专利名称：一种对脑膜炎奈瑟氏菌的its特异的核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA_23S rRNA基因间区(Internal transcribed spacer，以下简称ITS)特异的寡核苷酸及其应用。
背景技术：
人类是脑膜炎奈瑟氏菌的唯一宿主。脑膜炎奈瑟氏菌作为条件致病菌，常存在于患者或带菌者的鼻咽腔黏膜中，约有5 10%的健康人鼻咽部带有本菌，流行期高达20 70%，其排菌时间可达数周至2年。病原菌借飞沫直接由空气传播，大部分感染者临床症状不明显，因此很多感染者成为无症状的携带者。在非流行期，发病率在1/10 3/10万左右， 而在流行期，发病可高达500/10万，对6个月到2岁的婴幼儿及青少年危害极大，即使在及时和适当的照顾下，该病的致死率也有10%到20%甚至超过50%。大约20%的人群在任何给定时间都有脑膜炎奈瑟氏菌寄生，无论是在发展中国家或是发达国家均可以引起较高的流脑发病率和死亡率。流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎奈瑟氏菌引起的急性化脓性脑膜炎，为急性呼吸道传染病。我国流脑发病率有明显上升的趋势，暴发流行时有发生，对我国人民的生命健康构成极大威胁。主要临床表现为发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征，重者可有败血症性休克和脑膜脑炎，脑脊液可呈化脓性改变。流行性脑膜炎常见的并发症为关节炎、硬脑膜下积液或积脓。暴发性败血症的致死率高于流行性脑脊髓膜炎。每年大约有一百万人感染细菌性脑膜炎，并有20万人因此死亡。54%的幸存者会留下残疾，包括失聪， 智力迟钝、失明、肢体瘫痪、智能及精神改变和脑积水。目前，对脑膜炎奈瑟氏菌传统的诊断主要依靠对脑脊液的涂片镜检、病原体培养、 免疫学检查抗原抗体以及从脑脊液、血液中分离培养出脑膜炎奈瑟氏菌。该法确诊脑膜炎奈瑟氏菌感染至少需2 3天，其中血清学鉴定因其灵敏度不够高，影响因素较多，有时难于作出可靠诊断，尤其在大规模流行病学调查时，常因工作量大，检测者经验不足、情绪波动等主观因素而影响结果可信度。传统方法特异性差、灵敏度低且费时。脑膜炎奈瑟菌对干燥、寒冷、热、阳光等非常敏感，在室温中3小时就死亡，同时受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，单独采用细菌培养方法会导致脑膜炎奈瑟菌漏检。近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术， 不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。核糖体内转录间隔区(ITS)，是介于16S rRNA和23S rRNA之间的区域，在几乎所有细菌的基因组中都以单拷贝或多拷贝的形式存在，相对较短(200bp-1000bp)。该区域进化速率较快，具有超变位点，它的变异速率相当于16S rRNA或者23S rRNA的十倍左右，在种内不同菌株间高度保守，而在细菌的种间存在着丰富的变化。因此具有很高的分辨率，更易区分开进化关系很近的菌种，大大增强了检测的特异性。可以为研究细菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。荧光定量PCR法的检出率高于常规PCR法，并且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、 自动化程度高等特点。它的技术更先进，操作更便捷，避免常规PCR反应后检测的烦琐步骤，并能达到实时监测、绝对定量的目的。无论是在阳性符合率和阴性符合率上都要优于分离培养法和直接涂片法，能检测一些不能被培养或者很微量的样品，对样品运输条件也比较宽松。荧光定量PCR法检测脑膜炎奈瑟氏菌具有高灵敏性、高特异性和高精确定量等特点，可为流脑检查提供一种快速、方便的病原学诊断手段，具有实用价值。该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物及探针介导下的荧光定量PCR过程中扩增目标序列，发出荧光信号，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。荧光定量PCR的扩增过程仅需1个小时。 这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸；本发明的另一个目的是提供该特异核苷酸的应用，设计引物和探针，通过优化和设计，提供一种用于检测脑膜炎奈瑟氏菌的荧光定量PCR试剂盒，并利用该荧光定量PCR试剂盒检测脑膜炎奈瑟氏菌的存在。本发明的目的通过以下技术方案实现一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO) 1-3所示的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的氨基酸序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤(1)基因组的提取；⑵通过PCR扩增脑膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)构建ITS克隆；(4)对ITS克隆测序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特异引物和探针的筛选。上述的核苷酸的应用，可将所述核苷酸作为引物和探针用于荧光定量PCR试剂盒或一般PCR试剂盒、作为探针用于杂交反应与荧光检测，或者用于制造基因芯片或微阵列以检测细菌。其中的SEQ ID NO :1(5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，)是上游引 物，SEQ ID NO :2(5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，)是下游弓丨物，SEQ ID NO: 3 (5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG (A) TCAC-3，，第 21 位为 G/A 简并)是探针。上述上游引物SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3均是根据脑膜炎奈瑟氏菌的tRNA-IA类型ITS设计合成的寡核苷酸，位于ITS序列上的287-359碱基位置。该引物可在试管中由DNA聚合酶选择性的复制合成介于两引物之间的DNA区段(针对脑膜炎奈瑟氏菌为73bp靶DNA片段)，可以将极其微量的(lpg DNA)目的基因在较短的时间内(1 小时)扩增到荧光检测可区分的水平。上述荧光定量PCR检测试剂盒包括如下试剂25mM MgCl2 50 μ 1 ；IOmM dNTP10 μ 1 ；IOX酶特异性反应缓冲液50 μ 1 ；5υ/μ 1耐热DNA聚合酶5μ 1 ；引物和探针各 10 μ 1 ；阳性对照品10 μ 1，阴性对照品10 μ 1 ；超纯水1ml。本发明还涉及上述的荧光定量PCR试剂盒在检测脑膜炎奈瑟氏菌中的应用。上述针对脑膜炎奈瑟氏菌的荧光定量PCR检测试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理_扩增_观察结果。引物、探针和荧光定量PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。使用上述的荧光定量PCR试剂盒检测脑膜炎奈瑟氏菌的荧光定量PCR检测方法包括以下步骤(1)提取待测临床样品模板； (2)在8联PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2UOX酶特异性反应缓冲液、rTaq聚合酶、引物、探针、待测样品模板和超纯水，混勻；(3)将8联薄壁PCR管中混勻的混合物在荧光定量PCR仪上扩增；(4)记录结果，分析并进行结果判断。上述步骤(1)中的临床样品模板为是临床样品中的脑脊液、血液或皮肤出血斑内容物或带菌者的鼻咽拭子标本粗提液，或是脑膜炎奈瑟氏菌的纯培养物的粗提液，或是纯 DNA,或者是阳性对照品和阴性对照品。上述步骤(1)中的临床样品模板的提取方法为(1)取培养物1. 5ml，在12000rpm条件下常温离心5分钟，去掉上清液；(2)取500 μ 1的超纯水重悬沉淀，在12000rpm条件下常温离心5分钟，去掉上清液，控干；(3)取100 μ 1超纯水重悬沉淀，在100°C沸水中水浴10分钟；(4) 12000rpm条件下离心10分钟；(5)取5 μ 1中层上清做为荧光定量PCR反应的模板。上述步骤(3)中的荧光定量PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95°C，2分钟；变性温度和时间为95 °C，15秒；复性和延伸温度和时间为60°C，60秒；变性、复性、延伸的循环次数为40个循环。待反应结束后直接观察反应示意图即可得到检测结果。本发明通过配制一种可检测脑膜炎奈瑟氏菌的可产业化生产的荧光定量PCR试剂盒，将荧光定量PCR检测方法需要使用的组分组合在一起，使用时，提取待测样品，同时经过较为简单的操作程序就可以进行快速、灵敏、简便的检测、试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测脑膜炎奈瑟氏菌仅需一台电脑和一台荧光定量PCR仪， 操作简单，检测成本较低。使用阳性和阴性对照品的目的是用于质控整个操作过程，以便得出准确的判断。 若含有脑膜炎奈瑟氏菌，则从结果中可以观察到与阳性对照品一样在35个循环以前起峰；若不含有脑膜炎奈瑟氏菌，则与阴性对照品一样不起峰。本发明一次检测试验所使用的实际盒中的试剂量为引物探针各0.5 μ 1，IOmM dNTPO. 5μ Ι,ΙΟΧ酶特异性反应缓冲液2. 5μ 1，5υ/μ 1耐热DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的体积在除去5 μ 1待测样品的量后用超纯水补足至25 μ 1。本发明中的耐热DNA聚合酶为rTaq聚合酶。上述的阳性对照品为已确定是脑膜炎奈瑟氏菌的样品，阴性对照品则为经实验室确定不是脑膜炎奈瑟氏菌的样品，如大肠杆菌。本荧光定量PCR试剂盒若用脑膜炎奈瑟氏菌的菌悬液进行荧光定量PCR反应，与经提取得到的DNA作为模板反应所得结果一致。敏感度和特异性无差别，这样，可省去模板 DNA的提取步骤，使操作方法得以简化。同时，相比常规微生物检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，因而节省了人力物力。本发明公开的对脑膜炎奈瑟氏菌(简称ITS)特异的寡核苷酸及其应用与现有技术相比，本发明具有如下优点(1)实用性强本发明所配制的荧光定量PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低，市场应用前景广。(2)准确性高本发明通过对脑膜炎奈瑟氏菌及奈瑟氏菌属内其他6个种的ITS克隆、测序并进行序列比对，找到脑膜炎奈瑟氏菌ITS的特异区，设计出引物及探针，能够直接将脑膜炎奈瑟氏菌和其近源菌种分开。本发明者对15株脑膜炎奈瑟氏菌的标准菌株、20株奈瑟氏菌属其他菌株以及6株近缘标准株进行了扩增，结果发现，本发明的检测方法的准确率高达 100%。(3)灵敏度高本发明提供的脑膜炎奈瑟氏菌检测试剂盒及其检测方法具有相当高的敏感性，检测精度高，可以检测到Ipg/μ 1的DNA模板。
图1为脑膜炎奈瑟氏菌种属间特异性的检测峰图，其中起峰的样品为脑膜炎奈瑟氏菌其中一株标准株，其他不起峰的样品为表2中所列各其他非脑膜炎奈瑟氏菌的菌株。图2为脑膜炎奈瑟氏菌种内保守性的检测峰图。其中不起峰者为阴性对照，其余为脑膜炎奈瑟氏菌各标准株。图3为荧光定量P CR试剂盒检测结果峰图，其中4条起峰带为脑膜炎奈瑟氏菌，其余两条未起峰带为非脑膜炎奈瑟氏菌的其他菌株。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件。实施例1 基因组的提取 使用血平板或巧克力平板37°C过夜培养脑膜炎奈瑟氏菌，收集细菌。用500ul 50mMTris-HCl (pH8. 0)和 1Oul 0. 4M EDTA 重悬细胞，37 °C 温育 20 分钟，然后加入 IOul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10% SDS, 50°C温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNaSe，65°C温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA 并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0. 4%的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2 通过PCR扩增脑膜炎奈瑟氏菌中的ITS以脑膜炎奈瑟氏菌的基因组为模板通过PCR扩增其ITS。首先根据ITS—端的 16SrRNA基因的保守区设计上游引物(5，-TGT ACA CAC CGC CCG TC-3，见序列表1)，再根据23S rRNA基因的保守区设计下游引物(5’_GGT ACT TAG ATG TTT CAG TTC-3’见序列表 1)。PCR反应程序如下在94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C 延伸1分钟，这样进行30个循环；最后，在72°C继续延伸5分钟，得到PCR产物，用0. 8 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并3管PCR产物，并用上海生工生物工程技术公司的UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物条带；实施例3 构建ITS克隆首先是连接产物的获得将PCR纯化产物与Promega公司的3 X 1O"3的pGEM-T-Easy载体于16°C连接24小时，总体积为IOy 1，其中有1μ 1的IOXbuffer和0. 5单位的T4DNA连接酶，得到连接产物。其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备大肠杆菌DH5 α感受态细胞。取一环大肠杆菌DH5 α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml 的LB培养基中，37°C 250rpm剧烈振荡培养到0D6000. 5左右，然后冰浴冷却20分钟，于 40C 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于 40C 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水IOOml吹散菌体，于4°C 4000rpm 离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，4°C 6000rpm离心10分钟，弃上清液， 最后沉淀用Iml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为60ul —管，-70°C保存。最后是电转化感受态细胞取2_3ul连接产物与60ul感受态大肠杆菌DH5 α混合后，转到Bio-Rad公司的 0. 2cm的电击杯中电击，电压为2. 5千伏，时间为5. O毫秒-6. O毫秒。电击后立即在杯中加入Iml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB 固体培养基上37°C倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB液体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群即为脑膜炎奈瑟氏菌的ITS克隆。
实施例4 对ITS克隆测序挑选有插入片段8个克隆由用ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段双向进行测序，从而获得含tRNA-IA基因的ITS的序列。实施例5 特异引物及探针的筛选针对脑膜炎奈瑟氏菌ITS的特异区设计引物及探针；在特异区设计上下游引物及探针(上游引物是5，-ACAAATCAAAACGGAAGAATGGA-3，，见序列SEQ ID NO 1 ；下游引物是 5，-TCAGCATTTTGTTCTTGGTCAAG-3，，见序列 SEQ ID NO :2，探针是 5，-CAGAATCCATTCAGGGCGACG(A)TCAC-3，，见序列 SEQ ID NO :3)。我们收集了 15 株脑膜炎奈瑟氏菌的标准菌株、20株奈瑟氏菌属其他菌株以及6株近缘标准株验证引物的特异性， 菌株编号和来源见表2。以这41个菌株的基因组为模板进行荧光定量PCR，体系为IOuM引物及探针 0. 5ul、25mM MgCl22. 5ul UO X buffer 2. 5ul、10mM dNTP 0. 5ul、5U/ulrTaq 聚合酶0. 3ul及5ul的待测样品模板到0. 2ml的8联薄壁PCR管中，最后用超纯水补足至25ul。 引物及探针在脑膜炎奈瑟氏菌标准株中得到阳性结果，其他菌株没有起峰，所以该寡核苷酸对脑膜炎奈瑟 氏菌及其ITS都是高度特异的，实验结果见图1及图2。所用引物序列见表 1，所用菌株见表2。表 权利要求
1.一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO :1_3所示的核苷酸序列或者其互补DNA或RNA序列；b)不同于a)但编码的氨基酸序列与a)所编码的RNA序列相同的核苷酸序列；c)上述a)或b)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
2.—种权利要求1所述的对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异核苷酸的分离方法包括下述步骤(1)基因组的提取；(2)通过PCR扩增脑膜炎奈瑟氏菌中的ITS基因簇；(3)构建ITS 克隆；(4)对ITS克隆测序；(5)核苷酸序列的拼接及分析；(6)特异引物和探针的筛选。
3.权利要求1所述的对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸作为引物和探针用于荧光定量PCR试剂盒或一般PCR试剂盒或作为探针用于杂交反应与荧光检测或用于制造基因芯片或微阵列以检测细菌方面的应用。
4.权利要求3所述的应用，其中的荧光定量PCR试剂盒，包括引物、探针、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶；所述的荧光定量PCR引物和探针包括1)SEQID NO :1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 所示的核苷酸序列；2)不同于1)但编码的氨基酸序列与1)所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；3)上述幻或幻中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列。
5.权利要求3所述的应用，其中的荧光定量PCR检测试剂盒包括如下试剂25mM MgCl250 μ 1 ；IOmM dNTP 10 μ 1 ；IOX酶特异性反应缓冲液50 μ 1 ;5U/ μ 1耐热DNA聚合酶 5 μ 1 ；引物和探针各10 μ 1 ；阳性对照品10 μ 1，阴性对照品10 μ 1 ；超纯水lml。
6.一种含有对脑膜炎奈瑟氏菌ITS特异的核苷酸的荧光定量PCR试剂盒在检测脑膜炎奈瑟氏菌中的应用。
7.—种检测脑膜炎奈瑟氏菌的荧光定量PCR检测方法包括以下步骤(1)提取待测临床样品模板；(2)在8联PCR薄壁管中加入dNTP、MgCl2、10X酶特异性反应缓冲液、rTaq聚合酶、引物、探针、待测样品模板和超纯水，混勻；(3)将8联薄壁PCR管中混勻的混合物在荧光定量PCR仪上扩增；(4)记录结果，分析并进行结果判断；其中上述步骤(1)中的临床样品模板为是临床样品中的脑脊液、血液或皮肤出血斑内容物或带菌者的鼻咽拭子标本粗提液或是脑膜炎奈瑟氏菌的纯培养物的粗提液或是纯 DNA，或者是阳性对照品和阴性对照品；上述步骤(3)中的荧光定量PCR仪上的反应循环参数包括DNA的变性、复性、延伸的温度和时间、循环次数，具体为前期为使变性能够达到所需温度而必需的前期处理过程的一个循环为95°C，2分钟；变性温度和时间为95°C，15秒；复性和延伸温度和时间为60°C，60秒；变性、复性、延伸的循环次数为40个循环；待反应结束后直接观察反应示意图即可得到检测结果。
全文摘要
本发明涉及一种对脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)中16S rRNA-23S rRNA基因间区(Internal transcribed spacer，简称ITS)特异的寡核苷酸SEQ ID NO1-SEQ ID NO3及其应用，并提供了一种用本发明的寡核苷酸为引物及探针的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法，利用该荧光定量PCR试剂盒对人体及环境中的脑膜炎奈瑟氏菌进行检测，简便快速、特异性好、灵敏度高，可用于食品和临床样品的监督和检测、食物中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，具有深远的社会效益和较大的经济效益。
文档编号C12Q1/68GK102154466SQ20111000482
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者何欣, 孙亚民, 曹勃阳, 王敏, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司