脑膜炎奈瑟氏球菌抗原性多肽、相应多核苷酸和保护性抗体的制作方法

专利名称：脑膜炎奈瑟氏球菌抗原性多肽、相应多核苷酸和保护性抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苷酸(这里指“BASB030多核苷酸”)、它们编码的多肽(这里指“BASB030”或“BASB030多肽”)、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核苷酸包括抵抗细菌感染的疫苗的方法。再一方面，本发明涉及检测特定病原体感染的诊断试验。
背景技术：
脑膜炎奈瑟氏球菌(脑膜炎球菌)是一种能经常从人的上呼吸道分离到的革兰氏阴性细菌。它偶尔能导致侵袭性的细菌疾病如菌血症和脑膜炎。脑膜炎疾病的发生显示出地理、季节和年度差异(Schwartz,B.Moore,P.S.,Broome,C.V.；《临床微生物综述》2(增刊)，S18-S24,1989)。在温带国家，多数疾病是由血清型B菌株引起的，年发病率在总人数的十万分之一至十万分之十之间变化，有时会达到更高的数值(Kaczmarski,E.B.(1997),Commun.Dis.Rep.Rev.7:R55-9,1995；Scholten,R.J.P.M.,Bijlmer,H.A.,Poolman,J.T.等《临床感染性疾病》16:237-246,1993；Cruz,C.,Pavez,G.,Aguilar,E.，等《感染流行病学》105:119-126,1990)。
由血清型A脑膜炎球菌引起的流行病，主要在中部非洲，有时能达到每年十万分之一千(Schwartz,B.,Moore,P.S.,Broome,C.V.《临床微生物综述》2(增刊)，S18-S24,1989)。就脑膜炎疾病的整体来看，几乎所有的病例都是由血清型A、B、C、W-135和Y脑膜炎球菌引起的，并且可以使用一种4价A、C、W-135、Y的多糖疫苗(Armand,J.,Arminjon,F.,Mynard,M.C.,Lafaix,C.,《J.Biol.Stand》10:335-339,1982)。多糖疫苗目前正通过将它们与载体蛋白化学偶联的方式进行改进(Lieberman,J.M.,Chiu,S.S.,Wong,V.K.等，JAMA 275:1499-1503,1996)。
尚未获得一种血清型B的疫苗，因为B的荚膜多糖被发现是非免疫原性的，很可能是由于它与宿主成分具有结构上的相似性(Wyle,F.A.,Artenstein,M.S.,Brandt,M.L.等，《传染病杂志》126:514-522,1972；Finne,J.M.,Leinonen,M.,Mkel,P.M.《柳叶刀》ii:355-357,1983)。
为开发以脑膜炎球菌外膜为基础的疫苗，人们已经努力了多年(deMoraes,J.C.,Perkins,B.,Camargo,M.C.等《柳叶刀》340:1074-1078,1992；Bjune,G.,Hoiby,E.A.Gronnesby,J.K.等，338:1093-1096,1991)。这种疫苗已证明在大儿童(＞4岁)和成年人中的有效性为57％-85％。
这些疫苗中存在许多细菌外膜组分，例如PorA、PorB、Rmp、Opc、Opa、FrpB，这些成分对观察到的保护作用所作的贡献仍需进一步确定。使用动物或人抗体已经确定了可能与保护性免疫的诱导相关的其他细菌外膜组分，例如TbpB和NspA(Martin,D.,Cadieux,N.,Hamel,J.,Brodeux,B.R.,《实验医学杂志》185:1173-1183,1997；Lissolo,L.,Maitre-Wilmotte,C.,Dumas,P.等，Inf.Immun.63:884-890,1995)。保护性免疫的机制将涉及抗体介导的杀菌活性和吞噬调理作用。
一种菌血动物模型已被用来组合所有的抗体介导机制(Saukkonen,K.,Leinonen,M.,Abdillahi,H.Poolman,J.T.《疫苗》7:325-328,1989)。一般认为，晚期补体组分介导的杀菌机制对抵抗脑膜炎疾病的免疫来说至关重要(Ross,S.C.,Rosenthal P.J.,Berberic,H.M.,Densen,P.J.《传染病杂志》155:1266-1275,1987)。
在过去几十年中，脑膜炎奈瑟氏球菌的发病率有了很大的提高。这已被归咎为多重抗生素抗性菌株的出现和具有较弱的免疫系统的人群体的增加。分离对某些或所有标准抗生素具有抗性的菌株不再是异常。这种现象就使我们产生了针对这种微生物的新型抗微生物试剂、疫苗、药物筛选方法和诊断试验的永不满足的需求。
发明简述本发明涉及BASB030特别是BASB030多肽和BASB030多核苷酸、重组物质以及它们的制备方法。在另一个方面，本发明涉及使用这种多肽和多核苷酸的方法，包括微生物疾病的预防与治疗及其他。在一个进一步的方面，本发明涉及检测与微生物感染有关的疾病及与这样的感染有关的症状的诊断试验，例如检测BASB030多核苷酸或多肽的表达或活性的试验。
通过阅读下面的描述和本公开的其他部分，本领域的技术人员将很容易理解在本发明公开的精神和范围之内的各种改变和修饰。
发明详述如下文的详细介绍，本发明涉及BASB030多肽和多核苷酸。具体地说，本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB030的多肽和多核苷酸，BASB030与淋病奈瑟氏球菌PilQ外膜蛋白在氨基酸序列上具有同源性。本发明尤其涉及具有分别列于SEQ ID NO:1,3,5和SEQ ID NO:2,4,6的核苷酸和氨基酸序列的BASB030。应当理解，在后面的序列表中列举为“DNA”的序列代表本发明的一个实施方案的举例，因为普通的技术人员就知道，这样的序列通常被用作多核苷酸，包括多核糖核苷酸。多肽在本发明的一个方面，提供了在这里被称为“BASB030”和“BASB030多肽”的脑膜炎奈瑟氏球菌的多肽，及其在生物学、诊断、预防、临床或治疗上有用的变体，以及含有它们的组合物。本发明进一步提供(a)含有这样一种氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；(b)由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸序列分别与SEQ ID NO:1,3,5的整个长度具有至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或完全相同；或者(c)由含有如下一种多核苷酸序列的分离多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸序列编码这样一种多肽，这种多肽与SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；SEQ ID NO:2,4,6中提供的BASB030多肽是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090和H44/76的BASB030多肽。
本发明还提供BASB030多肽的一种免疫原性片段，即BASB030多肽的一个连续的部分，它与含有SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原性活性。也就是说，该片段(必要时可与一种载体偶联)能够产生能识别BASB030多肽的免疫应答。这种免疫原性片段可包括诸如缺少N-末端前导序列和/或跨膜区域和/或C-末端锚定区域的BASB030多肽。在一个优选的方面，根据本发明的BASB030的免疫原性片段包含基本上一种多肽的所有胞外结构域，其中该多肽与SEQ ID NO:2,4,6在SEQ ID NO:2的整个长度上至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性；片段是这样一种多肽，它具有与本发明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分而不是全部完全相同的氨基酸序列。就BASB030多肽而言，片段可以是“独立存在”，或处于一个较大的多肽中，在一个单独的较大多肽中组成一个部分或区域，优选是一种单个的连续区域。
优选的片段包括，诸如具有SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列的一个部分的截短的多肽或其变体，例如包括氨基末端和或羧基末端氨基酸序列的连续残基系列。用或在一种宿主细胞中制备的本发明的多肽的降解形式也是优选的。更优选的是具有结构或功能特征的片段，例如含有α螺旋和α螺旋形成区域、β折叠和β折叠形成区域、转角和转角形成区域、线团和线团形成区域、亲水区域、疏水区域、α两亲性区域、β两亲性区域、柔性区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原性区域的片段。
更优选的片段包括含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列具有SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸；或含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列具有从SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列截短或缺失的至少15、20、30、40、50或100个连续氨基酸。
本发明的多肽片段可用于通过肽合成制备相应的全长多肽；因此，这些片段可用作制备本发明的全长多肽的中间体。
特别优选的是变体，其中以任何组合方式取代、缺失或添加了几个、5-10、1-5、1-3、1-2或1个氨基酸。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是一种较大蛋白如前体或融合蛋白的一部分。通常优选包含含有分泌或前导序列、前序列、能协助纯化的序列如多组氨酸残基，或能在重组制备过程中起稳定作用的额外序列。而且，还考虑加入外源性多肽或脂类尾巴或多核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性能力。
在一个方面，本发明涉及遗传工程制备的可溶性融合蛋白，这种融合蛋白含有本发明的一种多肽或其片段以及各亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链的恒定区的各种部分。优选的是，免疫球蛋白是人IgG特别是IgG1的恒定区部分，而融合发生在铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可简单地通过引入一个切割序列而去除，这种切割序列可用血凝因子Xa切割。
而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，以及涉及它们在药物筛选、诊断和治疗中的应用。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可在国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914中发现。
蛋白质可通过化学方法接合，或以重组融合蛋白的形式表达，这种融合蛋白形式能比非融合蛋白在一种表达系统以较高水平制备。融合配体可帮助提供T辅助表位(免疫性融合配体)，优选的是能被人识别的T辅助表位；或者能帮助蛋白比原来的重组蛋白以较高产量进行表达的T辅助表位(表达增强子)。融合配体优选既是一种免疫性融合配体，又是表达增强子配体。
融合配体包括来自嗜血流感菌的蛋白D和来自流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。另一种融合配体是被称为LytA的蛋白。优选使用该分子的C末端部分。LytA来自肺炎链球菌，它合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶-LytA酰胺酶(由lytA基因编码{《基因》43(1986)265-272页})，后者是一种自溶素，它特异性地降解肽聚糖骨架中的某些键。LytA蛋白的C末端区域负责与胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和性。这种特性已被用于发展能用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。在其氨基端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已经有介绍{《生物技术》10卷(1992)795-798页}。可以使用LytA分子中在C末端发现的重复部分，从残基178开始，例如残基188-305。
本发明还包括前面提到的多肽的变体，即通过保守性氨基酸取代与参照物不同的多肽，其中一种残基被另一种具有相似特征的残基取代。典型的这种取代在如下氨基酸之间Ala、Val、Leu和Ile；Ser和Thr；酸性残基Asp和Glu；Asn和Gln；碱性残基Lys和Arg；或芳族残基Phe和Tyr。
本发明的多肽可以任何合适的方式进行制备。这种多肽包括分离的天然产生的多肽、重组制备的多肽、合成制备的多肽、或用这些方法的组合制备的多肽。制备这种多肽的方法在本领域是熟知的。
本发明的多肽更优选来自脑膜炎奈瑟氏球菌，但它也优选可获自相同分类学属的其他生物体。本发明的多肽还可获自诸如相同分类学科或目的生物体。多核苷酸本发明的一个目的是提供编码BASB030多肽的多核苷酸，特别是编码这里被称为BASB030的多肽的多核苷酸。
在本发明的特别优选的实施方案中，多核苷酸包含一个编码BASB030多肽的区域，该区域包含一个列于SEQ ID NO:1,3,5的序列，它包括一个全长的基因或其变体。
SEQ ID NO:1,3,5中提供的BASB030多核苷酸是来自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090和H44/76的BASB030多核苷酸。
本发明的一个进一步的方面提供了编码和/或表达BASB030多肽和多核苷酸特别是脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB030多肽和多核苷酸的分离核酸分子，包括诸如未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因组DNAs、B-和Z-DNAs。本发明的进一步的实施方案包括在生物性、诊断性、预防性、临床或治疗性有用的多核苷酸和多肽以及含有它们的组合物。
本发明的另一个方面涉及至少包括一个全长基因的分离多核苷酸，该基因编码一种具有SEQ ID NO:2,4,6的推定氨基酸序列的BASB030，以及与其密切相关的多核苷酸及其变体。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中，提供了一种来自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB030多肽，它包括或由SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列或其变体组成。
使用这里提供的信息，例如SEQ ID NO:1,3,5列出的多核苷酸序列，本发明的编码BASB030多肽的多核苷酸可使用标准的克隆和筛选方法获得，例如使用那些用于从细菌中克隆和测序染色体DNA片段的方法以脑膜炎奈瑟氏球菌作为起始物质，接着获得一个全长克隆。例如，为获得本发明的一种多核苷酸序列，例如SEQ ID NO:1,3,5中给出的多核苷酸序列，通常使用一种来自部分序列的放射性标记的寡核苷酸，优选17-mer或更长，对大肠杆菌或其他合适宿主中的脑膜炎奈瑟氏球菌的染色体DNA克隆文库进行筛选。携带与探针相同DNA的克隆接着用严紧杂交条件进行区分。通过用根据原来的多肽或多核苷酸序列设计的测序引物对这样用杂交方法鉴定的单个克隆进行测序，就有可能在两个方向延伸多核苷酸序列，从而确定全长的基因序列。这种测序常规使用诸如由质粒克隆制备的变性的双链DNA来进行。合适的技术见Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York(1989)。(具体见杂交筛选1.90和变性双链DNA模板测序13.70)。也可应用直接的基因组DNA测序来获得全长的基因序列。为说明本发明，SEQ ID NO:1,3,5列出的每个多核苷酸都从来自脑膜炎奈瑟氏球菌的DNA文库中发现。
而且，SEQ ID NO:1,3,5中列出的每个DNA序列都含有一个编码如下蛋白的开放阅读框，该蛋白含有SEQ ID NO:2,4,6中列出的氨基酸残基数目，其推导的分子量可使用本领域技术人员熟知的氨基酸残基的分子量数值进行计算。
SEQ ID NO:1的多核苷酸位于SEQ ID NO:1的起始密码子的核苷酸号码1和从核苷酸号码2308开始的终止密码子之间，编码SEQ ID NO:2的多肽。
SEQ ID NO:3的多核苷酸位于SEQ ID NO:3的第一个密码子的核苷酸号码1和从核苷酸号码2308开始的终止密码子之间，编码SEQ IDNO:4的多肽。
SEQ ID NO:5的多核苷酸位于SEQ ID NO:5的起始密码子的核苷酸号码1和从核苷酸号码2308开始的终止密码子之间，编码SEQ ID NO:6的多肽。
在一个进一步的方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，该核苷酸包括或由以下组成(a)一种多核苷酸序列，它与SEQ ID NO:1,3,5分别在SEQ ID NO:1,3,5的整个长度上至少有85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或完全相同；或(b)一种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO:2,4,6的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:2,4,6的整个长度上具有至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或100％完全相同。
编码本发明的一种多肽的多核苷酸，包括来自除脑膜炎奈瑟氏球菌以外的种类的同源物或同源进化物，可通过一种包括以下步骤的方法来获得在严紧杂交条件下(例如使用45-65℃的温度范围，SDS的浓度为0.1-1％)用一种标记的或可检测的探针对合适的文库进行筛选，其中探针包含或由SEQ ID NO:1,3,5的序列或其一个片段组成，并分离含有所说多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆。
本发明提供一种在其整个长度上与SEQ ID NO:1,3,5的编码序列(开放阅读框)相同的多核苷酸序列。本发明还提供单独的成熟多肽或其片段的编码序列以及与另一个编码序列在一个阅读框内的成熟多肽或其片段的编码序列，另一个编码序列的例子为编码一种前导或分泌序列、前-、原-或前原-蛋白的序列。本发明的多核苷酸也可含有至少一种非编码序列，包括但不限于，诸如至少一种非编码的5’和3’序列，例如转录但不翻译的序列、终止信号(例如rho-依赖和非rho-依赖的终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、稳定mRNA的序列、内含子和聚腺苷酸化信号。多核苷酸序列也可包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码一种能促进融合多肽纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中，标记序列是一种6组氨酸肽，由pQE载体提供(Qiagen,Inc.)，见Gentz等《美国科学院院刊》86:821-824,(1989)中的介绍；或是一种HA肽尾巴(Wilson等，《细胞》37:767(1984)；两种标记序列都可用于纯化与它们融合的多肽。本发明的多核苷酸还包括但不限于，包含一种结构基因和其天然相连的控制基因表达的序列。
编码SEQ ID NO:2,4,6的BASB030多肽的核苷酸序列可分别与SEQ ID NO:1的核苷酸1至2307所含的多肽编码序列或SEQ ID NO:3的核苷酸1至2307或SEQ ID NO:5的核苷酸1至2307所含的多肽编码序列相同。另外，它可以是这样一种序列，即是遗传密码丰余(简并性)的结果，也编码SEQ ID NO:2,4,6的多肽。
用于此处，“编码一种多肽的多核苷酸”一词涉及包括一种编码本发明的多肽的序列的多核苷酸，本发明的多肽具体说是一种细菌多肽，更具体说是脑膜炎奈瑟氏球菌BASB030多肽，它具有SEQ ID NO:2,4,6所列的氨基酸序列。该词还涉及这样一种多核苷酸，它包括编码该肽的一个单一的连续区域或非连续区域(例如被整合的噬菌体、整合的插入序列、整合的载体序列、整合的转座子序列或因RNA编辑或基因组DNA重排所打断的多核苷酸)以及另外的区域，这种另外的区域也可含有编码和/或非编码序列。
本发明进一步涉及这里介绍的多核苷酸的变体，这种变体能编码具有SEQ ID NO:2,4,6的推定氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多核苷酸的片段可用于诸如合成本发明的全长多核苷酸。
更加特别优选的实施方案是编码BASB030变体的多核苷酸，该变体具有在SEQ ID NO:2,4,6中几个、少数、5至10、1至5、1至3、2、1或没有氨基酸被以任何组合方式取代、修饰、缺失和/或添加的BASB030多肽的氨基酸序列。在它们中尤其优选的是并不改变BASB030多肽的特性和活性的沉默取代、添加和缺失。
本发明的更优选的实施方案是与编码具有SEQ ID NO:2,4,6列出的氨基酸序列的BASB030多肽的多核苷酸在其整个长度上至少有85％相同的多核苷酸；以及与这种多核苷酸互补的多核苷酸。就此而言，特别优选的是在整个长度上至少有90％的同一性的多核苷酸，而在这些特别优选多核苷酸中，至少有95％的同一性的多核苷酸更为优选，而且在这些至少有95％的同一性的多核苷酸中，至少有97％相同的多核苷酸更优选，同样在它们中，至少有98％和至少有99％相同的多核苷酸尤其更加优选，其中至少有99％相同的多核苷酸更优选。
优选的实施方案是编码基本上保留了SEQ ID NO:1,3,5的DNA编码的成熟多肽的相同生物功能或活性的多肽的多核苷酸。
根据本发明的特定优选实施方案，本发明提供能与BASB030多核苷酸序列例如SEQ ID NO:1,3,5的多核苷酸序列杂交，尤其是在严紧条件下杂交的多核苷酸。
本发明进一步涉及能与这里提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列。就此而言，本发明特别涉及能在严紧条件下与这里介绍的多核苷酸杂交的多核苷酸。用于此处，“严紧条件”和“严紧杂交条件”的意思是杂交只发生在序列之间至少有95％优选至少有97％相同时。严紧杂交条件的一个具体例子是在42℃在一种溶液中温育过夜，该溶液包括50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardt’s溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml的变性剪切鲑精蛋白，接着在0.1x SSC中在约65℃时洗涤杂交支持物。杂交和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(1989)中特别是11章中举例。溶液杂交也可用本发明提供的多核苷酸序列进行。
本发明还提供含有或由这样一种多核苷酸序列组成的多核苷酸，该多核苷酸序列通过用一种探针在严紧杂交条件下筛选一种合适的文库并分离所述多核苷酸序列来获得，其中文库含有SEQ ID NO:1,3,5列出的多核苷酸序列的完整基因，而探针具有SEQ ID NO:1,3,5列出的所说多核苷酸序列的序列。可用于获得这样一种多核苷酸的片段包括诸如本文的其他部分详细介绍的探针和引物。
如本发明在这里的其他部分对多核苷酸试验的讨论，例如，本发明的多核苷酸可用作RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针来分离编码BASB030的全长cDNAs和基因组克隆，并分离与BASB030基因具有高同一性特别是高序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这种探针一般具有至少15个核苷酸残基或碱基对，这种探针优选具有至少30个核苷酸残基或碱基对，也可具有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针具有至少20个核苷酸残基或碱基对，并少于至少30个核苷酸残基或碱基对。
BASB030基因的编码区可通过使用SEQ ID NO:1,3,5提供的DNA序列合成一种寡核苷酸探针进行筛选来分离。然后使用与本发明的基因序列互补的标记寡核苷酸筛选一种cDNA、基因组DNA或mRNA文库，来确定该探针杂交的文库成员。
对本领域的技术人员来说，有几种方法是可以使用和熟知的，可以用来获得全长DNAs或延伸短的DNAs，例如以cDNA末端快速扩增(RACE)方法为基础的方法(见诸如Frohman等，《美国科学院院刊》85:8998-9002,1988)。这种技术的最近修改，例如MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)，明显简化了对较长cDNAs的寻找。在MarathonTM技术中，cDNAs用从一种选择的组织中抽提的mRNA制备，并在每个末端连上一种“接头”。然后使用基因特异的和接头特异的寡核苷酸组合进行核酸扩增(PCR)来扩增“丢失”的DNA的5’末端。然后使用“巢式”引物重复PCR反应，巢式引物即设计来与扩增产物的内部退火的引物(通常为与接头序列的3’退火的一种接头特异性引物和与所选择的基因序列的5’退火的一种基因特异性引物)。然后用DNA测序对该反应的产物进行分析，通过将产物直接与已有的DNA连接产生一个完整的序列，或者使用设计5’引物的新序列信息进行一个单独的全长PCR，来构建一个全长的DNA。
本发明的多核苷酸和多肽可用作诸如发现疾病特别是人疾病的治疗和诊断的研究试剂和物质，如同这里与多核苷酸试验有关的讨论。
本发明的多核苷酸是衍生自SEQ ID NO:1-4序列的寡核苷酸，它们可用于这里介绍的方法，但更优选用于PCR，用来确定这里鉴定的多核苷酸是否全部或部分能在细菌或感染组织中转录。应当理解，这种序列也可用于诊断感染的阶段和所获得病原体的感染类型。
本发明也提供编码这样一种多肽的多核苷酸，这种多肽是一种成熟蛋白加上另外的氨基或羧基末端氨基酸、或成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式含有一个以上的多肽链时)。这种序列可在将一种蛋白从前体加工成成熟形式时起作用，可允许蛋白运输，可延长或缩短蛋白的半寿期，或可便于蛋白用于试验或制备时的操作。通常在体内时，另外的氨基酸可通过细胞酶从成熟蛋白上加工除去。
对于本发明的每一种和所有的多核苷酸，都提供一种与之互补的多核苷酸。这些互补多核苷酸优选与它们互补的每一种多核苷酸完全互补。
一种含有多肽的成熟形式与一种或多种原序列融合的前体蛋白可能是该多肽的无活性形式。当除去原序列时，这种无活性的前体一般被激活。在活化前，一些或所有的原序列可被除去。这种前体一般被称为蛋白原。
核苷酸除了用标准的A、G、C、T/U表示外，“N”也可用来描述本发明的特定多核苷酸。“N”指4种DNA或RNA核苷酸的任何一个都可出现在DNA或RNA序列的该指定位点，但优选N不是一种核酸，当它与相邻的核苷酸位置组合在一起，当按正确的阅读框阅读时，在该阅读框中产生一种成熟前的终止密码子。
总而言之，本发明的多核苷酸可编码一种成熟蛋白、一种成熟蛋白加一种前导序列(它可被称为一种前蛋白)、含有一种或多种非前蛋白的前导序列的原序列的成熟蛋白的前体、或原蛋白的前体前原蛋白，其具有一种前导序列和一种或多种原序列，它们通常在产生多肽的活性和成熟形式的加工过程中被除去。
根据本发明的一个方面，提供本发明的多核苷酸在治疗性或预防性目的特别是遗传免疫方面的应用。
本发明的多核苷酸在遗传免疫方面的应用优选使用一种合适的传递方法，例如直接将质粒DNA注射进肌肉(Wolff等《人类分子遗传学》(1992)1:363,Manthorpe等，《人类基因治疗》(1983)4:419)；将DNA与特异性蛋白载体复合后进行传递(Wu等，《生物化学杂志》(1989)264:16985)，将DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty&Reshef，《美国科学院院刊》(1986)83:9551)；将DNA用各种形式的脂质体包裹(Kaneda等，《科学》(1989)243:375)；粒子轰击(Tang等，《自然》(1992)356:152,Eisenbraun等《DNA与细胞生物学》(1993)12:791)以及使用克隆的逆转录载体进行体内感染(Seeger等，《美国科学院院刊》81:5949)。载体、宿主细胞、表达系统本发明还涉及含有本发明的多核苷酸的载体、用本发明的载体进行了遗传工程改造的宿主细胞以及通过重组技术制备本发明的多肽。无细胞翻译系统也可用于使用来自本发明的DNA结构物的RNAs制备这样的蛋白。
本发明的重组多肽可使用本领域技术人员熟知的方法由含有表达系统的遗传工程宿主细胞进行制备。因此，在一个进一步的方面，本发明涉及含有本发明的多核苷酸的表达系统、用这种表达系统遗传工程改造的宿主细胞以及用重组技术制备本发明的多肽。
为进行本发明的多肽的重组制备，宿主细胞可通过遗传工程改造来整合表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。将多核苷酸导入宿主细胞可通过多种标准实验室手册介绍的方法来完成，例如Davis等《分子生物学基本方法》(1986)和Sambrook等《分子克隆实验室指南，第二版》Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、载体转染、显微注射、阳离子脂介导的转染、电穿孔、转导、划痕接种、轰击导入和感染。
合适宿主的代表性例子包括细菌细胞如链球菌、葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、链霉菌、蓝细菌、枯草芽孢杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、嗜血流感菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的细胞；真菌细胞如克鲁维氏酵母、糖酵母等酵母、白色假丝酵母和曲霉等担子菌的细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9的细胞；动物细胞如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞如裸子植物或被子植物的细胞。
多种表达系统可用于制备本发明的多肽。这种载体包括染色体型、游离型、病毒型衍生载体，例如由细菌质粒、细菌噬菌体、转座子、酵母游离体、插入元件、酵母染色体元件、病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒、微小RNA病毒、逆转录病毒和甲型病毒衍生的载体或由它们的组合物衍生的载体，例如由质粒和噬菌体遗传元件衍生的载体，如粘粒和噬菌粒。表达系统结构物可含有调节以及引起表达的控制区域。就这个方面一般来说，任何适合于维持、增殖或表达多核苷酸和/或在一种宿主中表达一种多肽的系统或载体都可用于表达。合适的DNA序列可通过任何熟知的和常规的技术插入到表达系统中，例如Sambrook等《分子克隆实验室指南》(上文)中列出的技术。
在真核细胞重组表达系统中，为使翻译蛋白分泌到内质网层中、周质间或胞外环境中，可将合适的分泌信号整合到表达的多肽中。这些信号对多肽来说可以是内源性的，或者也可以是异源性的。
本发明的多肽可通过熟知的技术从重组细胞培养物中回收和纯化，这些技术包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。更优选将金属离子亲和层析(IMAC)用于纯化。熟知的用于蛋白重新折叠的技术可用于当多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性时活性构象的再生。
表达系统也可是一种重组的活微生物，例如一种病毒或细菌。目标基因可插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。接种和体内感染这种活的载体将导致抗原的体内表达和免疫应答诱导。用于此目的的病毒和细菌是诸如痘病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、金丝雀禽痘病毒)、甲病毒(辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、微小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、李斯特氏菌、沙门氏菌、奈瑟氏菌、BCG。这些病毒和细菌可以是毒性的、或用各种方法减毒来获得一种活疫苗。这种活疫苗也是本发明的一个部分。诊断、预测、血清分型和突变试验本发明还涉及将本发明的BASB030多核苷酸和多肽用作诊断试剂。在真核细胞特别是哺乳动物细胞尤其是人细胞中检测BASB030多核苷酸和/或多肽可为诊断疾病、疾病阶段或感染生物体对药物的应答提供一种诊断方法。真核细胞，特别是哺乳动物细胞，尤其是人细胞，特别是那些感染或怀疑感染了含有BASB030基因或蛋白的生物体的细胞，可在核酸或氨基酸水平通过多种熟知的技术以及这里提供的方法进行检测。
用于预测、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸可获自假定感染和/或感染个体的机体物质。来自任何这些来源的多核苷酸尤其是DNA或RNA可直接用于检测，或者可在分析前使用PCR或其他任何扩增技术进行酶促扩增。RNA特别是mRNA、cDNA和基因组DNA也可以相同方式使用。使用扩增方法，通过对生物体的所选多核苷酸的基因型进行分析，可对感染性或个体中存在的定居生物体的种类和菌株进行鉴定。缺失和插入可通过扩增产物与一种选自相关生物体的参考序列的基因型相比的大小变化进行检测，优选与相同属的不同种或相同种的不同株进行比较。点突变可通过将扩增DNA与标记的BASB030多核苷酸序列进行杂交来鉴定。对于DNA或RNA来说，通过DNase或RNase消化分别可将非常或明显匹配的序列与匹配不佳或明显错配的双体区分开来，或者通过检测融解温度或复性动力学的差异进行区分。多核苷酸序列差异也可通过多核苷酸片段在凝胶中与一种参考序列相比的电泳迁移的改变来检测。这可使用或不使用变性试剂。多核苷酸差异也可通过直接的DNA或RNA测序来检测。见诸如Myers等，《科学》230:1242(1985)。特殊位置的序列改变也可通过核酸酶保护试验如RNase、V1和S1保护试验或化学裂解方法来显示。见诸如Cotton等《美国科学院院刊》85:4397-4401(1985)。
在另一个实施方案中，可以构建一系列含有BASB030核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针，来对诸如遗传突变、血清型、分类或鉴定进行有效的筛选。平行技术方法是众所周知的，具有通用性，可用来解决分子遗传学中的多种问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异(见诸如Chee等《科学》274:610(1996)。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，它包括(a)本发明的一种多核苷酸，优选SEQ ID NO:1,3,5的核苷酸序列或其片段；(b)与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；(c)本发明的一种多肽，优选SEQ ID NO:2,4,6的多肽或其片段；或(d)针对本发明的多肽的抗体，优选针对SEQ ID NO:2,4,6的多肽的抗体。
在任何这样一种试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可优选含有一种基本组分。这种试剂盒可用于疾病或对疾病的易感性的诊断或其他。
本发明还涉及将本发明的多核苷酸用作诊断试剂。对本发明的多核苷酸优选SEQ ID NO:1,3,5的与一种疾病或致病性相关的突变形式的检测，可提供一种诊断手段，这种诊断手段可增加或限定由于该多核苷酸的低表达、过量表达或表达改变而引起的一种疾病的诊断、疾病过程的预测、疾病阶段、或疾病的易感性的确定。在这样的多核苷酸中带有突变的生物体特别是感染性生物体可通过各种技术例如这里任何地方介绍的技术在多核苷酸水平进行检测。
来自在本发明的多核苷酸和/或多肽中带有突变或多态性(等位突变)的生物体的细胞也可用来使用多种技术在多核苷酸或多肽水平进行检测，从而进行诸如血清学分型。例如，RT-PCR可用来检测RNA中的突变。优选将RT-PCR与自动检测系统如GeneScan结合起来进行使用。RNA、cDNA或基因组DNA也可用于相同的目的-PCR。例如，与编码BASB030多肽的多核苷酸互补的PCR引物可用来鉴定和分析突变。
本发明进一步提供从5’和/或3’末端除去1、2、3或4个核苷酸的引物。这些引物可与其他材料一起用于扩增从个体获得的一种样品如机体物质中分离的BASB030 DNA和/或RNA。这些引物可用于扩增从感染个体中分离的一种多核苷酸，这样，该多核苷酸可随后通过各种技术来阐明多核苷酸序列。通过这种方法，可检测多核苷酸序列中的突变，并用于诊断和/或预测感染或其阶段或过程，或进行感染因子的血清学分型和/或分类。
本发明进一步提供诊断疾病，优选是细菌感染，更优选是由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的方法，这包括在从个体获得的样品如一种机体物质中检测具有SEQ ID NO:1,3,5序列的多核苷酸的表达水平的提高。BASB030多核苷酸表达的增加或减少可使用本领域任何已知的用于多核苷酸定量的方法进行检测，例如扩增、PCR、RT-PCR、RNase保护、Northern印迹、分光光度和其他杂交方法。
此外，根据本发明的用于检测BASB030多肽与正常对照组织样品相比过量表达的诊断试验可用来检测例如一种感染的存在。可用来测定BASB030多肽在来自一种宿主如一种机体物质中的水平的试验技术对本领域的技术人员来说是熟知的。这种试验方法包括放射免疫试验、竞争结合试验、Western印迹、抗体夹心试验、抗体检测和ELISA试验。
本发明的多核苷酸可用作多核苷酸列阵优选是高密度列阵或载网的组分。这些高密度列阵对于诊断和预测目的特别有用。例如，各含一种不同基因并进一步含有本发明的多核苷酸的一套点可用于探针检测，例如使用杂交或核酸扩增，使用来自或衍生自一种机体样品的探针，来检测一种特别的寡核苷酸序列或相关序列在一个个体中的存在。这种存在可说明一种病原体尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌的存在，并可用来诊断和/或预测疾病或疾病过程。优选的是一种含有多种SEQ ID NO:1,3,5的核苷酸序列的变体的载网。含有编码SEQ ID NO:2,4,6的多肽序列的多核苷酸序列的多种变体的载网也是优选的。抗体本发明的多肽和多核苷酸或其变体或者表达它们的细胞可用作免疫原来制备分别针对这种多肽或多核苷酸的抗体。
在本发明的特定优选实施方案中，提供针对BASB030多肽或多核苷酸的抗体。
针对本发明的多肽或多核苷酸制备的抗体可通过使用传统的方法获得，即将本发明的多肽和/或多核苷酸、或它们之一或两者的携带表位的片段、它们之一或两者的类似物、或表达它们之一或两者的细胞给药于一种动物，优选是一种非人类的动物。本领域任何能提供用连续细胞系培养制备的抗体的技术都可以使用。例子包括各种技术，例如Kohler,G.和Milstein,C.《自然》256:495-497(1975)；Kozbor等《今日免疫学》4:72(1983)；Cole等《单克隆抗体和癌症治疗》，Alan R.Liss,Inc.(1985)的77-96页。
制备单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)可修改来制备针对本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。转基因鼠或其他生物体或动物如其他哺乳动物也可用来表达对本发明的多肽或多核苷酸免疫特异的人源化抗体。
另外，噬菌体显示技术可用来从含有抗BASB030的人淋巴细胞的PCR扩增的V-基因文库或天然文库中选择对本发明的多肽具有结合活性的抗体基因(McCafferty等(1990)《自然》348:552-554；Marks等(1992)《生物技术》10:779-783)。这些抗体的亲和性也可通过诸如链置换技术进行提高(Clackson等，(1991)《自然》352:628)。
上面介绍的抗体可用来分离或鉴定能够表达本发明的多肽或多核苷酸的克隆，来通过诸如亲和层析纯化这些多肽或多核苷酸。
这些抗体以及其他针对BASB030多肽或BASB030多核苷酸的抗体可用来治疗感染，特别是细菌感染。
多肽变体包括抗原性、表位性或免疫性等价的变体，它们组成了本发明的一个特别的方面。
抗体或其片段优选通过修饰，使之在个体中具有较小的免疫原性。例如，如果个体是人，抗体可更优选是一种“人源化”的抗体，其中杂交瘤来源抗体的互补决定区被移植到人单克隆抗体中，例如Jones等(1986)《自然》321,522-525或Tempest等(1991)《生物技术》9,266-273中的介绍。拮抗剂和激动剂-试验和分子本发明的多肽和多核苷酸还可用来评价小分子底物与配体在诸如细胞、无细胞抽提物、化学文库和天然产物混合物中的结合。这些底物和配体可以是天然底物和配体，或者可以是结构或功能模拟物，见诸如Coligan等《当代免疫学方法》1(2):5章(1991)。
筛选方法可通过一种直接或间接与候选化合物连接的标记简单地测量候选化合物与多肽或多核苷酸、或者携带多肽或多核苷酸的细胞或膜、或者多肽的融合蛋白的结合。此外，筛选方法可包括与一种标记的竞争物进行竞争。而且，这些筛选方法可检测候选化合物是否导致一种由多肽或多核苷酸的活化产生的信号，这可使用与含有多肽或多核苷酸的细胞适宜的检测系统来进行。活化的抑制剂一般在存在一种已知激动剂的情况下进行试验，并观察候选化合物对激动剂活化作用的影响。组成型活性多肽和/或组成型表达的多肽和多核苷酸可根据需要，在没有一种激动剂或拮抗剂的情况下，用于逆转激动剂或抑制剂的筛选方法，这可通过检测候选化合物是否导致多肽或多核苷酸的活化的抑制来进行。而且，筛选方法可简单地包括以下步骤，将一种候选化合物与含有本发明的一种多肽或多核苷酸的溶液混合，形成一种混合物；检测混合物中BASB030多肽和/或多核苷酸的活性；将混合物中BASB030多肽和/或多核苷酸的活性与一种标准进行比较。融合蛋白如这里介绍的Fc部分与BASB030多肽制备的融合蛋白也可用于高通量的筛选试验，用来鉴定本发明的多肽的拮抗剂以及系统发育和/或功能上相关的多肽(见D.Bennett等《分子识别杂志》8:52-58(1995)和K.Johanson等《生物化学杂志》270(16):9459-9471(1995))。
能够与本发明的一种多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗体也可用于设计检测加入的化合物对细胞中mRNA和/或多肽产生的影响的筛选方法。例如，可以设计一种ELISA试验，使用单克隆和多克隆抗体，按照本领域的标准方法，测量多肽的分泌或细胞结合水平。这可用来发现能抑制或增强多肽在合适的操作细胞或组织中产生的试剂(分别也被称为拮抗剂或激动剂)。
本发明还提供一种筛选化合物的方法，用来鉴定能够增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB030多肽或多核苷酸的作用的化合物，尤其是能够抑菌和/或杀菌的化合物。这种筛选方法可使用高通量技术。例如，为筛选激动剂或拮抗剂，将一种合成反应混合物、一种细胞组分如膜、细胞包膜或细胞壁、或者它们的任何制备物、包括BASB030多肽和一种标记底物或这种多肽的配体，在一种可能是BASB030激动剂或拮抗剂的候选分子存在或不存在的条件下，进行温育。候选化合物激动或拮抗BASB030多肽的能力反映于标记配体的结合降低或这种底物的产物的产生减少。无效结合即不诱导BASB030多肽的效果的分子很可能是优秀的拮抗剂。根据情况，结合良好并增加产物由底物产生的速率、增加信号转导或增加化学通道活性的的分子即是激动剂。根据情况，产物由底物产生、信号传导或化学通道活性的速率或水平的检测可通过使用一种报告系统来增强。可用于此目的报告系统包括但不限于比色、标记底物转变成产物、一种对BASB030多核苷酸或多肽的变化应答的报告基因以及本领域熟知的结合试验。
BASB030激动剂试验的另一个例子是一种竞争试验，该试验将BASB030和一种可能的激动剂与BASB030结合分子、重组BASB030结合分子、天然底物或配体、或底物或配体的模拟物组合在一起，在合适的条件下进行竞争抑制试验。BASB030可进行标记，例如用放射活性或比色化合物标记，使结合到一种结合分子上或转化成产物的BASB030分子的数目可以精确测定，来评价可能的拮抗剂的作用。
可能的拮抗剂包括能与本发明的多核苷酸和/或多肽结合并因而抑制或压制其活性或表达的小有机分子、肽、多肽以及抗体及其他。可能的拮抗剂也可以是这样的小有机分子、肽、多肽如密切相关的蛋白或抗体，它们结合在结合分子的相同位点，例如一种结合分子，但不诱导BASB030诱导的活性，从而通过阻止BASB030多肽和/或多核苷酸结合来抑制BASB030多肽和/或多核苷酸的活化或表达。
可能的拮抗剂包括这样的小分子，它们结合和占据多肽的结合位点，因而阻止其与细胞结合分子结合，从而抑制正常的生物活性。小分子的例子包括但不限于小有机分子、肽或肽样分子。其他可能的拮抗剂包括反义分子(见Okano，《神经化学杂志》56:560(1991)；《寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂》CRC Press,Boca Raton,FL(1988)，对这些分子的介绍)。优选的可能的拮抗剂包括与BASB030及其变体有关的化合物。
在一个进一步的方面，本发明涉及遗传工程的可溶性融合蛋白，这种蛋白包括本发明的一种多肽或其片段以及各种亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的各种部分。优选的免疫球蛋白是人IgG特别是IgG1重链的恒定区部分，其中融合发生于铰链区。在一个特别的实施方案中，Fc部分可通过以下方法简单地除去引入一个切割序列，该序列可用血液凝集因子Xa。而且，本发明涉及通过遗传工程制备这些融合蛋白的方法，并涉及将其用于药物筛选、诊断和治疗。本发明的一个进一步的方面还涉及编码这种融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可见于国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914。
这里提供的每个多核苷酸序列可用于发现和开发抗菌化合物。编码蛋白通过表达可用作筛选抗菌药物的靶。此外，编码所编码蛋白的氨基末端区域或相应mRNA的SD或其他翻译促进区域的多核苷酸序列可用于构建反义序列来控制目标编码序列的表达。
本发明还提供将本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂用于干扰一种病原体或多种病原体与一种对感染继发症敏感的真核生物优选是哺乳动物宿主之间的最初生理相互作用。具体地说，本发明的分子可用于抑制细菌具体说是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌粘附于真核生物优选是哺乳动物的深埋装置的细胞外基质蛋白或粘附于伤口的细胞外基质蛋白；阻断真核生物优选是哺乳动物的细胞外基质蛋白与细菌BASB030蛋白之间的细菌性粘附，后者介导组织损伤；和/或阻断不管是深埋装置植入还是其他外科技术引起的感染的正常致病过程。
根据本发明的另一个方面，提供BASB030激动剂和拮抗剂，优选是抑菌或杀菌性激动剂和拮抗剂。
本发明的拮抗剂和激动剂可用于例如阻止、抑制和/或治疗疾病。
在一个进一步的方面，本发明涉及本发明的多肽的模拟型。模拟型是一种肽序列，与天然肽足够相似(序列上或结构上)，它能被识别天然肽的抗体识别，或在与一种合适载体偶联时能够产生识别天然肽的抗体。
肽模拟型可通过添加、缺失或取代所选择的氨基酸用于特别的目的。因此，肽可被修饰以易于与一种蛋白载体连接。例如，对于某些化学结合方法，需要含有一个末端半胱氨酸。此外，对于肽与一种蛋白载体结合，需要包含一个远离肽结合末端的疏水末端，使肽的未结合的游离末端保持与载体蛋白表面的相互作用。从而使肽具有一种构象，这种构象与肽在整个天然分子结构中具有的构象非常相似。例如，肽可被修改来具有一个N末端半胱氨酸和一个C末端疏水的酰胺化的尾巴。另外，可以进行一种或多种氨基酸的D立体异构体的添加或取代，来制备一种有用的衍生物，用来例如增强肽的稳定性。
此外，肽模拟型可通过诸如噬菌体显示技术(EP 0 552 267 B1)使用能与本发明的多肽结合的抗体来鉴定。这种技术产生大量的模拟天然肽的结构的肽序列，这些肽序列因此能够结合抗天然肽的抗体，但可能不足以与天然多肽具有明显的序列同源性。疫苗本发明的另一个方面涉及在个体特别是哺乳动物优选是人中诱导免疫应答的方法，这种方法包括用BASB030多核苷酸和/或多肽或其片段或变体接种个体，它们足以产生抗体和/或T细胞免疫应答，保护个体不被感染，特别是细菌感染，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌感染。本发明还提供产生这种免疫应答以延缓细菌复制的方法。本发明的另一个方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，包括给予这种个体一种指导BASB030多核苷酸和/或多肽表达或其片段或变体表达的核酸载体、序列或核酶，来在体内表达BASB030多核苷酸和/或多肽表达或其片段或变体，从而诱导一种免疫应答，例如产生抗体和/或T细胞免疫应答，包括诸如产细胞因子T细胞或细胞毒T细胞，来保护所述个体，优选是人免于患病，而不管这种疾病是已经在个体中存在还是不存在。基因给药的一个例子是将其作为颗粒或其他物质的包被物来促进其进入所需的细胞。这种核酸载体可包括DNA、RNA、核酶、修饰的核酸、DNA/RNA杂合体、DNA蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。
本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫组合物，该组合物在导入个体优选是人时，能够诱导一种免疫应答，即在该个体中诱导针对BASB030多核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答。其中组合物包含重组的BASB030多核苷酸和/或由其编码的多肽；和/或包含能够编码和表达所述BASB030多核苷酸、由其编码的多肽或本发明的其他多肽的抗原的DNA和/或RNA。免疫应答可用于治疗或预防目的，并且可采用抗体免疫和/或细胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。
因此，BASB030多肽或其片段可与辅助蛋白或化学半分子融合，辅助蛋白或化学半分子能够或不能自身产生抗体，但能够使第一种蛋白稳定，并产生一种融合的或修饰的蛋白，后者具有抗原性和/或免疫原性，优选是保护性。这样的融合重组蛋白优选进一步含有一种抗原性辅助蛋白，例如来自嗜血流感菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶或其他任何能够稳定蛋白并促进其制备和纯化的大辅助蛋白。而且，辅助蛋白在对接受该蛋白的生物体的免疫系统提供一种标准刺激时，可用作一种佐剂。辅助蛋白可连接在第一种蛋白的氨基端或羧基端。
本发明提供含有本发明的多肽和/或多核苷酸以及免疫调节DNA序列如Sato,Y.《科学》273:352(1996)中介绍的DNA序列的组合物，特别是疫苗组合物，以及方法。
本发明还提供在脑膜炎奈瑟氏球菌感染的动物模型的这种遗传免疫实验中所用的多核苷酸结构物中使用所介绍的多核苷酸或其特殊片段的方法，其中多核苷酸或其特殊片段已经显示编码细菌细胞表面蛋白的非可变区。这种实验可特别用于鉴定能够激发预防性或治疗性免疫应答的蛋白表位。可以相信，这种方法将能够用于随后由成功地抵抗或清除了感染的动物的必需的器官，制备有特殊价值的单克隆抗体，用于发展哺乳动物特别是人的治疗细菌性感染特别是奈瑟氏球菌感染的预防性试剂或治疗性试剂。
本发明还包括疫苗制剂，这种制剂包括本发明的一种免疫原性重组多肽和/或多核苷酸以及一种合适的载体，例如一种可药用载体。因为多肽和多核苷酸可能在胃中会被打断，它们都优选经肠道外给药，包括诸如皮下、肌肉、静脉或皮内，适用于肠道外给药的制剂包括水和非水的无菌注射溶液，它们可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和能够使制剂与个体的体液优选是血液等渗的溶剂，以及可包含悬浮剂或增稠剂的水和非水无菌悬液。制剂可置于单剂量或多剂量的容器内，例如密封的安瓶和小瓶，并可贮存于冷冻干燥的环境，只需在使用前加入无菌的液体载体。
本发明的疫苗制剂也可包括佐剂系统，用来增强制剂的免疫原性。优选佐剂系统优先引发TH1型应答。
免疫应答可广泛地分为两个典型的种类，即体液或细胞介导的免疫应答(一般分别用其保护作用的抗体和细胞效应机制来区分)。这些应答种类被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
典型的TH1型免疫应答的特征是产生抗原特异的单元型限制的细胞毒T淋巴细胞和自然杀伤型细胞应答。在小鼠中，TH1型应答的特征通常是产生IgG2a亚型的抗体，而在人中，它们的对应物是IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征是产生广谱的免疫球蛋白同种型，在小鼠中包括IgG1、IgA和IgM。
可以想象得到，这两种类型的免疫应答之后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子优先诱导针对所给抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子优先诱导针对抗原的体液免疫应答。
TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上，一个个体可以支持一种被描述为TH1优势或TH2优势的免疫应答。但是，通常方便地按照Mosmann和Coffman在鼠CD4+ve T细胞克隆中的介绍来考虑细胞因子的家族(Mosmann,T.R.和Coffman,R.L.(1989),TH1和TH2细胞淋巴因子的不同分泌模式导致不同的功能特性。《免疫学年鉴》7卷，145-173页)。通常，TH1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其他通常直接与TH1型免疫应答诱导有关的细胞因子如IL-12不由T细胞产生。相反，TH2型应答与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有关。
已知特定的疫苗佐剂特别适合于刺激TH1或TH2型细胞因子应答。疫苗接种或感染后免疫应答的TH1∶TH2平衡的最佳指标通常包括在体外用抗原再刺激后直接测量T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子，和/或测量抗原特异的抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。
因此，TH1型佐剂是在体外用抗原再刺激时优先刺激分离的T细胞群体产生高水平的TH1型细胞因子和促进CD8+细胞毒T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异的免疫球蛋白应答产生的佐剂。
能够优先刺激TH1细胞应答的佐剂在国际专利申请No.WO94/00153和WO95/17209中介绍。
3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)是一种这样的佐剂。这可由GB2220211(Ribi)知道。它在化学上是3 De-O酰化单磷酰类脂A与4、5或6酰基链的混合物，并由Ribi Immunochem,Montana制造。3 De-O-酰化单磷酰类脂A的一种优选形式在欧洲专利0 689 454(SmithKlineBeecham Biologicals SA)中公开。
3D-MPL颗粒优选小到足以通过一个0.22μm微孔滤膜进行过滤除菌(欧洲专利0 689 454)。
3D-MPL以每剂10μg-100μg，优选是20-25μg的范围存在，而抗原通常以每剂2-50μg的范围存在。
另一个优选的佐剂包含QS21，它是一种来自Quillaja SaponariaMolina的茎的Hplc纯化的无毒组分。它可选用来与3 De-O-酰化单磷酰类脂A(3D-MPL)混合，并可与一种载体一起使用。
制备QS21的方法在美国专利No.5,057,540中公开。
含有QS21的非反应性的佐剂制剂在以前已有介绍(WO96/33739)。含有QS21和胆甾醇的这种制剂在与抗原一起配制时已显示是成功的TH1刺激佐剂。
优先刺激TH1型细胞应答的进一步的佐剂包括免疫调节性的寡核苷酸，例如非甲基化的CpG序列，如WO96/02555中的公开。
不同TH1刺激性佐剂如上文所介绍的佐剂的组合也被认为是能提供一种优先刺激TH1型细胞应答的佐剂。例如，QS21可与3D-MPL组合配制。0S21∶3D-MPL的比率通常为1∶10至10∶1，优选为1∶5至5∶1，并且通常为大约1∶1。优选的最佳组合范围是2.5∶1至1∶1的3D-MPL∶QS21。
根据本发明，疫苗组合物还优选含有一种载体。载体可以是一种水包油乳剂，或一种铝盐如磷酸铝或氢氧化铝。
水包油乳剂优选包含一种可代谢的油，例如角鲨烯、α-生育酚和Tween 80。在一个特别优选的方面，根据本发明，疫苗组合物中的抗原与QS21和3D-MPL在这样一种乳剂中组合。另外，该水包油乳剂可以含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛精。
在对人给药时，疫苗中QS21和3D-MPL的范围是每剂量1μg-200μg，例如10-100μg，优选是10μg-50μg。水包油通常含有2至10％的角鲨烯、2至10％的α-生育酚和0.3至3％的Tween 80。在以更稳定的乳剂形式提供时，角鲨烯α-生育酚Tween 80的比例优选相同或少于1。还可包含1％水平的Span85。在某些情况下，本发明的疫苗优选进一步含有一种稳定剂。
非毒性的水包油乳剂优选在一种水载体中含有一种非毒性的油如角鲨烷或角鲨烯、一种乳化剂如Tween 80。水载体可以是例如磷酸缓冲盐水。
WO95/17210中介绍了一种特别强有力的佐剂制剂，它含有在一种水包油乳剂中的QS21、3D-MPL和生育酚。
本发明还提供一种多价的疫苗组合物，它含有本发明的疫苗制剂以及其他抗原，特别是对治疗癌症、自身免疫疾病和相关病症有用的抗原。这样一种多价疫苗组合物可包括一种如前所述的TH1诱导型佐剂。
虽然本发明对特定的BASB030多肽和多核苷酸进行了介绍，但应当理解它们覆盖了天然产生的多肽和多核苷酸以及含有添加、缺失或取代的相似多肽和多核苷酸，这些添加、缺失或取代基本上不影响重组多肽或多核苷酸的免疫原特征。
抗原也可以完整细菌(死的或活的)或亚细胞组分的形式进行传递，这些可能性包括脑膜炎奈瑟氏球菌自身。组合物、试剂盒和给药在本发明的一个进一步的方面，提供含有用于对一个细胞或一个多细胞生物体给药的BASB030多核苷酸和/或BASB030多肽的组合物。
本发明还涉及含有这里讨论的多核苷酸和/或多肽或它们的激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸可与一种非无菌或无菌载体或用于细胞、组织或生物体的载体，例如一种适用于对个体给药的药用载体组合使用。这种组合物包括例如一种介质添加剂或一种治疗有效剂量的本发明的多肽和/或多核苷酸以及一种可药用载体或赋形剂。这种载体可包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。制剂应适合于给药模式。本发明进一步涉及诊断和药用包装和试剂盒，它们含有一种或多种容器，容器中装有一种或多种本发明的上面提到的成分。
本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例如治疗性化合物一起使用。
药用组合物可通过任何有效、传统的方式进行给药，包括诸如通过局部、口、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌肉、皮下、鼻内或皮内途径及其他途径进行给药。
在用于治疗或预防时，活性试剂可以一种可注射的组合物的形式给药于个体，例如以无菌水分散物优选是等渗的形式给药。
在一个进一步的方面，本发明提供药用组合物，它包含一种治疗有效剂量的多肽和/或多核苷酸例如本发明的多肽和/或多核苷酸的可溶形式、激动剂或拮抗剂或小分子化合物、以及一种可药用载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇以及它们的组合物。本发明进一步涉及药用包装和试剂盒，它们含有一种或多种容器，容器中装有一种或多种本发明的上面提到的成分。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可单独或与其他化合物例如治疗性化合物一起使用。
组合物应采用一种给药途径，例如通过一种全身性或经口途径。全身性给药的优选形式包括注射，通常通过静脉注射。其他的注射途径例如皮下、肌肉或腹膜都可以采用。全身性给药的其他方法包括使用渗透剂如胆盐或梭链孢酸或其他去污剂经粘膜和皮肤给药。此外，如果本发明的一种多肽或其他化合物可配制成一种肠溶或一种胶囊制剂，经口途径也可以使用。这些化合物的给药也可经表皮和/或局部，以药膏、帖膏、凝胶、溶液、粉末等形式使用。
为对哺乳动物特别是人进行给药，活性试剂的每日剂量水平应从0.01mg/kg至10mg/kg，通常为1mg/kg左右。在任何情况下，医生应确定最适合于个体的实际剂量，并根据年龄、体重和特殊个体的应答而不同。当然，在个体情况时，可以使用更高或更低的剂量范围，这些也都在本发明的范围内。
所需的剂量范围依赖于所选择的肽、给药途径、制剂的性质、用药者病症的性质以及医师的判断。但合适的剂量为每kg0.1-100μg的范围。
疫苗组合物一般采用注射形式。传统的佐剂可用来增强免疫应答。疫苗接种的合适单位剂量为0.5-5μg/kg的抗原，这样的剂量优选给药1-3次、间隔1-3周。对于指定的剂量范围，本发明的化合物在给药于合适的个体时，不会观察到毒副作用。
但考虑到可以使用不同的化合物以及不同给药途径可产生不同的效果，所需的剂量有广泛的变化。例如，口服途径比静脉注射需要更高的剂量。这些剂量水平的变化可按照本领域熟知的方法使用标准的优化实践途径进行调整。序列数据库、有形介质中的序列以及算法多核苷酸和多肽序列组成了有价值的信息来源，用来确定它们的二维和三维结构以及进一步鉴定相似同源的序列。这些方法可很方便地通过下述步骤来进行，即将它们存入计算机可读介质，然后将数据存入一个已知的大分子结构程序或使用熟知的搜索工具如GCG程序包搜索一个序列数据库。
本发明还提供分析特征序列或链特别是基因序列或编码蛋白序列的方法。优选的序列分析的方法包括诸如序列同源性分析方法如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白结构分析、序列排列、进化分析、序列基元分析、开放阅读框确定、核酸碱基召唤、密码子使用分析、核酸碱基整理、和序列层析峰分析。
本发明提供了一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。此方法包括以下步骤提供在一种计算机可读介质中的含有本发明的一种多核苷酸序列的第一个多核苷酸序列，将所述第一个多核苷酸与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。
本发明提供了一种以计算机为基础的方法，用于进行同源性鉴定。所述方法包括以下步骤提供在一种计算机可读介质中的含有本发明的一种多肽序列的第一个多肽序列，将所述第一个多肽序列与至少一种第二个多核苷酸或多肽序列比较，来确定同源性。
本申请书中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，在这里都全文引入作为参考，如同它们各自都特别地和个别地在此全文列出。本申请要求优先权的任何专利申请也以与上面对出版物和参考所介绍的相同方式在此全文引入作为参考。定义“同一性”如同本领域所熟知的，是两种或多种多肽序列或两种或多种多核苷酸序列之间的相关性，根据具体情况，可通过序列比较来确定。在本领域，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，根据具体情况，可通过这些序列的链的匹配来确定。“同一性”可使用已知的方法方便地计算，包括但不限于(《计算分子生物学》，Lesk,A.M.编辑，Oxford University Press,New York,1988；《生物计算机信息和基因组计划》Smith,D.W.编辑，Academic Press,New York,1993；《序列数据的计算机分析》I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑，Humana Press,New Jersey,1994；《分子生物学中的序列分析》von Heine,G.,Academic Press,1987；和《序列分析引物》Gribskov,M.和Devereux,J.编辑，M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,《SIAM J.Applied Math》48:1073(1988)。测定同一性的方法被设计来给出检测序列之间的最大匹配。而且，测定同一性的方法在公众可获得的计算机程序中编码。用来测定两种序列之间的同一性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包中的GAP程序(Devereux,J.等《核酸研究》12(1):387(1984)、BLASTP、BLASTN(Altschul,S.F.等《分子生物学杂志》215:403-410(1990)以及FASTA(Pearson和Lipman《美国科学院院刊》85:2444-2448(1988)。BLAST程序家族可从NCBI和其他来源获得《BLAST手册》Altschul,S.等，NCBINLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等《分子生物学杂志》215:403-410(1990)。著名的Smith Waterman算法也可用来测定同一性。
多肽序列比较的参数包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48:443-453(1970)比较矩阵Henikoff和Henikoff的BLOSSUM62《美国科学院院刊》89:10915-10919(1992)缺口补偿8缺口长度补偿2使用这些参数的程序可以从Genetics Computer Group,Madison WI以“缺口”程序的形式获得。上述参数是多肽比较的缺省参数(对末端缺口无补偿)。
多核苷酸序列比较的参数包括以下算法Needleman和Wunsch，《分子生物学杂志》48:443-453(1970)比较矩阵匹配=+10，不匹配=0缺口补偿50缺口长度补偿3来源Genetics Computer Group,Madison WI的“缺口”程序。上述参数是核酸比较的缺省参数。
多核苷酸和多肽的“同一性”的优选含义根据情况在下面(1)和(2)中提供。
(1)多核苷酸实施方案进一步包括含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ ID NO:1的参考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包括一定数量的核苷酸改变，其中这种改变可以选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多核苷酸序列的5’或3’末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中，其中核苷酸改变的数量如下确定SEQ ID NO:1中的总核苷酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO:1的总核苷酸数中减除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO:1中的核苷酸总数，y对50％来说是0.50，对60％来说是0.60，对70％来说是0.70，对80％来说是0.80，对85％来说是0.85，对90％来说是0.90，对95％来说是0.95，对97％来说是0.97，对100％来说是1.00，而·是乘法运算的符号，对xn和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xn中减除。编码SEQ ID NO:2的多肽的多核苷酸的改变可能在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，因此改变后的多核苷酸编码的多肽会发生变化。
例如，本发明的多核苷酸序列可以与SEQ ID NO:1的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的核苷酸改变，因此同一性小于100％。这种改变可以选自至少一个核苷酸缺失、置换(包括转换和颠换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多核苷酸序列的5’或3’末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的核苷酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。核苷酸改变的数量如下确定SEQ ID NO:1中的总核苷酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO:1的总核苷酸数中减除，或者nn≤xn-(xn·y)其中nn为核苷酸改变数量，xn为SEQ ID NO:1的总核苷酸数，y值在70％时为0.70，在80％时为0.80，在85％时为0.85，依此类推，·为乘法运算的符号，其中若xn和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xn中减除。
(2)多肽实施方案进一步包括含有如下多肽序列的分离多肽，该多肽序列与SEQ ID NO:2的参考序列至少具有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中所述多肽序列可以与SEQ ID NO:2的参考序列相同，或者与参考序列相比，可包括一定数量的氨基酸改变，其中所述改变选自至少一个氨基酸缺失、取代(包括保守性或非保守性取代)或插入，而且所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何地方、分别散布在参考序列的氨基酸中或者以一个或多个毗连群散布在参考序列中，并且所述氨基酸改变的数目如下确定SEQ ID NO:2中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ ID NO:2的总氨基酸数中减除，或者na≤xa-(xa·y)其中na为氨基酸改变数量，xa为SEQ ID NO:2中的氨基酸总数，y对50％来说是0.50，对60％来说是0.60，对70％来说是0.70，对80％来说是0.80，对85％来说是0.85，对90％来说是0.90，对95％来说是0.95，对97％来说是0.97，对100％来说是1.00，而·是乘法运算的符号，若xa和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xa中减除。
例如，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO:2的参照序列相同，即同一性为100％，或者与参照序列相比包括一定数量的氨基酸改变，因此同一性小于100％。这种改变可以选自至少一个氨基酸缺失、置换(包括保守和非保守置换)或插入，其中所述改变可以发生在参照多肽序列的氨基或羧基末端或两个末端之间的任何位置，分别散布在参照序列的氨基酸之间，或者以一个或多个毗连群散布在参照序列中。同一性百分数一定时氨基酸改变的数量如下确定SEQ ID NO:2中的总氨基酸数乘以相应同一性百分数(除以100)，然后将其结果从SEQ IDNO:2的总氨基酸数中减除，或者na≤xa-(xa·y)其中na为氨基酸改变数量，xa为SEQ ID NO:2的总氨基酸数，y值在70％时为0.70，在80％时为0.80，在85％时为0.85，依此类推，而·是乘法运算的符号，其中若xa和y的结果不是整数，则将其四舍五入取最近的整数，再从xa中减除。
“个体”在用于此处指示一种生物体时，是指一种多细胞真核生物，包括但不限于后生动物、哺乳动物、卵生动物、牛科、猿、灵长动物和人。
“分离的”表示“通过人工”改变其天然状态，即如果“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它已经从其原始环境改变或取出或者已经取出并改变。例如，在本文中使用该术语时，在活动物体内存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但已经与天然状态下共存的物质分开的同样多核苷酸或多肽就是“分离的”。而且，一种多核苷酸或多肽在通过转化、遗传操作或任何其他重组方法导入一种生物体时，即使它仍然存在于所述生物体中，它也是“分离”的，该生物体可以是活的或死的。
“多核苷酸”一般指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，它可以是修饰或非修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。
“变体”指不同于参照多核苷酸或多肽但保留了基本特性的多核苷酸或多肽。一般多核苷酸变体的核苷酸序列与参照多核苷酸不同。变体核苷酸序列的变化可能改变或不改变由参照多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变可能导致参照序列编码的多肽中氨基酸的置换、添加、缺失、融合和截短。一般多肽变体的氨基酸序列与参照多肽不同。通常，差异有限，因此参照多肽和变体的序列在总体上是极其近似的，在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨基酸序列上可以有任何组合形式的一个或多个置换、添加、缺失的区别。置换或插入的氨基酸残基可以是或不是遗传密码编码的氨基酸。多核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，如等位变体，或者是非天然存在的。非天然存在的多核苷酸和多肽变体可以通过诱变技术或直接合成制备。
“疾病”是指任何由细菌感染导致或与之有关的疾病，包括诸如上呼吸道感染、侵袭性细菌疾病如菌血症和脑膜炎。
实施例下面的实施例使用标准的技术进行，这些技术对本领域的技术人员来说是熟知的和常规的，除非它们在其他地方详细介绍。实施例是说明性的，不能限制本发明。实施例1来自两株脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB030基因的发现和DNA测序证明A脑膜炎奈瑟氏血清型B菌株ATCC13090中的BASB030SEQ ID NO:1中公开的BASB030基因首先发现于Incyte Pathoseq数据库，该数据库含有脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的未完成的基因组DNA序列。SEQ ID NO:2中所示的BASB030多核苷酸序列的翻译结果与淋病奈瑟氏球菌PilQ外膜蛋白显示有明显的相似性(在758个氨基酸重叠上有81％的同一性)。BASB030基因的序列进一步用实验来证实。为达到这一目的，使用QIAGEN基因组DNA抽提试剂盒(QiagenGmbh)从1010脑膜炎奈瑟氏球菌细胞(菌株ATCC13090)中抽提基因组DNA，将1μg的此物质用于聚合酶链反应DNA扩增，使用含有内部NdeⅠ位点(下划线)的引物PilQ1(5’-GGG G GCTAGC AA TAC CAA ACT GACAAA AAT CAT TTC C-3’)[SEQ ID NO:7]和含有内部HindⅢ位点(下划线)的PilQ2(5’-GGG G AAGCTT AT AGC GCA GGC TGT TGC CGG C-3’)[SEQ ID NO:6]。将此PCR产物凝胶纯化，并使用Big Dye Cycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)和ABI 373/PRISM DNA测序仪进行DNA测序。DNA测序在两条链上进行，使用2的冗余，全长序列使用DNASTARLasergene软件包的SeqMan程序拼接，所获得的DNA序列和推定的多肽序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。B．脑膜炎奈瑟氏血清型B菌株H44/76中的BASB030BASB030基因的序列也在另一株脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株H44/76中进行了测定。为此，使用实施例1中所列的实验条件从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76中抽提基因组DNA。然后将此物质(1μg)用于聚合酶链反应DNA扩增，使用BASB030基因特异的PilQ1和PilQ2引物。获得了一个约2300bp的DNA片段，用NdeⅠ/HindⅢ限制性内切核酸酶消化，使用标准的分子生物学技术(《分子克隆，实验室手册第二版》，编辑Sambrook,Fritsch&Maniatis,Cold Spring Harborpress 1989)将其插入pET-24b克隆/表达载体(Novagen)的相应位点。然后将重组的pET-24b/BASB030使用Big Dyes试剂盒(Appliedbiosystems)进行测序，并在ABI 373/A DNA测序仪上按厂商介绍的条件进行分析。结果获得了多核苷酸和推导的多肽序列，分别被称为SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6。使用来自DNASTAR软件包的MegSAlign程序，对SEQ ID NO:3和5的多核苷酸序列进行了序列对比，并示于

图1；同一性的成对比较见表1，结果显示3个BASB030多核苷酸基因序列的同一性水平均大于98.0％。使用相同的MegAlign程序，对SEQ ID NO:2,4和6的多肽序列进行了序列对比，并示于图2；同一性的成对比较见表2，结果显示3个BASB030蛋白序列的同一性水平均大于95.0％。
总而言之，这些数据表明，BASB030基因在两种脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株中有很高的序列保守性。表1:BASB030多核苷酸序列的成对同一性(％)
表2:BASB030多肽序列的成对同一性(％)
实施例2重组BASB030蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化实施例1B中介绍了pET-24b/BASB030克隆/表达载体的构建。该载体携带了分离自菌株H44/76的BASB030基因，其中BASB030基因融合了6个连续的组氨酸残基，并处于噬菌体T7基因10强启动子的控制之下。为了进行表达研究，将该载体导入大肠杆菌菌株Novablue(DE3)(Novagen)中，其中T7聚合酶基因被置于异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)调节的lac启动子的控制之下。Novablue(DE3)[pET-24b/BASB030]大肠杆菌重组菌株的液体培养物(100ml)在37℃振荡培养直至600nm处的光密度(OD600)达到0.6。在该时间点上，加入IPTG至终浓度为1mM，并使培养物再生长另外4小时。然后将培养物在10000rpm离心，将沉淀在-20℃至少冷冻10小时。融化后，将沉淀在25℃在缓冲液A(6M盐酸胍、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH8.0)中重悬30分钟，从针头中通过3次，离心(20000rpm、15分钟)澄清。然后将样品上样于流速为1ml/min的Ni2+Hitrap柱(PharmaciaBiotech)。当流出物通过后，柱用40ml的缓冲液B(8M尿素、0.1MNaH2PO4、0.01M Tris、pH8.0)、40ml的缓冲液C(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH6.3)连续洗涤。然后用30ml含有500mM咪唑的缓冲液D(8M尿素、0.1M NaH2PO4、0.01M Tris、pH6.3)从柱中将重组蛋白BASB030/His6洗脱，并收集大小为3ml的级份。如图3所示(泳道1)，从柱中洗脱了高度富集(在考马斯亮蓝染色时，纯度估计大于90％)的BASB030/His6蛋白，迁移位置为66kDa(估计的相对分子量)。该多肽与一种针对5组氨酸基元的鼠单克隆抗体发生反应(见图3，泳道2)。而且，变性、重组的PilQ-His6蛋白可以在无尿素的溶液中溶解。为此，8M尿素中的变性PilQ-His6对依次含有6M、4M、2M尿素和无尿素缓冲液R(NaCl 150mM,10mM NaH2PO4，精氨酸0.5MpH6.8)充分透析(2小时)。PilQ的相应制备物即使在冻融之后仍然保持可溶。总而言之，这些数据表明，BASB030基因能够以可溶或不可溶的重组形式(BASB030/His6)在大肠杆菌中表达和纯化。实施例3用BASB030多肽免疫小鼠和通过ELISA对重组BASB多肽的抗体应答识别部分纯化天然BASB030在第0天、14天和28天三次注射给BALB/C小鼠(5只动物/组)。天然BASB030多肽直接来自脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株(获自J Tommassen)。动物通过皮下途径注射5μg(首次注射)和2μg(二次和三次注射)BASB030多肽，多肽配制在SBAS2(每剂含5μgMPL和5μg QS21的SB62乳剂)中，或吸附在AlPO4上(5μg MPL)。在实验中也加入阴性对照组，其由仅用SBAS2乳剂(无BASB030)免疫的小鼠组成。小鼠在第28天(14天PostⅡ)和35天(7天PostⅢ)放血，以检测特异性的抗BASB030抗体。特异性抗BASB030抗体使用部分纯化的重组BASB030多肽作为微量板包被蛋白通过ELISA测定。仅对PostⅡ(28天)的混合血清(来自5只小鼠)进行分析。通过ELISA对重组蛋白上BASB030表位的识别简而言之，微量板(Maxisorp,Nunc)用100μl PBS中约0.5μg/ml的重组BASB030溶液37℃包被2小时。然后，用300μl 150mM的NaCl-0.05％Tween 20洗涤3次。再用100μl PBS-0.3％酪蛋白包被，并在室温下振荡温育30分钟。在抗体温育之前按照同样步骤再次洗涤微量板。动物血清在PBS-0.3％酪蛋白-0.05％Tween 20中进行系列二倍稀释并置于微量板(起始稀释度1/100,12次稀释)中，然后在室温下振荡温育30分钟，再进行下一次相同的洗涤步骤。辍合于生物素的抗小鼠Ig(来自兔，Dakopatts E0413)以PBS-0.3％酪蛋白-0.05％Tween 20中的1/2000稀释度使用，以检测小鼠抗BASB030抗体。最后一次洗涤步骤(同前)之后，微量板与在相同溶剂中1/4000稀释的链亲和素-过氧化物酶复合物溶液在室温下振荡温育。
以下所示结果表明，BASB030多肽无论是以SBAS2乳剂形式还是吸附在AlPO4/MPL上在BALB/C小鼠中都是高度免疫原性的(图4)。注射天然蛋白仅两次后诱导的这些抗体，能够识别重组BASB030多肽。该图也显示SBAS1乳剂的免疫原性较AlPO4/MPL制剂略强。纯化的重组BASB303多肽也注射BALB/C小鼠以评价其免疫原性。通过全细胞ELISA测定的细胞上BASB030天然表位的识别同源H44/76 MenB菌株(B:15:P1.7,16)已经用作包被细菌以检测动物血清中特异性抗BASB030抗体。简而言之，微量板(Maxisorp,Nunc)用100μl H44/76的6小时培养物1/10稀释物(PBS中)溶液包被，培养物中细菌用400μg/ml四环素杀死。培养板在37℃温育至少16小时，直到培养板完全干燥。然后，用300μl 150mM NaCl-0.05％Tween 20洗涤。然后，培养板用100μl PBS-0.3％酪蛋白包被，并在室温下振荡温育30分钟，再进行下一次相同的洗涤步骤。辍合于生物素的抗小鼠Ig(来自兔，Dakopatts E0413)以PBS-0.3％酪蛋白-0.05％Tween 20中1/2000稀释物使用，以测定小鼠抗BASB030抗体。最后一次洗涤步骤之后(同前)，培养板用相同溶剂中1/4000稀释的链亲和素-过氧化物酶复合物溶液室温下振荡温育30分钟。
如图5所示，我们可以认定，在以配制在SBAS2乳剂中和吸附在AlPO4/MPL佐剂上的纯化分子免疫的小鼠中(每组5只小鼠的结果合并)，存在特异性的对同源H44/76菌株的BASB030抗原识别。与重组BASB030蛋白中观察到的结果相同，使用SBAS2制剂的抗体应答较高。仅用SBAS2佐剂注射的小鼠未显示明确的阳性反应。实施例4恢复期病人血清中抗BASB030抗体的存在在本试验中，使用纯化重组BASB030蛋白以及天然BASB030蛋白(获自J Tommassen,Netherland)，通过western印迹来检测恢复期病人的血清中特异性抗体的存在。
简而言之，将5μg纯化的BASB030蛋白(重组或天然)上样于SDS-PAGE梯度凝胶(4-20％,Novex,code n°EC60252)进行电泳。然后使用Bio-rad转印系统(code n°170-3930)在100伏经过1小时将蛋白转移至硝酸纤维素膜(0.45μm,code n°162-0114)上。然后滤膜用PBS-0.05％Tween 20在室温封闭过夜，与人血清温育。这些血清在PBS-0.05％Tween 20中稀释100倍，并在硝酸纤维素膜上在室温下温育2小时，并使用微转印系统(Miniprotean,Bio-rad coden°170-4017)，轻轻振荡。将硝酸纤维素膜在PBS-0.05％Tween 20中洗涤5分钟，重复此步骤3次，然后将硝酸纤维素膜与在相同洗涤缓冲液中按1/500稀释的合适辍合物(生物素化的羊抗人Ig抗体，Amersham code n°RPN1003，或生物素化的兔抗小鼠Ig抗体，Amershamcode RPN1001)在室温下轻轻振荡温育1小时。按前面的介绍将膜洗涤3次，并与在洗涤缓冲液中按1/1000稀释的链亲和素-过氧化物酶复合物(Amersham code n°1051)振荡温育30分钟。经过最后3次重复的洗涤步骤，在含有30mg 4-氯-1-萘酚(Sigma)、10ml甲醇、40mlPBS和30μl H2O2的50ml溶液中温育10到15分钟进行显色。将膜在蒸馏水中洗涤数次终止显色。
图6和7(A部分)中的结果显示，7个恢复期血清中有5-7个识别不同分子量的天然BASB030蛋白(图6)或约90kDa的重组BASB030蛋白(图7)。与重组BASB030多肽微弱反应的2个恢复期血清是n°261469和n°261979(图7)，而天然BASB030多肽中，n°262117和261979未显示任何明确反应(图6)。具有最高反应性的蛋白在两种蛋白(重组和天然)中相同。这些反应可以反映该多肽作为疫苗候选者的重要性。天然BASB030蛋白似乎显示3种不同的条带，这可能是由于BASB030多肽，在两种凝胶上分子量最高的相同(约90kDa)。直接从存在降解产物的细菌中分离的天然BASB030多肽的约45和35kDa的条带清楚可见。在B部分，二者的western印迹显示针对淋病奈瑟氏球菌(J.Tommassen,The Netherland)的同源蛋白的小鼠抗体反应。结果清楚地显示，对重组BASB030蛋白，两种同源BASB030蛋白之间有明确的交叉反应，检测到两个清楚的带，一个是恢复期人血清识别的90kDa的主要带，另一个是约70kDa的带(图7)。对天然BASB030蛋白，小鼠抗体不仅识别恢复期血清中所见到的90和45kDa主要带，也识别可能是降解产物的带(约75、70、55、40、35和25kDa，见图6)。实施例5:BASB030疫苗的效力抗BASB030抗体活性抗BASB030抗体对同源脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的抗菌活性动物血清(合并)的杀菌活性用如前(文献1,2)所述并略加改进的方法测定。简而言之，脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B(H44/76菌株)用来确定动物血清的杀菌活性。在U形底96孔微量板(NUNC)上，50μl/孔系列2倍稀释物与37.5μl/孔调整为2.5×104CFU/ml的对数期脑膜炎球菌悬液温育，在37℃ 210rpm振荡温育15分钟(Orbital摇床，FormaScientific)。然后，加入12.5μl幼兔补体(Pel-freeze Biologicals,US)，再在相同条件下温育1小时。然后，将10μl各孔混合物涂布在含1％Isovitalex和1％热灭活的马血清，再在37℃与5％二氧化碳温育过夜。次日，计数每个稀释度的菌落数，杀菌效价为与无血清的补体对照相比50％杀灭的血清的稀释度。通过这种方法，单个菌落可以计数达每斑点100CFU。滴度表示为减少50％杀灭的稀释度，通过衰减分析计算。
示于表3的结果显示，抗BASB030抗体对H44/76同源菌株具有强杀菌活性，用作为阳性对照的抗PorA单克隆抗体也观察到了该结果。在1/2560稀释度，杀灭百分比仍很高(91％)。文献1．Hoogerhout P.,Donders E.M.L.M.,van Gaans-van den BrinkJ.A.M.,Kuipers B.,Brugghe H.f.,van Unen L.M.A.,TimmermansH.A.M.,ten Hove G.J.,de Jong AD.P.J.M.,Peeters C.C.A.M.,Wiertz E.J.H.J.，和Poolman J.T.，传染与免疫，1995年9月，vol 63,n°9,p3473-3478。
2．Maslanka S.E.,Gheesling L.L.,Libutti D.E.,DonaladsonK.B.J.,Harakeh H.S.,Dykes J.K.,Arhin F.F.,Devi S.J.N.,FraschC.E.,Huang J.C.,Kriz-Kuzemenska P.,Lemmon R.E.,Lorange M.,Peeters C.C.A.M.,Quataert S.,Tai J.Y.,Carlone G.M.，和跨实验室研究组，Clin.Diagn.Lab.Immunol.,1997,4:156-167。表3抗BASB030抗体的杀菌效果
实施例6抗BASB030抗体在被动保护模型(大鼠幼仔)中的效果在大鼠幼仔保护模型中评价了获自免疫小鼠(两组，每组5只)的抗BASB030抗体的保护效果。该试验测定了攻击之前24小时注射的抗体的脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株的清除活性。
简而言之，在用活细菌攻击之前24小时(-1天)，将100μl 1/10稀释的小鼠血清混合物(含特异性抗BASB030抗体)通过腹膜内途径(IP)注射进7日龄大鼠幼仔(Sprague Dawley)。-1天随机分组并用小鼠血清被动免疫的大鼠幼仔在0天通过IP途径注射以10毫克铁葡聚糖，30分钟以后，通过IP途径用来自一种或多种脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76(B:15:P1.7,16)的107活细菌(100μl)攻击，该细菌已在大鼠中传代两次。脑膜炎奈瑟氏球菌菌株在液体TSB培养基中生长大约2小时。然后用PBS稀释细菌，得到1.108CFU/ml悬液。七日龄大鼠幼仔用于该试验。每组8只动物，所有幼仔在IP途径注射100μl待测混合血清免疫之前随机分组。攻击之后3小时，通过心脏穿刺获得的20μl血样用PBS稀释(1/10,1/100,1/1000和1/10000)，几个稀释度涂布于Mueller Hinton培养基以进行集落形成单位(CFU)计数。然后(24小时后)，估计CFU数，并与用PBS被动免疫的大鼠幼仔血样的每毫升CFU数比较。对照组包括PBS注射的大鼠。计算每只动物的平均重量，每组的平均值相互比较。抗BASB030抗体获得的结果(见图8)表明，与阴性对照相比，这些特异性抗体对脑膜炎奈瑟氏球菌H44/76菌株具有清除效果。与仅用PBS注射、无特异性抗体存在的小鼠相比，抗BASB030抗体的结果要高出1 log10。用抗BASB030抗体观察到的保护效果与用熟知的抗PorA单克隆抗体获得的结果(H44/29，抗P1.16)相等。
图3中的图例基本纯(大于80％)的BASB030蛋白级分由SDS-PAGE条件下4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶(NOVEX)上获得，对照是蛋白分子量标记。凝胶用考马斯蓝R250染色，或使用抗(His5)单克隆抗体通过western印迹分析。保藏材料含有脑膜炎奈瑟氏球菌血清型B菌株的保藏物已于1997年6月22日在美国典型培养物保藏中心(这里表示为“ATCC”)进行保藏，保藏号为13090。该保藏物为脑膜炎奈瑟氏球菌(Albrecht和Ghon)，是一种从脑膜炎奈瑟氏球菌分离物构建的1.5-2.9kb插入文库的冻干物。该保藏物在《Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.》8:1-15(1958)中介绍。
该脑膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在此被称为“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
保藏菌株含有全长的BASB030基因。保藏菌株中所含的多核苷酸以及编码的任何多肽的氨基酸序列与本文的序列描述不一致时，以前者为准。
保藏菌株的保藏是根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》的条款进行的。在专利被授予时，该菌株即可不受限制地无条件向公众发放。提供该保藏菌株仅为方便本领域技术人员，本发明的实施并不一定需要该保藏材料，如同35U.S.C.ξ112.的要求。
序列表<110>Smith Kline Beecham Biologicals S.A.
<120>新化合物<130>BM45323<160>8<170>Fast SEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>2310<212>DNA<213>细菌<400>1atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60acagcatctg caggaaacat tacagacatc aaagtttcct ccctgcccaa caaacagaaa 120atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300ctggttctga atctgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg gaacaaagtt 360tggatattca ttaacgaatc ggacgatacc gtgtccgccc ccgcacgccc cgccgtaaaa 420gccgcgcctg ccgcaccggc aaaacaacag ggctgccgca ccgtctacca agtccgcagt 480atccgtatcc aaacccttta ccccggcaaa acaacagctg ccgcaccgtt taccgagtcc 540gtagtatccg tatccgcacc gttcagcccg gcaaaacaac aggcggcggc atcagcaaaa 600caacagacgg cagcaccagc aaaacaacag acggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660gcaccagcaa aacaaaccaa tatcgatttc cgcaaagacg gcaaaaatgc cggcattatc 720gaattggctg cattgggctt tgccgggcag cccgacatca gccaacagca cgaccacatc 780atcgttacgc tgaaaaacca taccctgccg accacgctcc aacgcagttt ggatgtggca 840gactttaaaa caccggttca aaaggttacg ctgaaacgcc tcaataacga cacccagctg 900attatcacaa cagccggcaa ctgggaactc gtcaacaaat ccgccgcgcc cggatacttt 960accttccaag tcctgccgaa aaaacaaaac ctcgagtcag gcggcgtgaa caatgcgccc 1020aaaaccttca caggccggaa aatctccctt gacttccaag atgtcgaaat ccgcaccatc 1080ctgcagattt tggcaaaaga atccgggatg aacattgttg ccagcgactc cgtcaacggc 1140aaaatgaccc tctccctcaa agacgtacct tgggatcagg ctttggattt ggttatgcag 1200gcacgcaacc tcgatatgcg ccaacaaggg aacatcgtca acatcgcgcc ccgcgacgag 1260ctgcttgcca aagacaaagc cttcttacag gcggaaaaag acattgccga tctaggcgcg 1320ctgtattcac aaaacttcca attgaaatac aaaaatgtgg aagaattccg cagcatcctg 1380cgtttggaca atgccgacac aaccggaaac cgcaatacgc ttgtcagcgg caggggcagc 1440gtgctgatcg atcccgccac caataccctg attgttaccg atacccgcag cgtcatcgaa 1500aaattccgca aactgattga cgaattggac gtacccgcgc aacaagtgat gattgaggcg 1560cgtatcgtcg aagcggcaga cggcttctcg cgcgatttgg gcgttaaatt cggcgcgaca 1620ggcaagaaaa agctgaaaaa tgatacaagc gcattcggct ggggggtaaa ctccggcttc 1680ggcggcgacg ataaatgggg ggccgaaacc aaaatcaacc tgccgattac cgctgccgca 1740aacagcattt cgctggtgcg cgcgatttcc tccggtgcct tgaatttgga attgtccgca 1800tccgaatcgc tttcaaaaac caaaacgctt gccaatccgc gcgtgctgac ccaaaaccgc 1860aaagaggcca aaatcgaatc cggttacgaa attcctttca ccgtaacctc aatcgcgaac 1920ggcggcagca gcacgaacac ggaactcaaa aaagccgtct tggggctgac cgttacgccg 1980aacatcacgc ccgacggcca aatcattatg accgtcaaaa tcaacaagga ctcgcctgcg 2040caatgtgcct ccggtaatca gacgatcctg tgtatttcga ccaaaaacct gaatacgcag 2100gctatggttg aaaacggcgg cacattgatt gtcggcggta tttatgaaga agacaacggc 2160aatacgctga ccaaagtccc cctgttgggc gacatccccg ttatcggcaa cctctttaaa 2220acacgcggga aaaaaaccga ccgccgcgaa ctgctgattt tcattacccc gaggattatg 2280ggtacggccg gcaacagcct gcgctattga 2310<210>2<211>769<212>PRT<213>细菌<400>2Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys Ile Ile Ser Gly Leu Phe Val Ala Thr1 5 10 15Ala Ala Phe Gln Thr Ala Ser Ala Gly Asn Ile Thr Asp Ile Lys Val20 25 30Ser Ser Leu Pro Asn Lys Gln Lys Ile Val Lys Val Ser Phe Asp Lys35 40 45Glu Ile Val Asn Pro Thr Gly Phe Val Thr Ser Ser Pro Ala Arg Ile50 55 60Ala Leu Asp Phe Glu Gln Thr Gly Ile Ser Met Asp Gln Gln Val Leu65 70 75 80Glu Tyr Ala Asp Pro Leu Leu Ser Lys Ile Ser Ala Ala Gln Asn Ser85 90 95Ser Arg Ala Arg Leu Val Leu Asn Leu Asn Lys Pro Gly Gln Tyr Asn100 105 110Thr Glu Val Arg Gly Asn Lys Val Trp Ile Phe Ile Asn Glu Ser Asp115 120 125Asp Thr Val Ser Ala Pro Ala Arg Pro Ala Val Lys Ala Ala Pro Ala
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<210>3<211>2310<212>DNA<213>细菌<400>3atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc cgcctttcag 60acagcatctg caggaaacat tacagacatc aaagtttcct ccctgcccaa caaacagaaa 120atcgtcaaag tcagctttga caaagagatt gtcaacccga ccggcttcgt aacctcctca 180ccggcccgca tcgccttgga ctttgaacaa accggcattt ccatggatca acaggtactc 240gaatatgccg atcctctgtt gagcaaaatc agtgccgcac aaaacagcag ccgtgcgcgt 300ctggttctga atctgaacaa accgggccaa tacaataccg aagtacgcgg gaacaaagtt 360tggatattca ttaacgaatc ggacgatacc gtgtccgccc ccgcacgccc cgccgtaaaa 420gccgcgcctg ccgcaccggc aaaacaacag gctgccgcac cgtctaccaa gtccgcagta 480tccgtatcca aaccctttac cccggcaaaa caacaggctg ccgcaccgtt taccgagtcc 540gtagtatccg tatccgcacc gttcagcccg gcaaaacaac aggcggcggc atcagcaaaa 600caacagacgg cagcaccagc aaaacaacag acggcagcac cagcaaaaca acaggcggca 660gcaccagcaa aacaaaccaa tatcgatttc cgcaaagacg gcaaaaatgc cggcattatc 720gaattggctg cattgggctt tgccgggcag cccgacatca gccaacagca cgaccacatc 780atcgttacgc tgaaaaacca taccctgccg accacgctcc aacgcagttt ggatgtggca 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565 570 575Thr Ala Ala Ala Asn Ser Ile Ser Leu Val Arg Ala Ile Ser Ser Gly580 585 590Ala Leu Asn Leu Glu Leu Ser Ala Ser Glu Ser Leu Ser Lys Thr Lys595 600 605Thr Leu Ala Asn Pro Arg Val Leu Thr Gln Asn Arg Lys Glu Ala Lys610 615 620Ile Glu Ser Gly Tyr Glu Ile Pro Phe Thr Val Thr Ser Ile Ala Asn625 630 635 640Gly Gly Ser Ser Thr Asn Thr Glu Leu Lys Lys Ala Val Leu Gly Leu645 650 655Thr Val Thr Pro Asn Ile Thr Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Thr Val660 665 670Lys Ile Asn Lys Asp Ser Pro Ala Gln Cys Ala Ser Gly Asn Gln Thr675 680 685Ile Leu Cys Ile Ser Thr Lys Asn Leu Asn Thr Gln Ala Met Val Glu690 695 700Asn Gly Gly Thr Leu Ile Val Gly Gly Ile Tyr Glu Glu Asp Asn Gly705 710 715 720Asn Thr Leu Thr Lys Val Pro Leu Leu Gly Asp Ile Pro Val Ile Gly725 730 735Asn Leu Phe Lys Thr Arg Gly Lys Lys Thr Asp Arg Arg Glu Leu Leu740 745 750Ile Phe Ile Thr Pro Arg Ile Met Gly Thr Ala Gly Asn Ser Leu Arg755 760 765Tyr<210>5<211>2310<212>DNA<213>细菌<400>5atgaatacca aactgacaaa aatcatttcc ggtctctttg tcgcaaccgc 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<223>引物<400>7gggggctagc aataccaaac tgacaaaaat catttcc 37<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>8ggggaagctt atagcgcagg ctgttgccgg c 3权利要求
1．含有如下氨基酸序列的分离多肽，该氨基酸序列与选自SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
2．权利要求1的分离多肽，其中氨基酸序列与选自SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少95％的同一性。
3．权利要求1的分离多肽，它含有选自SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:6的氨基酸序列。
4．SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的分离多肽。
5．SEQ ID NO:2的分离多肽。
6．权利要求1-5任一项的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片段的免疫原活性基本上与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽相同。
7．含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列编码这样一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列的全长序列分别具有至少85％的同一性；或与所述分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
8．含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列与编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽的核苷酸序列在全部编码区上至少有85％的同一性；或与所述分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
9．含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列与SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:5的全长序列分别具有至少85％的同一性；或与所述分离多核苷酸互补的核苷酸序列。
10．权利要求7-9任一项的分离多核苷酸，其中与SEQ ID NO:3或5的同一性至少为95％。
11．含有如下核苷酸序列的分离多核苷酸，该核苷酸序列编码SEQID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽。
12．含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的多核苷酸序列的分离多核苷酸。
13．含有编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸，它可通过在严紧杂交条件下，用具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或其片段的序列的标记探针筛选合适的文库获得。
14．含有编码SEQ ID NO:2的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。
15．含有SEQ ID NO:1的多核苷酸的分离多核苷酸。
16．含有编码SEQ ID NO:2的多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸，它可通过在严紧杂交条件下用具有SEQ ID NO:1或其片段的序列的标记探针筛选合适文库获得。
17．含有权利要求7-16任一项的分离多核苷酸的表达载体或重组的活微生物。
18．含有权利要求17的表达载体的宿主细胞或一种亚细胞组分，或所述宿主细胞的膜，其中宿主细胞表达一种分离多肽，该多肽含有一种与选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。
19．制备一种多肽的方法，其中该多肽含有一种与选自SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，这种方法包括将权利要求18的宿主细胞在足以产生所述多肽的条件下培养，并从培养基中回收多肽。
20．表达权利要求7-16任一项的多核苷酸的方法，包括用含有至少一种所述多核苷酸的表达载体转化宿主细胞，并在足以表达任何一种所说多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。
21．含有有效量的权利要求1至6任一项的多肽和可药用载体的疫苗组合物。
22．含有有效量的权利要求7至16任一项的多核苷酸和可药用载体的疫苗组合物。
23．权利要求21或22任一项的疫苗组合物，其中所述组合物至少含有一种另外的脑膜炎奈瑟氏球菌抗原。
24．对权利要求1至6任一项的多肽或免疫性片段具有免疫特异性的抗体。
25．诊断脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括鉴定在来自怀疑具有这种感染的动物的生物样品中存在的权利要求1-6任一项的多肽、或对所述多肽具有免疫特异性的抗体。
26．含有免疫有效量的权利要求1-6任一项的多肽的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
27．含有免疫有效量的权利要求7-16任一项的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的用途。
28．用于治疗患有脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的治疗组合物，它包括至少一种抗权利要求1-6的多肽的抗体以及合适的药用载体。
全文摘要
本发明提供BASB030多肽和编码BASB030多肽的多核苷酸以及通过重组技术生产这种多肽的方法。本发明还提供诊断性、预防性和治疗性的应用。
文档编号C07K16/12GK1322249SQ99809103
公开日2001年11月14日 申请日期1999年5月26日 优先权日1998年5月26日
发明者J·L·吕勒, J·P·M·托马森 申请人:史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司, 乌得勒支大学