK4赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基组成的基团之外的一个氨基处对NK4进行随机聚乙二醇化作用。令人惊奇地，发现根据本发明的一聚乙二醇化NK4就NK4或者其它聚乙二醇化NK4的治疗应用来说具有优越性质。
本发明进一步包括根据本发明的一聚乙二醇化NK4的制备方法。
本发明进一步包括含有一聚乙二醇化NK4的药物组合物。
本发明进一步包括含有一聚乙二醇化NK4的药物组合物的制备方法。
本发明进一步包括治疗人癌症(例如乳腺癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌或结肠癌)的方法，特征在于一周一至七次对需要治疗的患者以大丸剂(bolus)施用药学有效量的一聚乙二醇化NK4。
令人惊奇地发现治疗中要施用的根据本发明的随机聚乙二醇化NK4的总量与施用没有聚乙二醇化NK4相比低得多。因此，药物治疗中使用的聚乙二醇化NK4的量是没有聚乙二醇化NK4要求量的大约50％或更低，优选大约20％或更低，最优选大约10％或更低。
本发明详细描述人HGF是二硫键连接的杂二聚体，通过在氨基酸R494和V495之间裂解，它能在463个氨基酸的α-亚基和234个氨基酸的β-亚基中被裂解。α-链N-末端前加一个甲硫氨酸基团开头的31个氨基酸。该片段包括31个氨基酸的信号肽。α-链从第32个氨基酸开始，并且包含四个kringle结构域。所谓″发夹结构域″由氨基酸70-96组成。大约来说，kringle 1结构域由α-链的氨基酸128-206组成，Kringle 2结构域由α-链的氨基酸211-288组成，Kringle 3结构域由α-链的氨基酸305-383组成，Kringle 4结构域由α-链的氨基酸391-469组成。存在这些序列的变种基本上不影响NK4的生物学性质(基本上不影响它拮抗HGF的活性和它的抗血管生成活性)，例如WO 93/23541中描述了变体。还有，只要生物学性质不受影响，则NK4的长度可以改变几个氨基酸。
NK4由HGF/SF α-链的N-末端447个氨基酸组成，它包括上述发夹结构域和四个kringle结构域。它能通过重组方法制备，或者通过重组人HGF/SF的制备和用弹性蛋白酶(Date，K.，FEBS Letters 420(1997)1-6)消化，或者通过如下文所述在合适的宿主细胞中重组表达编码NK4的核酸。NK4糖蛋白具有大约57kDa的分子量(52kDa只对于多肽部分)，并且具有引起肿瘤生长，血管生成和/或转移的抑制作用的体内生物学活性。
因此这里使用的“一聚乙二醇化NK4”指共价连接一个分子量20-40kDa的聚乙二醇基团的NK4。优选地，随机在NK4分子的不同位点，但是优选在在最具反应性的位点，例如赖氨酸侧链和N-末端氨基，能够连接该基团。一聚乙二醇化NK4(其因此优选是一聚乙二醇化NK4分子的混合物，在NK4赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基的不同位点聚乙二醇化)至少是该制剂的90％，最优选地，一聚乙二醇化NK4是该制剂的92％或更多。因此根据本发明的一聚乙二醇化NK4制剂基本上足够均一，以展示例如药物应用中均一制剂的好处。
这里使用的″基本上均一″意思是只有制备，含有或使用的PEG-NK4偶联物是具有一个连接的PEG基团的那些。所述制剂可以含有没有反应的(即，没有PEG基团)蛋白质。根据肽图谱和N-末端测序所确定的，下面的一个实施例提供了一种制剂，其中有至少90％PEG-NK4偶联物和最多2％没有反应的蛋白质。
根据本发明使用的PEG聚合物分子具有大约20-40kDa的分子量，其中大约20，30或40kDa的PEG聚合物是优选的(这里使用的″分子量″理解是指PEG的平均分子量；术语″大约″指在所述PEG制剂中，与给定的分子量相比，一些分子会更重和一些会更轻)。
根据本发明的“PEG或PEG基团”指包含聚乙二醇作为基本部分的残基。这样的PEG可以还包含另外的结合反应所需要的化学基团；其从分子的化学合成得到；或者它是分子的部分的最佳距离的间隔基团。另外，这样的PEG可以由连接在一起的一个或多个PEG侧链组成。具有多于一个PEG链的PEG称作多链(multiarmed)或支化的PEG。支化的PEG可以例如通过聚环氧乙烷与各种多元醇包括丙三醇，季戊四醇，山梨糖醇的加成反应来制备。例如可以从季戊四醇和环氧乙烷能制备四条链支化的PEG。例如EP-A0473084和US专利No.5932462中描述了支化PEG。特别优选的是带有通过赖氨酸伯氨基连接的两个PEG支链的PEG(PEG2)(Monfardini，C.，等，生物偶合物化学(Bioconjugate Chem.)6(1995)62-69)。带有分子量是20-30kDa线性PEG分子的PEG聚合物是优选的，带有分子量大于30kDa，特别是40kDa的支化PEG的PEG聚合物是优选的。PEG 40kDa两条支链PEG(PEG2)是特别优选的。
根据本发明提供了基本上均一的一聚乙二醇化NK4的制备方法。根据现有技术方法能够进行NK4的聚乙二醇化作用，例如通过使NK4与亲电活化的PEG(供应商Shearwater Corp.，USA，www.shearwatercorp.com)反应。优选的PEG试剂是例如N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯(PEG-SPA)或丁酸酯(PEG-SBA)或支化的N-羟基琥珀酰亚胺例如mPEG2-NHS(Monfardini，C.，等，生物偶联物化学(BioconjugateChem.)6(1995)62-69)。这样的方法产生NK4多肽，其在NK4赖氨酸的ε-氨基或N-末端氨基处随机聚乙二醇化。可以根据WO94/01451制备不随机的N-末端聚乙二醇化NK4。
在本发明优选的实施方案中，所述NK4与下式的一个聚“乙二醇”基团共价连接-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR其中聚乙二醇基团的(即羰基)与NK4的一个氨基形成酰胺键；R是低级烷基；x是2或3；m是约200至约950；选择n和m，使得偶联物减去NK4蛋白的分子量为约20至40kDa。作为NK4的氨基，NK4赖氨酸的ε-氨基是可获得的(自由)氨基。
更具体地，上述偶联物可以用式(I)代表P-[NHCO-(CH2)x-(OCH2CH2)m-OR (I)其中P是本文描述的NK4蛋白的基团，即没有与式(I)中所示羰基形成酰胺键的一个氨基或几个氨基；并且其中R是低级烷基；x是2或3；m是约200至约950；并且选择n和m，使得偶联物减去NK4蛋白的分子量为约20至40kDa。如本文使用的，给定范围的″m″只具有取向意义。在任何情况下通过PEG基团的分子量精确确定″m″的范围。
在本发明另一个优选的实施方案中，所述NK4与下式的一个聚(乙二醇)基团共价连接 其中y是1-4，优选是4，一起选择n和p，使得偶联物减去NK4蛋白的分子量为约20至40kDa，优选40kDa，并且n和p的差异不超过25％，优选不超过10％，最优选是相同的，并且R是低级烷基。
如本文使用的，″低级烷基″指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基(C1-C6)烷基。低级烷基的例子包括甲基，乙基和异丙基。根据本发明，R是任何低级烷基。其中R是甲基的偶联物是优选的。
符号″m″代表聚环氧乙烷中环氧乙烷基团(OCH2CH2)的数目。环氧乙烷的单一PEG亚基具有大约44道尔顿的分子量。因此，偶联物的分子量(不包括NK4的分子量)取决于″m″数值。在本发明的偶联物中，″m″是约450至约950(相当于约20kDa至约40kDa的分子量)。选择m数值，使得得到的本发明的偶联物具有可与没有修饰的NK4相比的生理活性，其活性可以表示为等于，大于相应的没有修饰的NK4的活性，或者是相应的没有修饰的NK4的活性的一部分。“大约”某一数值的分子量指它是在通过常规分析技术测定的数值的合理的范围内。选择″m″数值，使得与NK4蛋白共价连接的各个聚乙二醇基团的分子量是约20kDa至约40kDa。
例如通过将式II的化合物与NK4蛋白缩合，可以从已知的活化的聚合物材料制备式(I)的化合物 其中R和m如上所述。其中x是3的式(II)的化合物是聚乙二醇的α-低级烷氧基丁酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。其中x是2的式(II)的化合物是聚乙二醇的α-低级烷氧基丙酸琥珀酰亚胺酯(低级烷氧基-PEG-SBA)。能应用活化酯与胺反应形成酰胺的任何常规方法。在上述反应中，举例的琥珀酰亚胺酯是引起酰胺形成的离去基团。1997年9月30日公开的美国专利No.5,672,662(Harris，等)公开了琥珀酰亚胺酯例如式II的化合物制备与蛋白质的偶联物的用途。
人NK4包含30个赖氨酸残基的30个自由ε-氨基。当聚乙二醇化试剂与式II的SBA化合物混合时，发现在蛋白质浓度是大约5-10毫克/毫升，pH大约7.0至8.0，蛋白质∶PEG之比大约是1∶3，并且反应温度是20-25℃下，产生一聚乙二醇化，二聚乙二醇化，和痕量三聚乙二醇化物质。当蛋白质∶PEG之比约是1∶1或1∶2时(例如，对于30kDa PEG-SBA优选是约1∶2，对于40kDa PEG2-NHS是约1∶5)，主要产生一聚乙二醇化物质。通过操作反应条件(例如，制剂比例，pH，温度，蛋白质浓度，反应时间等)，不同聚乙二醇化物质的相对量是可以变化的。典型地，不是限制性地，条件是约8-12毫克/毫升NK4，0.3M磷酸钾，pH8，25℃，1小时反应时间。在这样的条件下，使用30kDa PEG-SBA(1∶2，蛋白质∶PEG)，产率是约38％一聚乙二醇化NK4。
也可以根据WO94/01451中描述的方法制备一聚乙二醇化NK4。WO94/01451描述了带有修饰的末端氨基酸α-碳反应基团的重组多肽的制备方法。该方法的步骤包括生成重组多肽，并且在N-末端α-胺和C-末端α-羧基用一个或多个生物学加入的保护基团保护它。多肽然后能与化学保护剂反应，选择性保护反应侧链基团，从而保护侧链基团不被修饰。然后使用对生物保护基团特异性的酶切试剂对多肽酶切，形成没有保护的末端氨基酸α-碳反应团。用化学修饰剂修饰没有保护的末端氨基酸α-碳反应团。然后将侧链保护的末端修饰的单一拷贝多肽在侧链基团处去保护，形成末端修饰的重组单一复制多肽。可以改变该方法中的步骤的数目和顺序，实现在多肽的N-和/或C-末端氨基酸处的选择性修饰作用。
根据本发明的另一个优选的偶联物由通过式-C(O)-X-S-Y-的连接基团与低级烷氧基聚(乙二醇)基团共价连接的NK4蛋白构成，所述连接基团的的C(O)与NK4的氨基形成酰胺键(如上所述，赖氨酸残基的ε-氨基是可获得的)，X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，k是1至10，Y是 或 聚(乙二醇)部分的平均分子量是约20kDa至约40kDa，并且当NK4多肽的分子量是52kDa时，偶联物的分子量是约72kDa至约92kDa，或者当NK4糖蛋白分子量是约57kDa时，偶联物的分子量是约77kDa至约97kDa。
这种NK4物质也可以用式(III)代表P-NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR (III)其中R可以是任何低级烷基，其是指具有1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基，乙基，异丙基等。优选的烷基是甲基。X可以是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至约10。优选地，k是1至约4，更优选地，k是1或2。最优选地，X是-(CH2)。
在式III中，Y是 或 优选地 或
更优选地 在式(III)中，选择m数值，使得得到式(III)的偶联物具有可与没有修饰的NK4相比的生理活性，其活性可以等于，大于相应的没有修饰的NK4的活性，或者是相应的没有修饰的NK4的活性的一部分。M代表PEG单元中环氧乙烷链的数目。单一PEG的-(OCH2CH2)-亚基具有约44道尔顿的分子量。因此，偶联物的分子量(排除NK4的分子量)取决于m数值。“大约”某一数值的分子量指它是在通过常规分析技术测定的数值的合理的范围内。因此m是约450至约950的整数(约20kDa至40kDa的分子量)。
优选的式(III)的NK4蛋白由下式代表 和 最优选的NK4蛋白产物由下式代表 可以通过下面的方法制备这些NK4蛋白(a)NK4蛋白的赖氨酸的自由氨基，优选ε-氨基或式P-NH2表示的N-末端氨基与式Z-CO-X-S-Q代表的双功能试剂共价反应，形成带有下式表示的具有酰胺键的中间体
P-NH-CO-X-S-Q其中P是具有较少形成酰胺键的氨基的NK4蛋白；Z是反应基团，例如羧酸-NHS酯；X是-(CH2)k-或-CH2(O-CH2-CH2)k-，其中k是1至约10；并且Q是保护基团，象烷酰基，例如乙酰基。
(b)来自步骤(a)的带有酰胺键的中间体与式W-[OCH2CH2]m-OR代表的活化的聚乙二醇衍生物共价反应，生成下式代表的NK4蛋白产物 其中W是Y的巯基反应形式；m是约450至约950范围的整数；R是低级烷基；并且Y如上定义。
在这个实施方案中，双功能试剂优选是N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代丙酸酯或N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯，Z优选是N-羟基-琥珀酰亚胺，并且活化的聚乙二醇衍生物W-[OCH2CH2]m-OR优选选自碘代-乙酰基-甲氧基-PEG，甲氧基-PEG-乙烯基砜，和甲氧基-PEG-马来酰亚胺。
更详细地，通过巯基与NK4共价连接(″活化″)，并且使活化的NK4与聚乙二醇(PEG)衍生物偶联，可以制备式(III)的NK4蛋白。根据本发明的一聚乙二醇化NK4制备的第一步骤包括通过NK4的NH2-基团与巯基共价连接。利用带有保护的巯基和另外的反应团的双功能试剂进行NK4的活化作用，所述反应团是例如活性酯(例如，琥珀酰亚胺酯)，酸酐，磺酸酯，羧酸和磺酸的卤化物。用本领域公知的基团例如乙酰基，保护巯基。这些双功能试剂能通过形成酰胺键与氨基反应。
在优选的实施方案中，通过与具有琥珀酰亚胺部分的双功能试剂反应来进行氨基的活化作用。双功能试剂可以带有不同的间隔区，例如-(CH2)k-或-CH2-(O-CH2-CH2-)k-部分，其中k是1至约10，优选1至约4，更优选1或2，最优选1。这些试剂的例子是N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和N-琥珀酰亚胺-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)。
乙酰基硫代烷基-羧酸-NHS-酯，象 或 2-(乙酰基硫代)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯k如上定义。
双功能试剂的制备是本领域公知的。DE-3924705中描述了2-(乙酰基硫基)-(乙氧基)k-乙酸-NHS-酯的制备，而March，J.，高级有机化学(Advanced Organic Chemistry)(1977)375-376描述了对乙酰基硫基化合物的衍生化作用。SATA可商业购得(Molecular Probes，Eugene，OR，USAand Pierce，Rockford，IL)。
通过调节反应参数，即，蛋白质(NK4)浓度和蛋白质/双功能试剂比例，可以选择对一个NK4分子只加一个巯基。
例如在缓冲水溶液pH6.5-8.0，例如，10mM磷酸钾，加入或不加入300mM NaCl，pH7.3中进行反应。可以在DMSO中加入双功能试剂。反应完全后，优选30分钟之后，通过加入赖氨酸终止反应。通过本领域公知的方法可以分离过量的双功能试剂，例如，通过透析或柱过滤。通过例如Grasetti，D.R.和Murray，J.F.，应用生物化学生物技术杂志(J.Appl.Biochem.Biotechnol.) 119(1967)41-49所描述的光度计方法可以测定对NK4加上的巯基的平均值。
上述反应之后接着是活化的聚乙二醇(PEG)衍生物的偶联。合适的PEG衍生物是分子量约20kDa至约40kDa的活化PEG分子。
活化的PEG衍生物是是本领域公知的，并且对于PEG-乙烯基砜，描述于例如，Morpurgo，M.，等，生物偶联物化学(J.Bioconj.Chem.)7(1996)363ff。直链和支链PEG物质适合式1的化合物的制备。反应性PEG试剂的例子是碘代-乙酰基-甲氧基-PEG和甲氧基-PEG-乙烯基砜 或 这些碘活化的物质的应用是本领域公知的，并且例如Hermanson，G.T.，在生物偶联物技术(Bioconjugate Techniques)，Academic Press，San Diego(1996)p.147-148中描述过。
最优选地，使用(烷氧基-PEG-马来酰亚胺)，例如甲氧基-PEG-马来酰亚胺(MW 10000至40000；Shearwater Polymers，Inc.)，通过马来酰亚胺活化PEG物质。烷氧基-PEG-马来酰亚胺的结构如下 或 R和m如上定义，优选地 巯基保护基团原位裂解之后，在缓冲水溶液例如10mM磷酸钾，300mM NaCl，2mM EDTA，pH6.2中，进行与烷氧基-PEG-马来酰亚胺的偶联反应。例如使用羟胺在DMSO中在25℃，pH6.2下可以进行90分钟胃外施用组合物。
本发明进一步提供了含有这里描述的偶联物的药物组合物，其中一-PEG偶联物的百分比优选至少90％，更优选至少92％。
根据本领域公知的方法能制备根据本发明的药物制剂。通常，为了在药物组合物中使用，用缓冲液透析一聚乙二醇化NK4溶液，并且通过浓缩或稀释来调节期望的最终蛋白质浓度。
这样的药物组合物可以用于注射给药，并且含有有效量的一聚乙二醇化NK4和药学可接受稀释剂，防腐剂，增溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这样的组合物包括各种缓冲剂内含物(例如精氨酸，乙酸盐，磷酸盐)，pH和离子强度调节剂，添加剂例如去污剂和增溶剂(例如Tween 80/多乙氧基醚，pluronic F68，氯化钠，硫酸钠)，抗氧化剂(例如抗坏血酸，L-甲硫氨酸)，防腐剂(Timersol，苯甲醇)和填充剂(例如蔗糖，甘露糖醇)的稀释剂，物质混入到聚合物例如聚乳酸，聚乙醇酸等颗粒制剂中，或者混入脂质体中。这样的组合物可以影响根据本发明的一聚乙二醇化NK4的体内释放和清除的稳定性。
剂量和药物浓度一般情况下，在标准癌症治疗方案中，以每天每公斤1至3mg一聚乙二醇化NK4范围内的剂量治疗患者，持续一段时间，持续一天至约30天或者更长。每天一次皮下或静脉内bolus注射每毫升含有0.1至100mg一聚乙二醇化NK4的药物制剂给药。这种治疗可以结合任何标准治疗(例如化疗)，在标准治疗之前，期间，或之后施用一聚乙二醇化NK4。与单独的标准治疗相比较，这导致改善的结果。
在任何情况下，与用于相同治疗的NK4相比较，施用的根据本发明的聚乙二醇化NK4的总量低得多。
提供下面的实施例，参考文献和序列表，有助于对本发明的理解，本发明的实际范围在后面的权利要求书中给出。要明白不超出本发明的精神可以在操作中进行改变。
序列描述
SEQ ID NO1给出NK4的DNA和多肽序列。
SEQ ID NO2给出NK4的多肽序列。
附图描述
图1 NK4，20kDa一聚乙二醇化NK4和30kDa一聚乙二醇化NK4对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制作用。
图2 NK4和40kDa一聚乙二醇化NK4对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制作用。
图3 NK4，30kDa一聚乙二醇化NK4和40kDa一聚乙二醇化NK4对bFGF-诱导的HUVEC增殖的抑制作用。
图4 静脉(图4A)或皮下(图4B)注射之后，血浆中NK4，30kDa一聚乙二醇化NK4和40kDa一聚乙二醇化NK4的时间-浓度曲线。
实施例1NK4的重组制备通过重组方法使用细菌或真核表达系统可以制备治疗用途的NK4。合适的真核表达系统是例如工程HeLa，BHK或者优选CHO细胞。在合适的培养基中培养用于NK4生产的工程菌。一般情况下，对于10升发酵罐，使用1至5升细胞培养物作为接种物。3-5天之后，10升发酵罐中的培养物可以用作100升发酵罐的接种物。又发酵3-5天之后，该培养物可以用作1000升生产发酵罐的接种物。3-4天之后，过滤或浓缩去除细胞并且弃除。过滤含有NK4的上清液，收集并且在纯化过程中处理。下面的实施例描述纯化方法。
实施例2纯化肝素-琼脂糖凝胶由其表面上共价键合有肝素的琼脂糖小球组成。因为NK4表现出对肝素的亲和性，其保留在柱子上并且能用高盐浓度洗脱，而蛋白质污染物和其它杂质不是不结合就是不在低盐浓度下洗脱。含有NK4的级分，在约0.7至1.1M NaCl，50mM Hepes pH7.5下洗脱，收反应，以进行保护基团的裂解。对于PEG修饰作用，活化的NK4/烷氧基-PEG-马来酰亚胺之摩尔比应该是约1∶1至约1∶6。通过加入半胱氨酸和保留的巯基(-SH)与N-甲基马来酰亚胺或其它能形成二硫键的合适的化合物反应来终止反应。因为任何残留的活性巯基与保护基团例如N-甲基马来酰亚胺或其它合适的保护基团反应，本发明的偶联物中NK4蛋白可以包含这样的保护基团。一般来说，这里描述的方法产生带有不同数目的被不同数目保护基团保护的巯基的分子的混合物，不同保护基团数目取决于没有与PEG-马来酰亚胺偶联的蛋白质上活化的巯基的数目。
当被用来保护聚乙二醇化蛋白质上残留的巯基时，N-甲基马来酰亚胺形成相同类型的共价键，二硫键化合物对封端剂的二硫桥偶联导致分子内二硫键/二硫键交换反应。该类保护反应优选的保护试剂是氧化的谷胱甘肽(GSSG)，半胱氨酸和胱胺。而对聚乙二醇化蛋白质加入没有另外的净电荷的半胱氨酸，封端剂GSSG或胱胺的使用导致另外的负电荷或正电荷。
式(III)的化合物的进一步纯化，包括一聚乙二醇化-，二聚乙二醇化-，三聚乙二醇化-，和多聚乙二醇化-NK4物质的分离，可以通过本领域公知的方法进行，例如，柱层析。通过合并洗脱峰周围较宽的级分，减少组合物中一-PEG或较窄级分的百分比，提高组合物中一-PEG的百分比，可以控制一-PEG偶联物的百分比。一-PEG偶联物大约90％能很好地平衡产率和活性。其中偶联物的至少92％或者至少96％是一-PEG物质的组成是期望的。在本发明的实施方案中，一-PEG偶联物的百分比是90％至96％。
药物制剂根据本领域技术人员公知的制备药物组合物的方法能将本发明的化合物配制成制剂。对于这样的组合物的制备，根据本发明的一聚乙二醇化NK4与药学可接受载体混合成混合物，这样的药学可接受载体描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，1990，Mack PublishingCompany，Oslo等编著(例如pp.1435-1712)。典型的组合物含有有效量的根据本发明的物质，例如约0.1至100mg/ml，和适当量的载体。可以肠集并且加载到羟磷灰石柱子上。用大约0.4至0.7M磷酸钾，pH7.5洗脱NK4。得到的级分基本上没有污染蛋白质，并且可以通过Q-sepharose层析进一步纯化。
实施例3一聚乙二醇化NK4的制备根据上述方法中纯化的NK4用于聚乙二醇化作用反应。举例描述上述合适的方法中的三个。
a)使用mPEG-SBA对NK4聚乙二醇化NK4等份与甲氧基-PEG-SBA(5kDa作为对照，分别是20kDa和30kDa；Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville Alabama)反应。在蛋白质与试剂之比在1∶1和1∶5之间，反应在室温下进行大约2小时(当使用20和30kDaPEG时，1∶2的比例是优选的)。通过加入10mM Tris-缓冲液或精氨酸HCl、pH8终止反应，并且通过SDS-PAGE或者在Superose 6柱子(Pharmacia)上使用用于平衡和洗脱的缓冲液500mmol/l磷酸钾，pH6.8上进行尺寸排阻层析来分析样品。为了主要获得一聚乙二醇化NK4，改变蛋白质与试剂之比，pH，时间和温度优化反应。
这样的反应条件是例如NK4浓度 8-12毫克/毫升缓冲液体系/pH 0.3M磷酸钾，pH8温度 25℃反应时间 1小时摩尔比(蛋白质试剂) 1∶2产率一聚乙二醇化NK4 38％二聚乙二醇化NK4 17％没有聚乙二醇化的NK4 45％b)使用mPEG-SPA对NK4聚乙二醇化NK4等份(0.3M磷酸钾，pH8中蛋白质浓度是8-12毫克/毫升)与甲氧基-PEG-SPA(分别是用于比较的5kDa，和20kDa；ShearwaterPolymers，Inc.，Huntsville Alabama)反应。在蛋白质与试剂之比为1∶2下，反应在室温下进行大约2小时。通过加入10mM Tris-缓冲液或精氨酸盐酸盐终止反应，并且通过SDS-PAGE，反相HPLC或者在Superose 6柱子(Pharmacia)上使用用于平衡和洗脱的缓冲液50mmol/l磷酸钾，pH6.8上进行尺寸排阻层析来分析样品。为了获得与二和三聚乙二醇化NK4相比占优势的一聚乙二醇化NK4，改变蛋白质与试剂之比，pH，时间和温度优化反应。
b)使用mPEG2-NHS对NK4聚乙二醇化根据实施例3所述进行这种聚乙二醇化作用，除了使用1∶5摩尔比(蛋白质PEG试剂)代替PEG-SPA mPEG2-NHS(40 kDa PEG，通过赖氨酸连接基团支化)。
实施例4一聚乙二醇化NK4的分离通过使用用于平衡和洗脱的缓冲液500mmol/l磷酸钾，pH6.8上，进行制备性尺寸排阻层析(例如Superose 6或Superdex 200；Pharmacia)或者通过离子交换层析，从没有聚乙二醇化的，二和三聚乙二醇化NK4分离一聚乙二醇化NK4。纯化的蛋白质主要含有一聚乙二醇化NK4物质。收集级分并且通过SDS-PAGE和反相色谱进行分析。
实施例5一聚乙二醇化NK4的分子表征a)尺寸排阻色谱在尺寸排阻色谱中(例如Superose 6或Superdex 200；Pharmacia，使用用于平衡和洗脱的缓冲液500mmol/l磷酸钾，pH6.8)，与没有修饰的形式相比，较早洗脱出一聚乙二醇化。这是因为分子的提高的流体半径。
b)SDS-PAGE在SDS-PAGE中，根据分子量分离蛋白质。由于聚乙二醇化作用，分子量增加，与没有修饰的NK4相比，一聚乙二醇化NK4具有较短的迁移距离。迁移距离与每个NK4分子连接的PEG部分的长度和PEG基团的数目成反比。
c)肽图谱用序列特异性蛋白质内切酶(例如LysC或胰蛋白酶)对聚乙二醇化NK4的消化得到肽特征图谱。对得到的肽进行反相层析分离并且通过质谱和/或N-末端测序进行分析。这确定了NK4分子内PEG-修饰基团。
d)反相色谱也通过反相色谱表征聚乙二醇化NK4。NK4的聚乙二醇化作用导致与没有修饰的NK4相比滞留时间的变化。
实施例6一聚乙二醇化的，没有聚乙二醇化的和多聚乙二醇化的NK4之比较在该实施例中，使用没有聚乙二醇化的NK4，具有PEG 5kDa、PEG 20kDa、PEG 30kDa、PEG 40kDa的一聚乙二醇化的NK4，和多聚乙二醇化的NK4(具有多于一个PEG链的聚乙二醇化的NK4)a)扩散分析在组织培养平板中MDCK细胞亚汇合生长。用HGF(10ng/ml)或者用HGF和NK4的结合物处理细胞。在这些实验中，通过加入10至1000-倍摩尔过量的NK4抑制HGF-诱导的细胞扩散，证明聚乙二醇化NK4的功能活性。发现一聚乙二醇化5kDa-PEG-NK4，20kDa-PEG-NK4，30kDa-PEG-NK4，和40kDa-PEG-NK4的体外活性类似于没有聚乙二醇化的NK4。还发现加入一条以上的PEG链(20-40kDa)导致体外活性的显著降低(表1)。
表1MDCK扩散分析评分
分析了在MDCK细胞的HGF(10ng/ml)-诱导的扩散的抑制作用中NK4的各种聚乙二醇化形式的相对效力。++意思是完全抑制，+意思是抑制，+/-意思是弱抑制作用，-意思是没有抑制作用。
b)HUVEC增殖测试根据Nakamura等，Nature342(1989)440-443所述，通过测定培养物中HUVEC增殖来确定NK4对HGF致有丝分裂活性的抑制作用。在这些实验中，通过加入10至1000-倍摩尔过量的NK4抑制HGF-诱导的细胞增殖，证明一聚乙二醇化NK4的功能活性(图1和2)。
或者，通过NK4对bFGF(基础成纤维细胞生长因子)致有丝分裂活性的抑制作用进行HUVEC增殖测试。根据Kuba，K等，癌症研究(CancerRes.)60(2000)6737-6743所述通过测定培养基中HUVEC增殖来测定抑制作用。在这些实验中，通过加入10至1000-倍摩尔过量的NK4抑制FGF-诱导的细胞增殖，证明一聚乙二醇化NK4的功能活性(图3)。
c)侵入测试在该项测试中，分析了肿瘤细胞的侵入潜力。本质上根据Albini等(1987)所述使用HT115细胞进行该项测试。同样，通过加入10至1000-倍摩尔过量的聚乙二醇化NK4抑制HGF(10ng/ml)-诱导的细胞侵入，证明一聚乙二醇化NK4的功能活性。
实施例7体内活性模型Panc Tul人胰腺癌同位SCID小鼠模型(Alves，F.，等，胰腺(Pancreas)23(2001)227-235)处理8天之后，每天施用一次聚乙二醇化NK4，用药21天剂量16毫克/千克/天4毫克/千克/天1毫克/千克/天安慰剂结果用聚乙二醇化NK4处理表明原发肿瘤生长和转移的剂量依赖性抑制，而在安慰剂处理组没有看到效果。
实施例8药物组合物合适的药物组合物是例如1至30mg/ml一聚乙二醇化NK4150mM NaCl10mM磷酸钠，pH7.21至30mg/ml一聚乙二醇化NK4150mM NaCl0.01％Tween 80或Tween 20或pluronic F6810mM磷酸钠，pH7.21至30mg/ml一聚乙二醇化NK450mM NaCl3％甘露醇10mM磷酸钠，pH7.21至30mg/ml一聚乙二醇化NK450mM NaCl3％甘露醇0.01％Tween 80或Tween 20或pluronic F6810mM磷酸钠，pH7.2制备组合物，其中用上述缓冲液(有或没有甘露醇)透析一聚乙二醇化NK4。通过浓缩或者用缓冲液稀释来调节蛋白质浓度。除了10％储备液(stock solution)之外加入去污剂和氯化钠。
实施例9NK4，30kDa一聚乙二醇化NK4和40kDa一聚乙二醇化NK4的药物动力学分析成年小鼠分别接受单一静脉内或皮下bolus注射NK4，30kDa一聚乙二醇化NK4或40kDa一聚乙二醇化NK4(0.25毫升体积中4毫克/千克)。在几个时间点采取血样，并且通过ELISA分析NK4，30kDa一聚乙二醇化NK4或40kDa一聚乙二醇化NK4含量。计算时间浓度曲线并如图4所示。这些数据表明30kDa一聚乙二醇化NK4和40kDa一聚乙二醇化NK4具有显著改善的体内稳定性，导致与没有修饰的NK4相比显著提高的血浆半寿期。
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序列表<110> 霍夫曼-拉罗其有限公司<120> HGF-NK4的PEG偶联物<130> Case 20859<140>
<141>
<150> 01104640.6<151> 2001-02-23<160> 2<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 1344<212> DNA<213> 人<220>
<221> CDS<222> (1)..(1344)<400> 1caa agg aaa aga aga aat aca att cat gaa ttc aaa aaa tca gca aag48Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys1 5 10 15act acc cta atc aaa ata gat cca gca ctg aag ata aaa acc aaa aaa96Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys20 25 30gtg aat act gca gac caa tgt gct aat aga tgt act agg aat aaa gga144Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly35 40 45ctt cca ttc act tgc aag gct ttt gtt ttt gat aaa gca aga aaa caa192Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln50 55 60tgc ctc tgg ttc ccc ttc aat agc atg tca agt gga gtg aaa aaa gaa240Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu65 70 75 80ttt ggc cat gaa ttt gac ctc tat gaa aac aaa gac tac att aga aac288
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275 280 285att tgg aat gga att cca tgt cag cgt tgg gat tct cag tat cct cac912Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His290 295 300gag cat gac atg act cct gaa aat ttc aag tgc aag gac cta cga gaa960Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu305 310 315 320aat tac tgc cga aat cca gat ggg tct gaa tca ccc tgg tgt ttt acc1008Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr325 330 335act gat cca aac atc cga gtt ggc tac tgc tcc caa att cca aac tgt1056Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys340 345 350gat atg tca cat gga caa gat tgt tat cgt ggg aat ggc aaa aat tat1104Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr355 360 365atg ggc aac tta tcc caa aca aga tct gga cta aca tgt tca atg tgg1152Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp370 375 380gac aag aac atg gaa gac tta cat cgt cat atc ttc tgg gaa cca gat1200Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp385 390 395 400gca agt aag ctg aat gag aat tac tgc cga aat cca gat gat gat gct1248Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala405 410 415cat gga ccc tgg tgc tac acg gga aat cca ctc att cct tgg gat tat1296His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr420 425 430tgc cct att tct cgt tgt gaa ggt gat acc aca cct aca ata gtc taa1344Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val435 440 445<210> 2<211> 447<212> PRT<213> 人<400> 2
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1.一种包括肝细胞生长因子(HGF/SF)的N-末端片段和一个具有大约20至40kDa分子量的聚乙二醇基团的偶联物，所述肝细胞生长因子的N-末端片段由发夹结构域和α-链的四个kringle区组成。
2.根据权利要求1的偶联物，特征在于所述聚乙二醇基团具有下式结构-CO-(CH2)x-(OCH2CH2)mOR所述-CO基团与肝细胞生长因子的所述N-末端片段的一个氨基形成酰胺键，其中X是2或3；m是约450至约950；R是(C1-C6)烷基。
3.根据权利要求1的偶联物，其特征在于所述聚乙二醇基团具有下式结构 所述-CO基团与肝细胞生长因子的所述N-末端片段的一个氨基形成酰胺键，其中y是1-10；n和p一起是约450至约950；和R是(C1-C6)烷基。
4.根据权利要求1-3的偶联物，其特征在于所述聚乙二醇基团具有约30-40kDa的分子量。
5.根据权利要求1-4的偶联物，其特征在于所述聚乙二醇基团是一个或多个一甲氧基聚乙二醇基团。
6.含有权利要求1-5的偶联物和药学可接受载体的药物组合物。
7.根据权利要求6的药物组合物的制备方法。
8.根据权利要求1-5的偶联物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
9.癌症的治疗方法，包括对需要治疗的患者施用根据权利要求6的药物组合物的步骤。
全文摘要
包括肝细胞生长因子(HGF/SF)的N－末端片段和一个具有约20至40kDa分子量的聚乙二醇基团的偶联物，所述肝细胞生长因子的N－末端片段由发夹结构域和α－链的四个kringle区组成，该偶联物具有改进的性质，是用于肿瘤治疗的有用治疗性药物。
文档编号C07K14/475GK1571679SQ02805295
公开日2005年1月26日 申请日期2002年2月21日 优先权日2001年2月23日
发明者M·勃兰特, A·帕帕季米特里乌 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司