专利名称：Exochel ins的化学合成的制作方法
背景技术：
本发明参考了美国专利申请08/383,180，目前的美国特许专利5,721,209，美国专利申请08/796,791，目前的美国特许专利5,786,326，美国专利申请08/882,122和美国专利申请08/960,714，都为Horwitz等所有，都己与本发明转让于同一受让人。
本发明涉及一种从未公开过的合成高亲和力铁结合化合物Exochelins的方法，更具体地说是合成或制造Exochelins并对新合成的化合物进行修饰以改变其生理学特性的方法，还包括新合成的化合物诊断和治疗哺乳动物疾病的用途。
以上美国专利和申请已显示，Exochelins具有独特的生理学意义。例如，在急性心肌梗塞中，心脏组织被两个连续过程损伤，即缺血期的缺氧和重灌注期的氧化损伤。缺血期的心肌损伤可通过向缺血区重新引入血液来拯救。然而，重灌注却会因白细胞迁移进入组织并产生反应性氧而引起炎症应答，从而对被重灌注组织造成损伤。反应性最强的是在铁存在下产生的羟基自由基(-OH)，它常引起细胞死亡或相关的氧化性组织损伤。
阻止(-OH)的形成可通过几种途径来避免致死性细胞损伤。已知，(-OH)的形成依赖于游离铁的存在，铁螯合剂的存在可防止重灌注损伤。例如，如果在重灌注之前给予铁的螯合剂去铁敏，就可防止损伤，并可减小冠状动脉阻塞和重灌注期间心肌梗塞的区域。然而，当进入缺血心肌的血流恢复后，重灌注损伤的发生非常快。
(-OH)自由基的形成依赖于游离铁的存在，而铁螯合剂的存在则可清除游离铁，使得铁无法参与催化羟基自由基的形成。然而已知的螯合手段要么不能通过Fenton反应(EDTA)而阻止(-OH)的产生，要么进入细胞太慢(去铁敏)。结果，未能使足量螯合剂足够快地螯合掉足量铁从而防止(-OH)的形成和它造成的细胞损伤。
已证明，去铁敏若在心肌梗塞发生前给予是有效的，但若在重灌注发生之初或之后给予则是无效的。因为例如开胸手术中的心脏搭桥术对心脏组织造成类似的损伤，或对因手术或创伤而失去含氧血的身体其他器官造成类似的损伤。因此，显然需要除铁螯合剂来避免氧化性组织损伤。
在HORWITZ等之前，曾对称为Exochelins的化合物有过简单的描述，Macham,Ratledge和Barclay在英国Hull大学对于其在分支杆菌生长中的作用进行了相应的论述(MACHAM,L.P.,RATLEDGE,C.和NOCTON J.C.,“分支杆菌对胞外铁的需求Exochelins的作用和与反驳分支杆菌素参与的证据”，感染与免疫(1975年12月),PP.1242-1251，第12卷，第6期；BARCLAY,R.和RATLEDGE,C.,“结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌及相关菌种的分支杆菌素和Exochelins”，普通微生物学杂志，1988,pp.134,771-776；MACHAM,L.P.和RATLEDGE,C.，普通微生物学杂志，1975,pp.89,379-382)。
MACHAM鉴定到一种存在于胞外液体中的物质，称之为“Exochelin”。而且，MACHAM将他称之为Exochelins的物质描述成是一种溶于水和氯仿，并能够螯合游离铁的物质。MACHAM等没有分离并纯化这些化合物，而只是对它们进行了鉴定，认定是五肽或六肽，分子量为750-800。
根据MACHAM的研究，他的Exochelins类似于分支杆菌素，后者存在于细胞壁中，具有将铁转移到细胞内的功能。然而，分支杆菌素是一种亲脂性水不溶性分子，不能扩散进入胞外环境和摄取其中的游离铁，与之不同，Exochelin能在生理pH下螯合血清中其他含铁化合物中的铁。而且，根据化合物的细菌来源，Macham等揭示，他的分子还包括水杨酸或β-丙氨酸。
BARCLAY,R.等(同上)也描述了由22株不同的结核分支杆菌及相关菌种产生他称之为Exochelins的过程。然而，以上及其他过去的研究都没有测定这些化合物的具体结构，而且，除作为运输介质将铁送给细胞壁内的分支杆菌素之外，也没有发现它们的其他用途。
总之，MACHAM等认为，在与来自铁蛋白或运铁蛋白(以及血清中类似的含铁化合物)的铁螯合后，他的化合物提供一种能转移给分支杆菌素的形式的铁，而BARCLAY,R.等则描述了其化合物由已知分支杆菌菌株的产生，但没有阐明他们的结构。
MAURER和MILLER在1983年报道了一种相关化合物，分支杆菌素S2的全合成方法(MAURER,P.J.和MILLER M.J.,“分支杆菌素分支杆菌素S2的全合成方法”,1983，美国化学协会杂志，pp.240-245，第105卷)。MAURER等用一种复杂的多步骤合成方法成功制得了29mg分支杆菌素。然而，分支杆菌素S2与本发明合成方法的目标化合物显著不同。而且，至今仍未有Exochelins合成的报道。
以下文献为本发明合成方法提供了参考MAURER,P.J.和Miller M.J.,1982，美国化学协会杂志，104,3096；
FARKAS,L.等，1967,Tetrahedron,23,741；SCHNIEPP,L.E.和GELLER,H.H.,1946，美国化学协会杂志，68,1646；GAUDRY,R.,1948，加拿大研究杂志B部，26,387；DREYFUSS,P.,1974，医学化学杂志17(2),252；BERLINGUET,L.和GAUDRY,R.,1952，生物化学杂志，198,765；BODANSZKY,M.等，1978，医学化学杂志21(10),1030；MAURER,P.J.和MILLER,M.J.,1981，有机化学协会杂志46(13),1835；BIRNBAUM,S.M.,LEVINTOW,L.,KINGSLEY,R.B.和GREENSTEIN,J.P.,1952，生物化学杂志，194,455；COREY,E.J.和VANKATESWARLU,A.,1972，美国化学协会杂志94,6190；SIEBER,P.,1977,Helv.Chim.Acta.,60,2711(b)；GERLACH,H.,1977,Helv.Chim.Acta.,60,3039；MITSUNOBU,O.,1981，合成，1981,1。
Horwitz等发现了目前被认可的Exochelins的结构特征，并就该化合物作为新的铁螯合剂用于抑制重灌注过程中氧化剂损伤的用途获得了专利，并拥有有关其他羟基自由基所致活组织损伤(包括癌、动脉硬化、器官保存和血管成形术后的血管阻塞)的待审专利申请。
而且，相关化合物的合成明显提示了对于这种重要而急需的化合物的医疗需求以及其合成形式的生产方法。参见，例如，HU,J.和MILLER,M.J.,“分支杆菌素S，耻垢分支杆菌的一种铁载体和生长促进剂的全合成方法，及其对于结核分支杆菌的生长抑制活性”，1997,pp.3462-3468，化学协会杂志119。然而，合成所需化合物的复杂性要求对已知过程进行修改，而且，已知许多立体化学限制妨碍通过合成途径产生Exochelins。
由于目前已认定螯合铁是避免对活组织的氧化性损伤的手段之一，所以，Exochelins及相关化合物的潜在用途很广。作为一种在生理系统内吸收含铁蛋白内铁的铁清除剂，Exochelins有效避免了血流中断后的细胞破坏。类似的，与其他金属的螯合可以在各种治疗中调节它们的水平，这包括将各种需要的金属传递给机体，或将与Exochelins或类似合成运输工具结合的有效药物定向于患病器官。
此前Horwitz等的研究得到了纯化的Exochelins，并证明了它们作为游离铁清除剂的用途，以及它们组织组织损伤性羟基自由基形成的作用。特别是，Horwitz等从结核分支杆菌中纯化了Exochelins，并证明它们能够在生理pH下有效去除运铁蛋白、乳铁蛋白和铁蛋白中的铁，但不传递该结核病菌的任何感染性。类似的，是Horwitz等第一次证明Exochelins通过Fenton反应抑制羟基自由基的形成，而且，根据心肌的反应，除在发作后给予数小时之外，在发作之时给予，它们能有效防止心肌梗塞后的重灌注损伤或对其他组织的血管损伤。
而且，Horwitz等在阐明Exochelins结构时指出，前文引用的现有技术未能定义化合物的实际结构，而是将Exochelins认定为肽。没能鉴定Exochelins的实际结构阻碍了人们去研究和合成它们。通过揭示Exoehelins较大的分子量范围，Horwitz等发现，有几个系列的化合物在分子量上具有可鉴定的差异，它们被适当地归了类。不应将Exochelins认为是肽；相反，它们含有3个氨基酸和通过酰胺(-NH-CO-)、异羟肟酸(-NH(OH)-CO-)和酯(-CO-O)缩合而成的其他结构部分(水杨酸，二羧酸或单酯类似物，以及羟基羧酸)。
而且，在待审的美国专利申请08/882,122中已显示，铁的去除能够以一种由Exochelins准确定向的方式攻击癌细胞。因为它们与铁的高度亲和力和它们的脂溶性，结核分支杆菌产生的Exochelins进入细胞的能力增强。一种合成的脂溶性铁螯合剂显然将有助于癌症诊断，治疗和筛选的定向，以及其他用生物学来源Exochelins定向的生理问题。
显然，长期以来一直需要这样一种改进的合成药剂或化合物，它能够在金属参与反应时与之迅速螯合，从而抵御心肌梗塞，治疗癌症以及其他因游离金属存在所致的疾病，或保护组织不受羟基自由基和造成细胞死亡和破坏的相关机制造成的损伤。
发明目的与概述所以，本发明的目的之一是提供一种克服现有技术缺陷的合成Exochelins的方法。本发明的另一目的是合成一种在各方面都与Horwitz等分离所得天然物质类似的化合物。
本发明的目的还在于提供一种制备在溶液中快速螯合三价铁的合成Desferri-Exochelins 772SM(R)或(S)的方法。
本发明的目的还在于提供化学合成能在其他各种金属中有效结合铁的Desferri-Exochelins 772SM(R)或(S)的方法。
本发明的目的还在于提供一种合成Exoehelin化合物，在反相HPLC(苯基柱)上，它的乙腈洗脱浓度与天然Exochelin的相同。
本发明的目的还在于提供一种以工业生产规模合成用于防止对活组织氧化性损伤的Exochelins的简化方法。
简而言之，本发明提供了一种合成Exochelin 772SM(R)的方法，这是一种新的分子，具有一条7碳链，其末端是与非环异羟肟酸酯偶联的甲基酯，具有4个立构中心，3个S异构型和一个B亚单元上的R构型。
本
发明内容
之一提供了一种合成Exochelin 772SM(R)方法，其步骤包括将庚二酸，庚二酸二甲酯，盐酸，甲醇和二正丁基醚的混合物反应生成庚二酸氢甲酯，然后将其与亚硫酰氯和二甲基甲酰胺混合，生成庚二酸甲酯酰氯，保存该产物备以后反应之用。然后，将该产物加入盐酸O-苄基羟胺和三乙基胺在CH2Cl2中形成的悬浮液，生成异羟肟酸O-苄基甲酯。向(L)-6-羟基正亮氨酸和三乙基胺在四氢呋喃(THF)-水混合物中所成的溶液中加入焦碳酸二叔丁酯的THF溶液。分离出水层，用柠檬酸将水层酸化至pH3，并用EtOAc萃取。干燥并纯化EtOAc层，生成(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸。将(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸与烯丙基溴反应，生成(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯。向无水CH2Cl2中的(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯和四溴化碳中加入三苯基膦，形成粘稠的油状物，将该油状物加入EtOAc/己烷，回收(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯。在无水丙酮中混合(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯与异羟肟酸O-苄基甲酯，碘化钾(KI)和碳酸钾，回收(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-Boo-赖氨酸烯丙酯。将三氟乙酸加入(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯，形成一种固体中间体，将该固体中间体加入(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉，生成一种浅棕色的粘稠油状物，经鉴定是(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸)-赖氨酸烯丙酯。将亚硫酰氯逐步加入冷却(-30EC浴)的赖氨酸烯丙酯的无水四氢呋喃溶液中，纯化金色的油状物，得到浅棕色的粘稠油状物，经鉴定是(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-((S)-2-(2-苄氧基)苯基)-2-噁唑啉-4-羰基-赖氨酸烯丙酯。将吗啉和四(三苯基膦)钯加入噁唑啉-赖氨酸烯丙酯的无水CH2Cl2溶液中，生成一种酸。将偶氮二羧酸二乙酯逐步加入该酸和(L)-Nα-((S)-3-羟基丁酰基)-α-氨基-N-(苄氧基)己内酰胺的无水THF溶液。将分离所得物质与MeOH,10％Pd/C和H2混合。过滤该混合物，减压去除溶剂，然后与CH2Cl2共蒸，得到米白色片状固体，NMR分析显示是通式1a所示的Exochelin 772(R)。
通过以下结合附图、表格和通式的描述，以及本发明合成方法的一组实施例，本发明的以上及其他目的、特征和优点将变得更为明显。全文中，相同的标号表示相同的化学物质和官能团。
附图简述参照以下描述、权利要求和附图，可更好地理解本发明的上述和其他特征，内容和优点，其中
图1a是R或S构型的目标分子Exochelin 772SM；图1b是用来比较的分支杆菌素S2；图1c将图1a分子分成A-F各官能部分，协助后文方案Ⅰ-Ⅶ各机制的说明；图2是本发明合成方法实施例之一化合路径的第一部分；图3是本发明合成方法实施例之一化合路径的第二部分；图4显示本发明合成方法实施例之一化合路径中某一部分所用的另一种反应试剂；图5显示属于本发明合成方法实施例之一化合路径中第三部分的化合路径；图6显示本发明合成方法实施例之一化合路径的最后一步。
本发明的详细描述如前文所述待审的专利申请和美国特许专利中所述，本发明发现，Exochelins显著减轻铁介导的催化作用引起的氧化性组织损伤和羟基自由基介导的自由基反应。特别是，这些作用已被证明至少部分参与重灌注损伤，动脉硬化内障形成，癌症等其他对活组织的退行性损伤。
而且，已证明Exochelins在重灌注之初或重灌注期间给予时，能有效防止，至少阻碍，重灌注损伤，显著减轻或防止血管成形术后的血管阻塞，减轻癌症化疗对正常组织的损伤。而且，本发明已经在前文指出，Exochelins包括一大类化学结构与原先Macham等和Barclay等所述不同的物质。
已知Exochelins与多种金属螯合，经适当修饰，它们可用于治疗特定的疾病，攻击癌细胞(以及其他细胞)，并通过检测疾病的存在来协助诊断和监测。例如，用去铁敏除铁在破坏成神经细胞瘤的同时会损害健康组织。类似的，化疗，例如白血病的化疗，常造成铁的超负荷(和输血一样)，已知Exochelins对这些情况有效。
现在参见附图，特别是将目标分子Exochelin 772SM(R)与分支杆菌素S2(图1b)比较的图1a。在结构上，该分子虽然与分支杆菌素S2相似，但存在着显著的差异。Exochelin 772SM(R)有六碳链，末端是与非环异羟肟酸酯偶联的甲酯(图1c中的F亚单元)，而分支杆菌素S2在相应位置只有一个甲基。结构上的另一区别是立体化学性质的。两种化合物都有四个立构中心，分支杆菌素S2的四个都是S构型，而Exochelin 772SM(R)B亚单元内的是R构型。其余三个中心是与S2类似的S构型。这些区别要求对已知方法进行适当修改才能用于合成目标分子。
参见图1c(特别是标为A-F的加框的目标分子各官能单位)，本发明合成方法的目标首先是制备Exochelin 772SM(R)的E/D亚单位。Exochelin 772SM(R)(1a)和772SM(S)(1b)的合成概述由于结构类似，772SM(R)和772SM(S)的合成在某些方面与已知的分支杆菌素S2相似。772SM的非对映异构体之间的差异是标记显示的手性中心。在全合成方法中使用了一种集合方法，共需要22次合成转化。
Exochelin包含通过酯键相连的酸(CDEF单元)和己内酰胺(AB单元)。
按照文献记载，以L-6-羟基正亮氨酸为起始物通过5步合成制备单元AB，然后用Mitsunobu偶联法与单元CDEF相连。制得的己内酰胺与(S)-(+)-羟基丁酸偶联形成单元AB。
酸的制备沿着最长的线性序列，从L-6-羟基正亮氨酸开始，需要8步，用试剂2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)将赖氨酸衍生物(例如苄氧基羰基(Boc)游离胺)与丝氨酸偶联。在甲酯存在下选择性地去除烯丙酯，可制得一元酸。(Friedrich-Bochnitschek,S.,Waldmann,H.,Kunz,H.，有机化学杂志，1989,54,751)。
丝氨酸衍生物是按照已知方法，由水杨酸和L-丝氨酸通过四步合成的。(Maurer,P.J.,Miller,M.J.，美国化学协会杂志，1983,105,240；Maurer,P.J.,Miller,M.J.，美国化学协会杂志，1982,104,3096)。由庚二酸通过三步合成被保护异羟肟酸，用于形成单元F。(Swann,S.Jr.,Oehler,R.,Buswell,R.j.，有机合成杂志，第Ⅱ卷，1943,276；Cason，有机合成杂志，第Ⅲ卷，1955,169)。
S构型的合成与R相似，但需用(R)-(-)-羟基丁酸来制备单元AB。具体制备如图2-5所示，如下所述制备所需的Exochelin。A．庚二酸氢甲酯(7)庚二酸(15)(75.1g,0.47mol)，庚二酸二甲酯(50.1g,0.27mol)，盐酸(8ml,0.1mol)，甲醇(25ml,0.62mol)和二正丁基醚(20ml)的混合物在N2气氛下加热(100-110EC油浴)过夜。冷却至室温后，加入EtAOc(200ml)，混合物以水洗涤(2×100ml)，以NaCl(2×100ml)饱和，并干燥(Na2SO4)。分馏该粗制油(vigreux,125-130EC,0.7mmHg)，得到一种澄清的油状物(55.5g,68％，纯度95％。根据NMR分析，该澄清的油状物是庚二酸氢甲酯(7)(1H NMR):TLC(SiO2,MeOH/EtOAc/己烷(2∶8∶15,v/v)Rf=0.25-0.34；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ3.67(s,3H),2.40-2.28(m,4H),1.72-1.58(m,4H),1.45-1.32(m,2H)。B．庚二酸甲酯酰氯(8)53gA制备的庚二酸氢甲酯(7)(0.3mol)与亚硫酰氯(30ml,0.4mol)和二甲基甲酰胺(0.3ml)混合，搅拌加热过夜(油浴，52EC)。然后蒸馏去除过量的亚硫酰氯。所得的粗制油经蒸馏(0.6mmHg,80-90EC)生成澄清的油状物(54.1g,92％，纯度95％。根据NMR分析，该澄清的油状物是庚二酸甲酯酰氯(8)(1H NMR):1HNMR(300MHz,CDCl3)δ3.67(s,3H),2.90(t,J=7.8Hz,2H),2.33(t,J=7.3Hz,2H),1.80-1.60(m,4H),1.45-1.30(m,2H)。C．O-苄基甲基庚二酰基异羟肟酸酯(6)在N2气氛下制备盐酸O-苄基羟胺(43.3g,0.27mol)和三乙基胺(80ml,0.57mol)在CH2Cl2(800ml)中形成的悬浮液，用15分钟将52.2g步骤B制备的庚二酸甲酯酰氯(8)(0.27mol)加入该悬浮液中。室温下搅拌过夜，混合物用0.5NHCl(1×500ml),10％NaHCO3(1×500ml)洗涤，并干燥(Na2SO4)。经快速层析纯化(硅胶柱；EtOAc/己烷(2∶3,v/v)和EtOAc/己烷(1∶1,v/v))，得到浅灰色油状物(68.2g,98％)，经鉴定是O-苄基甲基庚二酰基异羟肟酸酯(6)；TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶1,v/v)Rf=0.13；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ7.34(br s,5H),4.85(br s,2H),3.62(s,3H),2.26(t,J=7.4Hz,2H),2.10-1.90(m,2H),1.70-1.50(m,4H),1.30-1.20(m,2H)；质谱(ESI),m/z280(MH+)。D．(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸(9)向(L)-6-羟基正亮氨酸(16)(12.0g,81.5mmol)和三乙基胺(11.4ml,81.8mmol)在四氢呋喃(THF)-水混合物(1∶1,420ml)中所成的溶液中加入焦碳酸二叔丁酯(BOC)2O(21.3g,97.6mmol)的THF(30ml)溶液。室温下搅拌过夜后，减压蒸发至一半体积。向该混合物中加入1N NaOH(100ml)并用EtOAc(3×100ml)洗涤。用柠檬酸(19.4g,101mmol)将水层酸化至pH3，并用EtOAc(3×100ml)萃取。干燥(Na2SO4)有机层，过滤，减压蒸发去除溶剂，得到澄清的油状物，在冷藏柜中结晶，得到白色固体(18.7g,93％)。将该物质溶于EtOAc(350ml)，加热(65EC浴)，向温热的溶液中逐步加入己烷(300ml)。让该溶液室温下静置过夜，白色晶体经鉴定是(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸(9)，过滤并以EtOAc-己烷(1∶1,4×30ml)洗涤(16.1g,80％):mp113-115EC(文献1的mp112-113EC)。E．(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯(10)(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸(9)(28.5g,115mmol),NaHCO3(15.5g,184mmol),氯化三辛基甲基铵(一种相转移催化剂)(10.1g,25mmol)，烯丙基溴(13ml,150mmol),CH2Cl2(100ml)和水(100ml)的混合物在N2气氛下室温下剧烈搅拌。8天后，将混合物过滤，并快速层析纯化(硅胶柱；EtOAc/己烷(1∶9,v/v)和EtOAc/己烷(2∶3,v/v))，得到浅灰色油状物(29.6g,89％)，经鉴定是(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯(10):TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶1,v/v)Rf=0.20；1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.96-5.85(m,1H),5.38-5.24(m,2H),5.09(br s,1H),4.72-4.58(m,2H),4.33(br s,1H),3.64(t,J=6.3Hz,2H),1.96-1.20(m,15H)；质谱(ESI),m/z286(M-H)-。
选用烯丙酯来保护(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸(9)的羧基。在温和条件下形成烯丙酯，不需要保护醇羟基。可在温和条件下，在甲酯存在下，用钯(O)-催化的转烯丙基反应去除烯丙酯。这一方法在以下化合物2的制备中获得了成功。还考虑了其他保护方法，例如苯甲酰甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙基和2,6-二甲氧基苄基酯。在用以上其他羧基保护基时，可能需要保护化合物9的醇羟基，而用来将它们切除的试剂(Zn/HOAc,DDQ)可能不适合化合物2中的其他官能团。F．(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯(11a)冷却(-10-20EC浴)步骤E制备的(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯(10)(40.6g,141mmol)和四溴化碳(51.6g,156mmol)在无水CH2Cl2(400ml)中所成的溶液，N2气氛下用25分钟向其中加入三苯基膦PPh3(40.9g,156mmol)。将混合物升至室温。约2小时后，减压浓缩混合物成为粘稠的油状物。向该油状物中加入EtOAc/己烷(3∶17,v/v,200ml)，过滤沉淀，用EtOAc/己烷(3∶17,v/v,500ml)洗涤。减压浓缩滤液，经快速层析纯化(硅胶柱；EtOAC/己烷(1∶19,v/v)和EtOAc/己烷(1∶4,v/v))得到浅黄色油状物，经鉴定是(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯(11a)(41.8g,84％):TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶1,v/v)Rf=0.60；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ5.97-5.85(m,1H),5.36-5.24(m,2H),5.20(br s,1H),4.70-4.58(m,2H),4.32(br s,1H),3.39(t,J=6.6Hz,2H),1.95-1.80(m,3H)；1.72-1.25(m,12H)；质谱(ESI),m/z350(MH+)。
以上反应也可以在四氢呋喃(THF)中进行，结果相同。作为第三种方法，可用二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(CH2Cl2)，由N-溴-琥珀酰亚胺生成11a。得率没有测定，但产物的Rf与11a的相同(TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶3,v/v))Rf=0.36。G．(L)-N-Boc-6-甲烷磺酰基正亮氨酸烯丙酯(11b)另一种方法是，冷却(OEC浴)步骤E制备的(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯(10)(80mg,0.28mmol)，三乙基胺(80μl,0.57mmol)，二甲基氨基吡啶(DMAP)(催化量)在无水CH2Cl2(1ml)中所成的溶液，N2气氛下向其中加甲烷磺酰基氯(27μl,0.34mmol)。将反应物加热至室温(tr)，减压浓缩混合物，经快速层析纯化(硅胶柱；EtOAc/己烷(1∶19,v/v))得到浅黄色油状物，经鉴定是(L)-N-Boc-6-甲烷磺酰基正亮氨酸烯丙酯(11b)(81mg,79％)TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶1,v/v)Rf=0.36；1HNMR(360MHz,CDCl3)δ5.98-5.84(m,1H),5.38-5.24(m,2H),5.08-4.96(m,1H),4.70-4.58(m,2H),4.38-4.26(m,1H),4.21(t,J=6.4Hz,2H),2.99(s,3H)；1.95-1.35(m,15H)。
另一种方法是，可植被该甲烷磺酸酯，与异羟肟酸酯6偶联。据信，该甲烷磺酸酯能缩短总反应时间，并提高5的得率。H．(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯(5)(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯(11a)(19.5g,55.7mmol),O-苄基甲基庚二酰基异羟肟酸酯(6)(20.0g,71.6mmol)，碘化钾(KI)(5.0g,30.1mmol)和碳酸钾(K2CO3)(20.0g,144.7mmol)在无水丙酮(125ml)中混合，混合物在N2气氛下剧烈搅拌回流。6天后，再加入碘化钾(1.0g,6.0mmol)和碳酸钾(4.0g,28.9mmol)。第8天后，再加入碘化钾(1.0g,6.0mmol)和碳酸钾(4.0g,28.9mmol)。10天后，将混合物冷却至室温，加入EtOAc(100ml)，滤出固体。减压浓缩滤液，所得灰色油状物经快速层析纯化(硅胶柱；EtOAc/己烷(1∶4,v/v),EtOAc/己烷(2∶3,v/v)和EtOAc/己烷(3∶2,v/v))得到一种浅黄色油状物，经鉴定是(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯(5)(21.4g,70％):TLC(SiO2,EtOAc/己烷(1∶1,v/v)Rf=0.36；O-烷基化产物，Rf=0.56)；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ7.45-7.30(m,6H),5.95-5.82(m,1H),5.35-5.20(m,2H),5.10-5.00(m,1H),4.79(s,2H),4.65-4.55(m,2H),4.33-4.20(m,1H),3.66(s,3H),3.70-3.55(m,2H),2.37(t,J=7.5Hz,2H),2.99(t,J=7.5Hz,2H)；1.88-1.22(m,21H)；质谱(ESI),m/z549(MH+)。I．(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸)-赖氨酸烯丙酯(12)将三氟乙酸(TFA)(25ml,325mmol)加入冰浴中的(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯(5)(23.2g,325mmol)。以45EC浴加热混合物。约2小时后，减压蒸发去除过量的TFA，加入CH2Cl2(50ml)，用Na2CO3(1.5M,70ml)将pH调节至8.0(0-14pH试纸)。分离出有机层，用CH2Cl2(20ml)萃取水层。合并有机相，用K2CO3/Na2SO4(2∶3,50g)干燥，过滤得到一种固体中间体。用CH2Cl2(50ml)洗涤该中间体，将滤液加入(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸(4)(13.8g,43.8mmol)。室温下向生成的浅黄色溶液中加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)(11.3g,45.7mmol)，混合物在N2气氛下搅拌过夜。减压除溶剂，加入EtOAc(150ml)，混合物用0.25M HCl(2×100ml)和10％NaHCO3/饱和盐水(4∶1,250ml)洗涤。待乳液缓慢分离后，用EtOAc(1×50ml)回萃下层(basiclayer)。合并有机层，用饱和盐水洗涤(2×150ml),Na2SO4干燥。留下的桃红色油状物经快速层析纯化(硅胶柱；EtOAc/己烷(2∶1,v/v),EtOAc/己烷(4∶1,v/v)和EtOAc/己烷(9∶1,v/v))得到一种浅棕色粘稠的油状物，经鉴定是(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸)-赖氨酸烯丙酯(12)(24.8g,79％，纯度95％(1H NMR,TLC单点):TLC(SiO2,EtOAc/己烷(3∶1,v/v)Rf=0.20)；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ8.73(br d,J=6.8Hz,1H),8.20-8.14(m,1H),7.71-7.22(m,11H),7.10-7.00(m,2H),5.95-5.80(m,1H),5.35-5.18(m,4H),4.72(s,2H),4.70-4.45(m,4H),4.08-4.00(m,1H),3.65(s,3H),3.65-3.40(m,3H),3.15-3.05(m,1H),2.38-2.24(m,4H),1.90-1.48(m,8H),1.38-1.20(m,4H)；质谱(ESI),m/z746(MH+)。J．(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-((S)-2-(2-苄氧基)苯基)-2-嚼唑啉-4-羰基-赖氨酸烯丙酯(13)将亚硫酰氯(SOCl2)(19ml,260mmol)逐步加入(-3OEC浴)冷却的步骤I所得赖氨酸烯丙酯(12)(24.0g,32.2mmol)的无水四氢呋喃(THF)(80ml)溶液中。混合后，反应在(-2OEC)冰箱中放置过夜。将冷藏后的混合物滴加到1.2M的Na2CO3(500ml)中(最终pH-8)，用EtOAc萃取(2×150ml)。合并有机相，用饱和盐水洗涤(1×150ml)，而后干燥(Na2SO4)。所得金色油状物经快速层析纯化(硅胶柱；i-PrOH/己烷(1∶9,v/v),EtOAc/己烷(2∶1,v/v))得到一种浅棕色粘稠的油状物，经鉴定是(L)-N6-甲基庚二酰基-N6-(苄氧基)-N2-((S)-2-(2-苄氧基)苯基)-2-嚼唑啉-4-羰基-赖氨酸烯丙酯(13)(17.1g,73％，纯度95％(1H NMR):TLC(SiO2,EtOAc/己烷(3∶1,v/v)Rf=0.40)；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ7.83-7.78(m,1H),7.53-7.25(m,11H),7.20-7.12(m,1H),7.05-6.97(m,2H),5.95-5.80(m,1H),5.35-5.18(m,4H),4.91(dd,J=10.3,8.4Hz,1H),4.71(s,2H),4.65-4.47(m,5H),3.65(s,3H),3.52-3.40(m,2H),2.33-2.25(m,4H),1.80-1.15(m,12H)；质谱(ESI),m/z746(MH+),726(M-H)-。K．化合物14a将步骤J制备的噁唑啉-赖氨酸烯丙酯(13)(8.1g,11.1mmol)溶于无水CH2Cl2(50ml)中，N2气氛下室温下向其中加入吗啉(1.1ml,12.5mmol)和四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4)(0.1g,0.09mmol)。1小时后，减压除溶剂，向混合物中加入EtOAc(100ml)，有机相用0.25M HCl(1×60ml)，饱和盐水(3×50ml)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，减压除溶剂。将所得的浅棕色油状物以甲苯共蒸发(3×10ml)，真空干燥1小时，得到褐色玻璃状的酸2[质谱(ESI),m/z688(MH+),686(M-H)-]。将酸2,(L)-N6-((S)-3-羟基丁酰基)-α-氨基-N-(苄氧基)己内酰胺(3a)或3(b)(3.5g,10.9mmol)和PPh3(5.6g,21.4mmol)在无水THF(70ml)中形成溶液，N2气氛下冷却(OEC浴)，向其中逐步加入偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)(3.4ml,12.6mmol)。去除冷却浴，混合物搅拌过夜。减压除溶剂，金色油状物，即图5中的14a，经两次连续的快速层析纯化层析1(硅胶柱；i-PrOH/己烷(3∶7,v/v),i-PrOH/己烷(2∶3,v/v))，层析2(硅胶柱；CH2Cl2/EtOAc(3∶17,v/v),EtOAc))，得到浅棕色玻璃状物(5.3g,49％，纯度90-95％(1H NMR):TLC(SiO2,MeOH/EtOAc(1∶32,v/v)Rf=0.30)；1HNMR(360MHz,CDCl3)δ7.80(dd,J=8.0,1.7Hz,1H),7.49(br d,J=7.0Hz,2H),7.45-7.24(m,14H),7.19(br d,J=8.0Hz,1H),7.04-6.96(m,3H),5.37-5.18(m,3H),5.02-4.85(m,3H，包括AB四重峰4.98(J=8.0Hz),4.88(J=8.0Hz)),4.71(s,2H),4.63-4.52(m,2H),4.50-4.41(m,2H),3.68-3.40(m,4H),3.65(s,3H),2.55(dd,J=14.5,6.8Hz,1H),2.44(dd,J=14.5,5.9Hz,1H),2.36-2.25(m,4H),2.02-1.82(m,2H),1.80-1.15(m,16H),1.30(d,J=6.3Hz,3H)；质谱(ESI),m/z991(MH+),989(M-H)-。
TLC发现，酸2应该立即使用，因为低温(4EC)保存过夜时会部分分解。
对上述Mitsunobu偶联的部分替换包括1.用混合酸酐、N-乙酰基咪唑和活化酯(例如BOP)来活化羧基。
2．用二环己基碳二亚胺(DCC)活化羟基。L．化合物14b制备方法与14a相同，得率相近，但使用的是(L)-N6-((R)-3-羟基丁酰基)-α-氨基-N-(苄氧基)己内酰胺(3b):TLC(SiO2,MeOH/EtOAc(1∶32,v/v)Rf=0.30)；1HNMR(360MHz,CDCl3)δ7.80(dd,J=8.0,1.7Hz,1H),7.50(br d,J=7.1Hz,2H),7.44-7.26(m,14H),7.18(br s,1H),7.04-6.96(m,3H),5.35-5.18(m,3H),5.03-4.85(m,3H，包括AB四重峰4.92(J=10.5Hz),4.82(J=10.5Hz)),4.71(s,2H),4.63-4.52(m,2H),4.48-4.39(m,2H),3.67-3.58(m,1H),3.65(s,3H),3.56-3.41(m,3H),2.57(dd,J=14.5,6.9Hz,1H),2.40(dd,J=14.5,6.2Hz,1H),2.36-2.24(m,4H),2.02-1.95(m,1H),1.95-1.82(m,1H),1.82-1.18(m,16H),1.33(d,J=6.3Hz,3H)；质谱(ESI),m/z990(MH+),988(M-H)-。M．Exochelin 772SM(R)(1a)在一圆底烧瓶中，将步骤K或L中分离所得物质(5.5g,5.6mmol)与MeOH(350ml)混合，并用N2驱除空气。加入10％Pd/C，将一个充满H2的气球与该烧瓶连接。室温搅拌过夜后，让10％Pd/C沉淀，用0.45μm的抽滤器过滤溶液。留下的固体用MeOH(20ml)洗涤，同样地过滤。减压除溶剂，与CH2Cl2共蒸发，得到米白色薄片状固体(3.8g,95％，纯度95％,Fe含量1.9％)。NMR分析显示，这是所要的通式1a所示的Exochelin。TLC(SiO2,MeOH/CH2Cl2(1∶19,v/v)Rf=0.14-0.24)；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ7.63(d(有进一步的小偶合),J=8.0Hz,1H),7.35(t(有进一步的小偶合),J=8.3Hz,1H),6.95(d,J=8.3Hz,1H),7.4-6.9(m,2H),6.85(t(有进一步的小偶合),J=8.0Hz,1H),5.28-5.15(m,1H),4.90(t,J=9.5Hz,1H),4.65-4.49(m(包括二核体4.60,J=9.5Hz),3H),4.45(br dd,J=10.2,6.3Hz,1H),3.80-3.62(m,2H),3.59(s,3H),3.55-3.35(m,2H),2.50(d,J=5.7Hz,2H),2.48-2.10(m包括三重峰，2.23(J=7.3Hz)),4H),1.98-1.42(m,13H),1.42-1.20(m包括二重峰，3.65(s,3H),3.56-3.41(m,3H),2.57(dd,J=14.5,6.9Hz,1H),2.40(dd,J=14.5,1.28(J=6.1Hz)),8H)；质谱(ESI),m/z720(MH+),718(M-H)-。化合物1b
用制备1a的方法，由化合物14b制备，得率相近，所得米白色薄片状固体TLC(SiO2,MeOH/CH2Cl2(1∶32,v/v)Rf=0.0-0.13)；1H NMR(360MHz,CDCl3)δ7.69(d(有进一步的小偶合),J=8.0Hz,1H),7.42(t(有进一步的小偶合),J=8.3Hz,1H),7.20-7.0(br s,2H),7.02(d,J=8.6Hz,1H),6.91(t(有进一步的小偶合),J=8.0Hz,1H),5.35-5.25(m,1H),4.95(t,J=9.5Hz,1H),4.65(br d,J=9.5Hz,2H),4.58-4.48(m,2H),3.82-3.50(m(包括单峰3.65),7H),2.60-2.20(m包括三重峰，2.31(J=7.4Hz)),6H),2.08-1.20(m包括二重峰，1.35(J=6.6Hz)),21H)；质谱(ESI),m/z720(MH+),718(M-H)-。对合成去铁(Desferri)-Exochelins功能的研究对按照以上步骤制备的Exochelins进行的检测显示，它们在治疗中的性能与先前生物学来源的Exochelins相当。I．合成去铁Exochelin 772SM(R)A．螯合铁的能力为了测定合成的去铁Exochelin772SM(R)是否能象其天然形式那样与铁螯合，将该Exochelin溶于0.1％TFA，其中含有10倍过量于Exochelin的柠檬酸铁铵。然后将该溶液上样到Bondapak Phenyl 125 10μm(3.9×300mm)HPLC柱上，在Rainin(Woburn,MA)HPXL系统上对Exochelin进行反相HPLC(高压液相层析)。用0-100％梯度缓冲液(含0.1％TFA和50％乙腈),1ml/min流速洗脱Exochelin。在220nm和450nm处检测铁-Exochelin。测定450nm峰下的面积，乘以分析已知量铁Exochelin772SM(R)得出的换算因子，得出铁Exochelin的质量。
没有柠檬酸铁铵时，只有少量铁-Exochelin从HPLC柱上洗脱，占加入Exochelin的1.08％。有柠檬酸铁铵时，100％地从HPLC柱上洗脱含铁形式的Exochelin。
因此，合成的去铁-Exochelin772SM(R)能在溶液中迅速地螯合铁。B．反相HPLC上的洗脱特性将合成Exochelin772SM(R)和天然Exochelin772SM(R)各自溶于含0.1％TFA和过量柠檬酸铁铵的水中，分别如前所述上样到苯基柱上。在Rainin(Woburn,MA)HPXL系统上，用0-100％梯度缓冲液(含0.1％TFA和50％乙腈),1ml/min流速洗脱Exochelin。根据450nm吸光度来鉴定Exochelins。
在反相HPLC上，合成Exochelin772SM(R)和天然Exochelin772SM(R)在相同的乙腈浓度洗出。而且，将这两种Exochelin混合进行反相HPLC时，洗出的是一个单峰，测定450nm吸收峰下的面积，乘以分析已知量铁Exochelin772SM(R)得出的换算因子，算得该峰下Exochelin的质量等于两种物质的质量之和。
因此，合成Exochelin772SM(R)与天然Exochelin772SM(R)具有相同的反相HPLC洗脱特性。C．从其他Exochelin中去除铁的能力为了测定合成去铁-Exochelin772SM(R)与铁的亲和力，测定了它从另一种Exochelin，铁-Exochelin758SM中去除铁的能力。还测定并比较了合成和天然Exochelin772SM(R)从铁-Exochelin758SM中去除铁的能力。将天然或合成Exochelin772SM(R)各自与铁-Exoehelin758SM混合。如前所述在苯基柱上对Exochelin进行反相HPLC，测定450nm吸收峰下的面积，如此测定1小时内去铁-Exochelin获得的铁量。然后，乘以分析已知量铁Exochelin772SM(R)得出的换算因子，算得铁-Exochelin的量。
在第一实验中，将26.1μg 1.1％铁饱和合成Exochelin772SM(R)与17.8μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是41.2％。1小时后，合成Exochelin772SM(R)的铁饱和度是33.5％，即理论平衡铁饱和度的81.3％(表1，实验Ⅰa)。
重复以上过程，将15.1μg 2.8％铁饱和天然Exochelin772SM(R)与16.9μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是54.1％。1小时后，天然Exochelin772SM(R)铁饱和度是46.4，即理论平衡铁饱和度的85.8％(表1，实验Ⅰb)。
在第二个实验中，17.3μg 1.1％铁饱和合成Exochelin772SM(R)与19.8μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是53.9％。1小时后，合成Exochelin772SM(R)的铁饱和度是48.6％，即理论平衡铁饱和度的90.2％(表1，实验Ⅱa)。
将15.8μg 2.8％铁饱和天然Exochelin772SM(R)与19.1μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是55.9％。1小时后，天然Exochelin772SM(R)铁饱和度是45.6％，即理论平衡铁饱和度的81.6％(表1，实验Ⅱb)。
以上实验证明a)合成去铁-Exochelin772SM(R)与铁有很高的亲和力，因为它能够从已知与铁具有高亲和力的铁结合性分子中迅速的去除铁，b)合成和天然的去铁-Exochelin772SM(R)从高亲和力铁结合分子中除铁的能力相当。
表1合成和天然去铁-Exochelin772SM(R)从另一种Exochelin(铁-Exochelin758SM)中除铁的能力实验Ⅰ
实验Ⅱ
Ⅱ．合成去铁-Exochelin772SM(S)对(S)构型的化合物重复以上对(R)构型的测试。A．螯合铁的能力如上所述，在含有10倍过量三价铁(柠檬酸铁铵)的溶液中测定合成去铁-Exochelin772SM(S)与铁螯合的能力。没有柠檬酸铁铵时，只有1.03％的Exochelin含铁。有柠檬酸铁铵时，全部Exochelin都被铁饱和。
因此，合成去铁-Exochelin772SM(S)在溶液中能迅速地螯合铁。B．反相HPLC上的洗脱特性分别将合成Exochelin772SM(S)和天然Exochelin772SM(R)稀释在含0.1％TFA和物质量10倍过量三价铁(柠檬酸铁铵)的水中，分别如前所述进行反相HPLC。
合成Exochelin772SM(S)以乙腈梯度洗脱比天然Exochelin772SM(R)慢1分钟。
因此，因为一个不对称碳原子上的立构改变，合成Exochelin772SM(S)的洗脱特性与天然Exochelin772SM(R)略有不同。C．从其他Exochelin中去除铁的能力为了测定合成去铁-Exochelin772SM(S)与铁的亲和力，测定了它从另一种Exochelin，铁-Exochelin758SM中去除铁的能力。还测定并比较了合成去铁-Exochelin772SM(S)和天然去铁Exochelin772SM(R)从铁-Exochelin758SM中去除铁的能力。将合成去铁-Exochelin772SM(S)或天然去铁-Exochelin772SM(R)各自与铁-Exochelin758SM混合。如前所述，在苯基柱上对它们进行反相HPLC，测定450nm吸收峰下的面积，如此测定1小时内去铁-Exochelin获得的铁量。然后，乘以分析己知量铁-Exochelin772SM(R)和铁-Exochelin772SM(S)得出的换算因子，算得铁-Exochelin的量。
具体地说，17.4μg 1.0％铁饱和合成Exochelin772SM(S)与13.5μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是44.3％。1小时后，合成Exochelin772SM(S)的铁饱和度是39.4％，即理论平衡铁饱和度的89.6％(表2，实验Ⅰ)。
实验2中，13.0μg 2.8％铁饱和天然Exochelin772SM(R)与13.3μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是52.1％。1小时后，天然Exochelin772SM(R)铁饱和度是46.2％，即理论平衡铁饱和度的88.7％(表1，实验2)。
第3项证据是比较合成去铁-Exochelin772SM(S)与合成去铁-Exochelin772SM(R)从其他Exoehelin中去除铁的能力。
15.6μg 1.1％铁饱和合成Exochelin772SM(R)与13.6μg 100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这两种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是47.3％。1小时后，合成Exochelin772SM(R)铁饱和度是42.9％，即理论平衡铁饱和度的90.7％(表1，实验3)。
以上实验证明a)合成去铁-Exochelin772SM(S)与铁有很高的亲和力，因为它能够从已知与铁具有高亲和力的铁结合性分子中迅速的去除铁，b)合成去铁-Exochelin772SM(S)和天然去铁-Exochelin772SM(R)从高亲和力铁结合分子中除铁的能力相当；c)合成立体异构体去铁-Exochelin772SM(S)与772SM(R)与铁的亲和力相当。
表2合成去铁-Exochelin772SM(S)，天然去铁-Exochelin772SM(R)和合成去铁-Exochelin772SM(R)从另一种Exochelin(铁-Exochelin758SM)中除铁的能力实验1
实验2
实验3
Ⅲ．合成去铁-Exochelin772SM(R)与772SM(S)的比较为了进一步评价立体异构体去铁-Exochelin772SM(R)和772SM(S)与铁的相对亲和力，在同一试管中比较了它们从另一种Exochelin除铁的能力。
在实验中，15.6μg 1.1％铁饱和合成Exochelin772SM(R)与17.4μg 1.0％铁饱和合成Exochelin772SM(S)一起与13.5μg100％铁饱和天然Exochelin758SM混合。假设这三种Exochelin与铁具有相当的亲和力，平衡时的算得铁饱和度应是29.9％。1小时后，合成Exochelin772SM(R)的铁饱和度是28.2％，即理论平衡铁饱和度的94.3％,Exochelin772SM(S)的铁饱和度是25.9，即理论平衡铁饱和度的86.6％(表3)。
因此，这两种立体异构体与铁的亲和力几乎相同。
表3合成去铁-Exochelin772SM(S)和合成去铁-Exochelin772SM(R)从另一种Exochelin(铁-Exochelin758SM)中除铁的能力
Ⅳ．天然去铁-Exochelin772SM(R)，合成去铁-Exochelin772SM(R)和合成去铁-Exochelin772SM(S)从40％铁饱和运铁蛋白，全-运铁蛋白和脱辅基运铁蛋白中除铁的能力A．40％铁饱和的人运铁蛋白为了测定3种不同去铁-Exochelin从40％铁饱和的人运铁蛋白中除铁的能力，将它们各自与40％铁饱和运铁蛋白共培养1,3和24小时，其中Fe3+去铁-Exochelin等于10∶1。培养在PBS,pH7.4中进行。然后，通过以10,000Da截留值的滤膜离心，将Exochelin与运铁蛋白分离。运铁蛋白(质量76,000Da)被滤膜完全截留，从滤液中则可回收到85％的Exochelin(质量＜1,000Da)。为了测定回收所得Exochelin的总量，用20∶1摩尔过量的柠檬酸铁铵饱和滤液中的Exochelin，并如前所述地进行反相HPLC。为了测定各时刻滤液中铁饱和Exoehelin的量，不加铁而对滤液进行反相HPLC。如下铁饱和百分比计算
各种去铁-Exochelin都以时间依赖性方式去除40％铁饱和运铁蛋白中的铁(表4)。24小时后，天然去铁-Exochelin772SM(R)的铁饱和度为34.0％，合成去铁-Exochelin772SM(R)的为39.2％，合成去铁-Exoehelin772SM(S)的为35.3％。因此，这三种去铁-Exochelin都能有效去除40％饱和的铁-Exochelin中的铁，而且它们的除铁能力大致相当。
表4合成和天然去铁-Exochelin772SM(R)以及合成去铁-Exochelin772SM(S)从40％铁饱和的人运铁蛋白中除铁的能力
B．全-运铁蛋白(92％铁饱和人运铁蛋白)为了测定3种不同去铁-Exochelin从全-运铁蛋白(92％铁饱和的人运铁蛋白)中除铁的能力，将它们各自与92％铁饱和运铁蛋白共培养1,3和24小时，其中，和以上就40％铁饱和运铁蛋白所述一样，Fe3+去铁-Exochelin等于10∶1。如上所述测定％铁饱和度。
各种去铁-Exochelin都以时间依赖性方式去除92％铁饱和运铁蛋白中的铁(表5)。24小时后，天然去铁-Exochelin772SM(R)的铁饱和度为54.1％，合成去铁-Exochelin772SM(R)的为60.0％，合成去铁-Exochelin772SM(S)的为47.2％，这三种去铁-Exochelin都能有效去除92％饱和的人铁运铁蛋白中的铁，而且它们的除铁能力大致相当。
表5合成和天然去铁-Exochelin772SM(R)以及合成去铁-Exochelin772SM(S)从92％铁饱和的人运铁蛋白中除铁的能力
C．去辅基运铁蛋白(＜0.7％铁饱和人运铁蛋白)作为对照，将38mg/ml的3种去铁-Exochelin与人去辅基运铁蛋白(＜0.7％铁饱和人运铁蛋白)的共培养3小时和24小时，蛋白质的浓度与B中92％铁饱和人运铁蛋白研究中的相同。3种去铁-Exochelin都没有获得显著量的铁(表6)。
表6合成和天然去铁-Exochelin772SM(R)以及合成去铁-Exochelin772SM(S)从人去辅基运铁蛋白(＜0.7％铁饱和)中除铁的能力
根据以上所述，本领域熟练技术人员可以看出，如果用以下通式B所示的同族酸取代庚二酸15，就可获得表7所列的各种不同Exochelin。表7列举了代表性的酸和获得的Exochelin。
CO2H-(CH2)n-CO2HB表7其他酸试剂和所得的Exochelin丝氨酸饱和系列B n Exochelin(mw)壬二酸 7 800 SM(R)或SM(S)辛二酸 6 786 SM(R)或SM(S)庚二酸 5 772 SM(R)或SM(S)己二酸 4 758 SM(R)或SM(S)戊二酸 3 744 SM(R)或SM(S)丁二酸 2 730 SM(R)或SM(S)丙二酸 1 716 SM(R)或SM(S)苏氨酸饱和系列B n C(mw)壬二酸7814 TM(R)或TM(S)辛二酸6800 TM(R)或TM(S)庚二酸5786 TM(R)或TM(S)己二酸4772 TM(R)或TM(S)戊二酸3758 TM(R)或TM(S)丁二酸2744 TM(R)或TM(S)丙二酸1730 TM(R)或TM(S)此外，如果用通式D所示的酸取代酸15，则将得到表8所列的Exochelin。其中，左栏是可替换的酸制剂。
CO2H-(CH2)xCH=(CH2)y-CO2HD表8其他酸试剂和所得的Exochelin丝氨酸不饱和系列D 酸 ExochelinxyXY1001反-戊烯二酸 742 SM(R)或SM(S)11反-3-己烯二酸756 SM(R)或SM(S)0220反-2-己烯二酸756 SM(R)或SM(S)1221反-3-庚烯二酸770 SM(R)或SM(S)0330反-2-己烯二酸770 SM(R)或SM(S)0440反-2-辛烯二酸784 SM(R)或SM(S)1331反-3-辛烯二酸784 SM(R)或SM(S)22反-4-辛烯二酸784 SM(R)或SM(S)0550反-2-辛烯二酸798 SM(R)或SM(S)1441反-3-壬烯二酸798 SM(R)或SM(S)2332反-4-壬烯二酸798 SM(R)或SM(S)苏氨酸不饱和系列D酸 ExochelinxyXY1001反-戊烯二酸 752 TM(R)或TM(S)11反-3-己烯二酸770 TM(R)或TM(S)0220反-2-己烯二酸770 TM(R)或TM(S)1221反-3-庚烯二酸784 TM(R)或TM(S)0330反-2-己烯二酸784 TM(R)或TM(S)0440反-2-辛烯二酸798 TM(R)或TM(S)1331反-3-辛烯二酸798 TM(R)或TM(S)22反-4-辛烯二酸798 TM(R)或TM(S)0550反-2-辛烯二酸812 TM(R)或TM(S)1441反-3-壬烯二酸812 TM(R)或TM(S)2332反-4-壬烯二酸812 TM(R)或TM(S)根据以上所述，选用饱和或不饱和酸可产生不同的Exochelin。
虽然以上通过优选形式及其用途对本发明进行了详细的描述，仍可能存在其他形式和用途。所以，权利要求书的精神和范围不应理解成仅限于以上优选形式。
权利要求
1．一种合成Exochelin的方法，其步骤包括a)将一种有机酸与庚二酸二甲酯，盐酸，甲醇和二正丁基醚反应，生成甲基化的酸；b)将甲基化酸与亚硫酰氯和二甲基甲酰胺混合，以氯取代酸上的一个OH基团；c)将b)的产物加入盐酸O-苄基羟胺和三乙基胺在CH2Cl2中形成的悬浮液，生成异羟肟酸O-苄基甲酯；d)向(L)-6-羟基正亮氨酸和三乙基胺在四氢呋喃(THF)-水中所成的溶液中加入焦碳酸二叔丁酯的THF溶液；e)分离出水层，用柠檬酸将水层酸化至pH3，并用EtOAc萃取；f)干燥并纯化EtOAc层，生成(L)-N-Boo-6-羟基正亮氨酸；g)将(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸与烯丙基溴反应，生成(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯；h)将无水CH2Cl2中的四溴化碳和三苯基膦加入(L)-N-Boc-6-羟基正亮氨酸烯丙酯，形成粘稠的油状物；i)将该粘稠的油状物加入EtOAc/己烷，生成(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯；j)在无水丙酮中将(L)-N-Boc-6-溴正亮氨酸烯丙酯与异羟肟酸O-苄基甲酯，碘化钾(KI)和碳酸钾混合，生成(L)-N6-甲基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯；k)将三氟乙酸加入(L)-N6-甲基-N6-(苄氧基)-N2-Boc-赖氨酸烯丙酯，形成一种固体中间体，将该固体中间体加入(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸和2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉，生成(L)-N6-甲基-N6-(苄氧基)-N2-(L)-N-(2-(苄氧基)苯甲酰基)丝氨酸)-赖氨酸烯丙酯；1)将亚硫酰氯逐步加入赖氨酸烯丙酯的无水四氢呋喃溶液中，纯化形成的液体，生成(L)-N6-甲基-N6-(苄氧基)-N2-((S)-2-(2-苄氧基)苯基)-2-噁唑啉-4-羰基-赖氨酸烯丙酯；m)将吗啉和四(三苯基膦)钯加入嚼唑啉-赖氨酸烯丙酯的无水CH2Cl2溶液中，生成酸；n)将(L)-Nα-((S)-3-羟基丁酰基)-α-氨基-N-(苄氧基)己内酰胺的无水THF溶液加入该酸，然后加入偶氮二羧酸二乙酯；o)将所得物质与MeOH,10％Pd/C和H2混合，然后将MeOH与CH2Cl2共蒸发掉，得到Exochelin。
2．根据权利要求1所述的方法，其中的酸是庚二酸，所得的最终产物是Exochelin 772SM(R)。
3．根据权利要求1所述的方法，其中的有机酸是具有以下通式的酸的混合物CO2H-A-CO2H其中的A是(CH2)n或(CH2)xCH=CH(CH2)y,n等于1-7,x和y等于0-5。
全文摘要
一种合成高亲和力铁结合化合物Exochelins的方法,更具体地说是合成或制造Exochelins并对新合成的化合物进行修饰以改变其生理学特性的方法,还包括新合成的化合物诊断和治疗哺乳动物疾病的用途。
文档编号C07K5/06GK1312818SQ99809647
公开日2001年9月12日 申请日期1999年2月19日 优先权日1998年8月14日
发明者L·S·杰拉西, S·G·利维, J·P·赫德斯佩特, R·L·巴斯韦尔, J·F·斯特恩斯 申请人:基斯东生物医学股份有限公司