应用gca稳定转染细胞系测定bnp活性的制作方法

文档序号:393591阅读:215来源:国知局
专利名称:应用gca稳定转染细胞系测定bnp活性的制作方法
技术领域
本发明涉及生物药物活性检测领域,针对脑利钠肽(BNP)的活性测定建立了更加快速、准确的定量方法。
背景技术
BNP目前的活性测定方法为离体动脉条法,通过记录BNP作用下动脉张力的变化来进行测定其活性。这种方法不仅操作繁琐,而且误差比较大。而基于细胞系的体外活性测定方法操作简便,误差较小,正越来越广泛的应用于生物药物的活性检测。因此,我们希望可以建立一种基于细胞系的活性测定方法。考虑到没有合适的细胞系来进行BNP的活性测定,我们首先通过转基因构建BNP受体(GCA)超表达的稳定细胞株,再建立竞争ELISA法来进行活性检测。GCA是BNP的主要受体,它是一种腺苷酸环化酶前体,被BNP激活后,催化 GTP产生cGMP,继而发挥生物学效应。本方法的原理是通过检测cGMP的含量变化来对BNP 活性进行定量。

发明内容
1.发明目的目前,BNP的活性测定方法,误差大,操作繁琐,我们需要建立一种更加快速,简便, 准确客观的定量方法,对于该产品的研究开发,质量控制乃至临床应用都具有重要意义。2.技术方案本发明首先通过基因转染筛选一种BNP强反应性的稳定细胞系,再建立相应的检测方法来对BNP活性进行定量。其技术流程为J93GCAC3细胞株的建立(GCA稳定表达的单克隆细胞株)一测定方法建立(竞争ELISA)。3.有益效果该检测方法的建立有利于脑利钠肽产品的研究开发,质量控制和临床应用,具有较高的应用价值。通过与现有的离体动脉条法比较,有如下优点(1)从伦理学角度,不需要动物实验;(2)操作简便,不需要进行组织分离等操作;(3)周期短,可以在48小时内完成全部实验;(4)结果较客观可靠,准确度高,变异小。


图1-1293瞬时转染NPR1/GCA前后的BNP反应性比较Samplel 转染 NPR1/GCA 前的 293 细胞Sample2 转染 NPR1/GCA 后的 293 细胞图1-2^3GCA多克隆稳定细胞株的BNP反应性
图1-3-1四个^3GCA单克隆细胞株与多克隆细胞株的BNP反应性比较Samplel :293GCA 多克隆细胞株;Sample2 :293GCA Clone 1Sample3 :293GCA Clone 2Sample4 :293GCA Clone 3Sample4 :293GCA Clone 4图 l-3_2western blot 检测 ^3GCAC3 的 GCA 表达情况A =GCA 抗体 B =DDK 抗体图2-1不同稀释度HRP-cGMP (50ul细胞上清+50ulHRP_cGMP)的实验结果Sample2 1 10000Sample3 1 5000Samp le4 1 1000Sample5 1 500图2_2cGMP—抗分别以1 5000和1 2500包被酶标板的实验结果比较Samplel :cGMP —抗 1 2500 包被Sample2 :cGMP —抗 1 5000 包被图2-3不同细胞密度的实验结果比较Samplel :0. 9X IO4 个细胞 / 孔Sample2 :1·8Χ104 个细胞 / 孑LSample3 :2. 7Χ104 个细胞 / 孑L图2-4不同体积的细胞上清与50ulHRP_cGMP(l 1000稀释)的实验结果Samplel 细胞上清 50ul Sample2 细胞上清 40ulSample3 细胞上清 30ul Sample4 细胞上清 20ul
图2-5三次标定BNP参考品的结果图3NPR1/GCA载体图谱SgfI和MluI两个酶切位点间插入NPR1/GCA cDNA序列。
具体实施例方式1.材料与方法1. 1研究对象B型脑利钠肽(BNP)1. 2NPR1/GCA质粒基因ID为匪000906,购买于傲锐东源基因有限公司,载体图谱见图3。HEK293细胞中国食品与药品研究检定院细胞室保存。BNP参考品中国食品与药品研究检定院重组技术产品室制备。1. 3 试剂生长培养基DMEM(GIBC0,#11995)+10% 胎牛血清(GIBC0,#10099)+1 % 双抗 (GIBC0, #15240)平板培养基:DMEM(GIBC0,#11995)脂质体2000 invitrogen, #11668
G418 =CalBiochem, #345810G418选择培养基生长培养基+200ug/ml G418BNP稀释液PBS+0. 2%BSA(Merck Calbiochem, #12659)+ImM IBMX (sigma,15879, 临用前加入)cGMP 检测试剂盒cell signaling,#4360ScGMP 一抗=Abcam, ab836一抗包被液碳酸钠0. 32g,碳酸氢钠0. 586g,定容至200ml,PH9. 6HRP-cGMP =Genscript, MO1058HRP-cGMP 稀释液PBS+0. 01% BSA洗液PBS+1%Tween-20TMD Amresco, J644TMD终止液2M硫酸NPR1/GCA 抗体Santa cruz, sc-137041DDK 抗体0riGene,TA5OOll1. 4 仪器酶标仪,Molecular Devices1. 5数据分析软件SoftMax Pro软件,四参数方程1. 6实验流程1. 6. 1293GCA稳定细胞系构建1.6. 1. 1瞬时转染及检测(1)提前16_24h,6孔板铺293细胞,使转染时密度达90%左右;(2)脂质体2000常规转染NPR1/GCA质粒;(3)转染后48h,消化计数,平板培养基重悬,调整细胞浓度至1 X 105/ML, ISOul/ 孔接种至96孔板内,同时将未转染的HEK293以同样的细胞密度接种至96孔板内,共同培养 16-18h ;(4)取1支BNP参考品,用ImlBNP稀释液溶解后,预稀释5倍,再进行4X倍比稀释,20ul/孔加入细胞培养板中;(5)作用90分钟后,取细胞上清50ul按照cGMP检测试剂盒说明书中的步骤检测 cGMP含量变化,结果见图1-1。1. 6. 1. 2稳定转染及多克隆细胞检测(1)转染步骤同瞬时转染;(2)转染后48h,更换G418选择培养基,筛选3周左右,每3_4天更换一次G418选
择培养基;(3)待克隆长出后,挑出6个单克隆分别培养,剩余细胞传代,按1. 6. 1. 1种检测方法进行检测,结果见图1-2。1. 6. 1. 3单克隆细胞培养及检测(1)6个单克隆细胞株培养2周左右,其中4个成为稳定克隆。(2)对4个单克隆细胞株的BNP反应性进行检测,结果见图1_3_1 ;
(3)经比较3号克隆的反应性较好,分别用GCA抗体和标签(DDK)抗体对其进行 western blot检测,结果见图1-3-2。1. 6. 2BNP活性测定方法建立1. 6. 2. 1比较使用不同稀释度HRP-cGMP的实验结果(见图2_1)。以cGMP —抗1 5000包被酶标板,取细胞上清50ul与HRP-cGMP工作液50ul, HRP-cGMP工作液共设置4个不同的稀释度,分别为1 10000,1 5000,1 1000,1 500。 初步确定为在HRP-cGMP 1 1000稀释度下,结果较好;1. 6. 2. 2比较cGMP —抗以1 5000和1 2500包被酶标板的实验结果(见图 2-2)。使用HRP-cGMP 1 1000稀释度,取细胞上清50ul与HRP-cGMP工作液50ul,分别以cGMP —抗1 5000和1 2500包被酶标板。初步确定为cGMP—抗以1 2500包被酶标板,结果较好;1. 6. 2. 3比较不同细胞密度的实验结果(见图2-3)。以cGMP—抗1 2500包被酶标板,使用HRP-cGMP 1 1000稀释度,分别铺细胞 0.9 X IO4个细胞/孔,1. 8 X IO4个细胞/孔,2. 7 X IO4个细胞/孔。初步确定为铺细胞1. 8 X IO4个细胞/孔,结果较好;1. 6. 2. 4根据多次试验,初步确定标准检测方法步骤如下(1)第一天,取对数生长期的^3GCAC3细胞,消化离心,用DMEM重悬后,计数,调整细胞浓度至1 X 105/ml,180ul/孔,接种至96孔板内,培养16_18h ;用一抗包被液按1 2500稀释cGMP—抗,IOOul/孔加入酶标板,4度包被过夜;(2)第二天,用BNP稀释液对BNP参考品进行倍比稀释(预稀释20倍,4X倍比稀释),20ul/孔加入细胞板中,放入培养箱内孵育1. 5h ;(3)倒掉酶标板中的包被液,用洗液200ul/孔,清洗3次;配制HRP-cGMP 工作液用 HRP-cGMP 稀释液按 1 1000 稀释 HRP-cGMP ;取细胞上清和HRP-cGMP工作液各50ul同时加入包被好的酶标板中,室温摇晃 3h ;(4)倒掉酶标板中的液体,用洗液200ul/孔,清洗4次;(5)加入TMD IOOul/孔,反应约IOmin ;加入终止液IOOul/孔;(6)酶标仪450nm波长测定,数据分析。1.6.2.5使用上述标准检测方法,对BNP参考品进行标定3次,每次3支,结果见图2_4_1, 2-4-2,2-4-3。2.结果与讨论2. 1瞬时转染质粒NPR1/GCA,并检测转染前后293细胞对BNP的反应性。使用的是cGMP检测试剂盒,检测不同浓度的BNP作用后,细胞所分泌的cGMP含量变化,结果发现转染后的细胞对BNP有良好的反应性,细胞上清中的cGMP含量与BNP作用浓度的关系符合四参数方程,且线性较好,而转染前的293细胞细胞上清中的cGMP含量较低,且与BNP作用浓度基本无关(见图1-1)。2. 2293细胞转染质粒NPR1/GCA后,经G418筛选获得稳定细胞株,对BNP反应良好
6(见图1-2)。但是信噪比明显比瞬时转染的细胞低。分析其原因,认为稳定细胞株的基础 cGMP含量就较高,由于使用的竞争ELISA,导致低浓度BNP作用时,HRP-Cgmp结合量减少, 即上限降低。2. 3挑选6个单克隆分别培养,有四个长成稳定细胞株,检测其对BNP反应性,结果见图1-3-1。1号和2号基本无反应性,3号较4号反应性较强。于是选择3号克隆^3GCAC3 作为建系细胞株。Western blot方法检测了其外源GCA的表达(见图1-3-2),无论用GCA 抗体还是标签抗体,293GCAC3均显著高于293细胞。2. 4检测方法的确定2. 4. 1首先根据cGMP —抗说明书的推荐剂量,以1 5000包被酶标板,来确定 HRP-cGMP工作液的最佳稀释度。从实验结果看出1 10000和1 5000信噪比很低,而 1 1000和1 500结果明显好些,但是考虑到成本问题,初步确定为使用1 1000的稀
释度;2. 4. 2由于实验结果值总体偏低,考虑提高cGMP —抗的包被浓度,经过比较 1 5000和1 2500包被酶标板的结果,发现以1 2500包被酶标板,实验结果值均有所
升高;2. 4. 3通过比较不同细胞密度的检测结果,均具有比较好的线性关系,但是 1.8 X IO4个细胞/孔信噪比较好,且之前的实验都是按照此密度铺细胞,因此初步确定仍用此密度:1.8 X IO4个细胞/孔。2. 4. 4通过条件选择和优化,初步确定了标准检测方案cGMP —抗包被浓度为 1 2500,HRP-cGMP工作液为1 1000稀释,细胞铺板密度为1. 8 X IO4个细胞/孔。2. 4. 5使用标准检测方法,对BNP参考品进行标定3次,每次3支,ED50值见下表 (结果见图 2-4-1,2-4-2,2-4-3)
权利要求
1.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的方法,其特征在于根据 BNP及其受体的作用机制,构建BNP反应性转基因细胞株。
2.根据权利要求1的转基因细胞株,其特征在于转染了NPR1/GCA质粒(基因ID为 NM_000906,购买于傲锐东源基因有限公司),通过加压筛选,获得BNP受体GCA超表达的稳定细胞株,并用于BNP活性检测。
3.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的方法,其特征在于通过检测BNP刺激下cGMP含量变化对BNP活性进行定量。
4.根据权利要求3的技术方案,其特征在于,(i)铺细胞板时要用无血清的DMEM; (ii) BNP稀释液为0. 2% BSA-PBS+lmM IBMX(临用前加入);(iii)检测的是BNP作用90分钟 cGMP的含量变化。
5.一种应用转基因细胞株来检测脑利钠肽(BNP)生物活性的方法,其特征在于通过建立竞争ELISA法来检测cGMP含量。
6.根据权利要求5的技术方案,其特征在于,(i)cGMP—抗的包被浓度为1 2500稀释;(ii)HRP-cGMP工作液的稀释度为1 1000,稀释液为0. 01% BSA-PBS0
全文摘要
本发明“应用GCA稳定转染细胞系测定BNP活性”,建立了一种新的脑利钠肽(BNP)生物活性测定方法。GCA是BNP的主要受体,它是一种腺苷酸环化酶前体,被BNP激活后,催化GTP产生cGMP,继而发挥生物学效应。野生293细胞GCA表达水平低,对于BNP反应性弱,本方法是转基因构建BNP受体(GCA)超表达的稳定细胞株293GCAC3,通过检测BNP刺激后293GCAC3分泌到细胞上清中的cGMP的含量变化,来对BNP活性进行定量。具体检测步骤为细胞铺96孔板,培养16-18小时,加入BNP刺激90分钟,吸取细胞上清用竞争ELISA检测cGMP含量。该方法操作简单,反应灵敏,变异性小,对于BNP的质量控制和临床应用具有重要意义。
文档编号C12Q1/02GK102174636SQ20111000455
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者于雷, 史新昌, 王军志, 饶春明, 高凯 申请人:中国食品药品检定研究院
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