专利名称：一种对阪崎肠杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对阪崎肠杆菌0抗原基因簇特异的核苷酸及其应用，尤其涉及一种对阪崎肠杆菌0抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。
背景技术：
阪崎肠杆菌是人和动物的肠道寄生菌和条件致病菌，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁最大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎，死亡率可达40% 80%。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，阪崎肠杆菌已引起世界多国相关部门的重视，已被列为婴儿配方奶粉的A类致病菌。
目前阪崎肠杆菌的分类地位刚刚建立，其0抗原血清型的研究也逐渐成为热点。 脂多糖是革兰式阴性细菌的主要表面成分，包括类脂A，核心多糖和0抗原。0抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖分子的最外层结构，它是由多个寡糖重复单位组成的多糖链，重复单位一般由3 6个单糖组成。在大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌中，负责0抗原合成的基因相邻排列于两个持家基因galF和gnd之间，在染色体上形成一个基因簇。0抗原基因簇内部的基因通常分为三类单糖合成酶基因、糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因。单糖合成酶负责单糖前体的合成，糖基转移酶负责将单糖串联成寡糖重复单位，而寡塘单位处理酶负责将寡糖单位从内膜内侧转运到内膜外侧，并将寡糖单位进行串联。脂多糖特别是其中的0-抗原的组成和结构的变化决定了革兰氏阴性细菌细胞表面抗原决定簇的多样性，比如国际上根据脂多糖的结构特性而鉴定过沙门氏菌属的抗原类型多达2107个。血清分型是一种经典和常用的流行病学调查手段，对于临床研究及疫苗研制具有重要意义。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、 准确性差，不同的0抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为目前的发展方向。现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于阪崎肠杆菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、 灵敏、特异性强等优点。不同抗原的糖基转移酶和寡糖单位处理酶的序列同源性很低，具有高度的血清型特异性，可用作靶基因进行分子生物学鉴定。寡糖单位处理酶基因包括0抗原转运酶基因(wzx)和O抗原聚合酶基因(wzy)。利用上述两个基因作为血清型分型检测的特异靶基因 是十分理想的。如大肠杆菌(王威，彭霞，2006年)、变形杆菌和沙门氏菌均有利用该基因做特异检测的实例。聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。不论从国内和国际的角度来看，快速、准确地鉴定出血清类型，为阪崎肠杆菌的防控提供有效技术支持是十分重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对阪崎肠杆菌抗原特异的核苷酸，所述核苷酸包括DSEQ ID NO :1_15所示核苷酸中的至少一种；2)与SEQ ID NO :1_15所示核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。本发明进一步公开了核苷酸序列在制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒或基因芯片方面的应用。本发明还公开了一种快速检测临床标本的PCR试剂盒，该试剂盒包括PCR引物、 dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ ID NO 1_15所示的核苷酸中的至少一种。该试剂盒包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ IDNO 1-15所示的核苷酸中的至少一种；其中10 μ M引物各0.5 μ 1，IOmM dNTP 0. 5 μ 1，10 X酶特异性反应缓冲液2. 5μ l,5U/y 1耐热DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的体积在除去5 μ 1待测样品的量后用ddH20补足至25 μ 1。本发明公开的对阪崎肠杆菌0抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用与现有技术相比，具有如下优点(1)实用性强本发明提供血清分型检测所用到的特异引物，利用该PCR方法可以对临床标本进行检测。最终能够利用PCR的方法检测鉴别7个血清型。本发明所配制的PCR试剂盒等配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强， 易于产业化生产，而检测成本却相对较低。(2)准确性高本发明通过对阪崎肠杆菌的各血清型特异的基因wzx和wzy的PCR反应，每个样品得到一条目的条带，将得到目的片段与已知长度相比较，就可以得到阪崎肠杆菌所属的
血清型。(3)灵敏度高本发明提供的检测引物及阪崎肠杆菌检测试剂盒等具有较高的敏感性，检测精度高，可以检测到Ing/ μ 1的DNA模板。
图1表示Olwzy基因Pl和P2引物的筛选，目的条带为364bp，其余的血清型没有任何条带。图2表示02wzy基因P3和P4引物的筛选，目的条带为473bp，其余的血清型没有任何条带。图3表示03wzy基因P5和P6引物的筛选，目的条带为704bp，其余的血清型没有任何条带。图4表示04wzy基因P7和P8引物的筛选，目的条带为890bp，其余的血清型没有任何条带。图5表示05wzy基因P9和PlO引物的筛选，目的条带为235bp，其余的血清型没有任何条带。图6表示06wzx基因Pll和P12引物的筛选，目的条带为615bp，其余的血清型没有任何条带。图7表示07wzy基因P13和P14引物的筛选，目的条带为424bp，其余的血清型没有任何条带。图8表示种特异性的鉴定，其中检测了种间的四株细菌和其他种属四株细菌，均无任何条带。具体菌株信息见表2。图9表示PCR试剂盒应用分型结果，能够检测出相应0型的菌株并且非对应0型无条带。其中01、02、03、04、05、06、07和负对照(-)表示相应血清型引物扩增结果，最后 —^h^lcit^ 2000bp ladder marker。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件。实施例1 基因组的提取370C LB液体培养基培养阪崎肠杆菌，收集细菌，提取基因组具体步骤如下用500ul 50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)和 IOul 0. 4Μ EDTA 重悬细胞，37°C温育 20 分钟，然后加入IOul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶 K、15ul 10% SDS，50°C温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65°C温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA， 用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过 0. 4%的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2 序列破译(1)通过Long-PCR扩增阪崎肠杆菌的0抗原基因簇。根据Genbank中galF基因和O抗原基因簇之间的JumpStart设计上游引物为wl_10324，5，_GCACTGGTAGCTATTGAGCCA GGGGCGGTAGCAT-3，，再根据 gnd 基因设计下游引物为 wl_22115，-ACTGCCATACCGACGACGCCGA TCTGTTGCTTGG-3，(分别为 SEQ ID NO 15-16)。PCR反应程序如下在94°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，61°C退火30秒， 680C延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68°C继续延伸8分钟，得到PCR产物，用 0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并8管50μ1 long PCR产物， 并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。(2)构建0抗原基因簇文库用shot-gun法构建0抗原基因簇文库，反应体系是 600ngPCR纯化产物，经过核酸片段仪剪切成1 3kb片段、补平粘性术端、pUC18的载体连接(采用fastlink ligase)连接得到测序的基因文库。(3)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在Ikb以上的200个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到8 10倍的覆盖率，从而获得0抗原基因簇的所有序列。(4)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的 Stadenpackage软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orf finder发现基因，找到开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank 中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger 中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对， 最后得到阪崎肠杆菌的基因簇的序列。实施例3 引物设计及筛选根据基因簇破译情况，我们发现wzy和WZX基因确实是血清型特异的基因，所以选取该基因特异区段设计特异引物。由于wzy更加特异，所以主要以wzy基因为靶基因，但是因为有06血清型中不含该基因，所以该血清型以wzx为靶基因设计引物。引物设计是该发明的核心部分。设计引物根据文献中叙述的特异基因来设计。wzx 和wzy这两个基因是阪崎肠杆菌0抗原基因簇中比较特异的基因，可以作为血清型鉴定的靶基因。将上述基因导入Primer Premier 5进行引物设计，引物的长度最好在18 24bp 之间，Tm值在50 55°C。每个基因设计一对引物，有单一目的条带。引物设计之后在Genbank中进行BLAST，设计的引物不能与其它近缘细菌的序列相似性过高，这样就能确保该引物只在自己的预定位置进行扩增，而不与其它的近缘菌或者采集标本的环境中的近缘菌不产生阳性反应。这一点对于避免非特异条带的产生和实验的成败十分重要。设计出的引物如表1所示。表1用于PCR的引物序列
权利要求
1.一种对阪崎肠杆菌0抗原特异的核苷酸，其特征在于核苷酸包括1)SEQID NO :1-15所示核苷酸中的至少一种;2)与SEQID NO :1-15所示核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。
2.权利要求1所述核苷酸序列在制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒或基因芯片方面的应用。
3.—种PCR试剂盒，其特征在于该试剂盒包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物包括SEQ ID NO :1-15所示的核苷酸中的至少一种；其中10 μ M引物各0. 5 μ 1， IOmM dNTP 0. 5 μ 1，IOX酶特异性反应缓冲液2. 5 μ 1，5U/μ 1耐热DNA聚合酶0. 3 μ 1，25mM MgCl22. 5 μ 1，余下的体积在除去5 μ 1待测样品的量后用ddH20补足至25 μ 1。
全文摘要
本发明涉及一种对阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)O抗原特异的核苷酸及其应用，所述核苷酸包括1)SEQ ID NO1-14所示的核苷酸中的至少一种；2)与SEQ ID NO1-14所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种。这些核苷酸可用于制备检测阪崎肠杆菌用PCR试剂盒和基因芯片。本发明的对阪崎肠杆菌O抗原特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒、基因芯片实用性强，PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却相对较低；准确性高；灵敏度高。
文档编号C12Q1/10GK102154270SQ201110004830
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者何欣, 孙亚民, 曹勃阳, 王敏, 王磊 申请人:天津生物芯片技术有限责任公司