专利名称：一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌pcr快速特异性检测方法
技术领域：
本发明涉及食品工业的一种检测方法，特别涉及一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌 PCR快速特异性检测方法。
背景技术：
脂环酸芽孢杆菌于1967年由日本学者首次报道，该属细菌嗜热耐酸，生存能力独 特，可经受酸性条件下的巴氏杀菌过程而存活，污染果汁及果汁饮料后，发生平盖酸败，污 染初期果汁在外观上并无明显变化，一旦条件适宜，该属细菌迅速生长繁殖，产生愈创木酚 和卤酚等不良风味物质，导致果汁产品香气损失、口感变差、浊度升高、形成沉淀，在保质期 内就发生果汁品质劣变，给果汁业带来了巨大的经济损失，是果汁生产厂家比较棘手的常 见污染菌。由于该属细菌严格嗜酸，在pH7. 0条件下不能生长，因此，常规细菌总数检验法导 致该菌漏检。Mickey等通过脂环酸芽孢杆菌的形态特征(G+、产芽孢、白色、圆形菌落)、生 长温度范围等生理生化指标，对1575个柑橘进行脂环酸芽孢杆菌检测，结果在591个柑橘 中检测出该菌。目前，对该菌的检验仍以这种传统检测法为主。由于传统检测法存在指标 多、程序繁琐、耗时、检测结果滞后等缺点，不能及时向生产线反馈信息以采取相应的防范、 控制措施。因此，果汁业急需为其提供一种从原料到产品全程跟踪的快速、特异性的检测方 法，以及时指导生产实践。近年来，PCR检测方法由于其特异性高，检测时间相对缩短等特点而广泛应用于果 汁中脂环酸芽孢杆菌的鉴定和检测。Cormor等应用Reatime PCR方法，能够较快速、特异地 检测出脂环酸芽孢杆菌及一些与它亲缘关系较近的嗜酸菌，并且从理论上计算，可以检测 出细胞数<100的脂环酸芽孢杆菌。国内也有学者建立耐热菌的PCR及QC-PCR快速检测方法，整个检测时间为4h 5h，比传统时间的4d 5d大大缩短，但由于这些方法均不能突破常规的DNA提取，需要提 供一定量的菌体，因此不能逾越该菌的分离及富集培养，所需检测时间仍较长，而且所用仪 器设备及试剂昂贵，与应用于生产实践仍有一定差距。因此，探索真正的快速，特异，定量的 PCR检测方法仍然任重而道远。
发明内容
针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种苹果汁中脂 环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，用于苹果汁生产的在线检测。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案
一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，其特征在于，具体按下列步 骤进行
1)取Iml果汁菌悬液，经lOOOOr/min离心2min，弃上清，加50ul双蒸馏水重悬；
2)重悬后的菌体经微波1000W处理60s，5000r/min离心lmin，取上清，得到模板DNA；3)设计一对SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；
4)将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增；
5)1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得到检测结果。本发明利用微波技术裂解微生物细胞壁，变性蛋白，并通过离心去除蛋白干扰，突 破了常规的微生物DNA提取，仅花费aiiin即可直接从苹果汁样品中获得符合PCR扩增要求 的模板，使整个检测过程由过去的至少4 减少为池内即可完成，检测限为<100CFU/ml，特 异，快速，成本低廉，可以用于苹果汁生产的在线检测。
图1是微波不同处理时间提取DNA的PCR扩增效果电泳图； 图2是SHC引物特异性检测电泳图3是扩增电泳图。以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式本发明使用微波直接从果汁样品中提取DNA，根据GenBank中提供的 Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922τ 的鲨烯环化酶(She)基因序列设计一对 特异性引物，分别对引物特异性、微波提取DNA的扩增效果及检测灵敏度进行了研究，经验 证，其检测时间缩短，检测成本降低，能够实现苹果汁生产的在线检测。具体按下列步骤进行
1)取Iml果汁菌悬液，经lOOOOr/min离心2min，弃上清，加50ul双蒸馏水重悬；
2)重悬后的菌体经微波1000W处理60s，5000r/min离心lmin，取上清，得到模板DNA；
3)设计一对SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；
4)将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增；
5)1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得到检测结果。上述PCR扩增的每个体系含2 μ 1模板DNA，2 μ IDNTP, 2. 5 μ 1 10倍buffer， 10 μ mol · Γ1的引物JLX-F和引物JLX-R各1. 5 μ 1，以及0. 2 μ 1的rTaq DNA聚合酶 5U· μ Γ1, PCR扩增条件为94°C预热％iin，然后进行30个循环，94°C解链45s，55°C退火 45s，72°C延伸lmin，循环结束后，最后72°C延伸lOmin。以下是具体的相关实验
(一)微波提取DNA的模板质量及扩增效果 1、微波处理时间对DNA质量及扩增效果的影响 表1微波处理时间对DNA质量的影响
权利要求
1.一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，其特征在于，具体按下列 步骤进行1)取Iml果汁菌悬液，经lOOOOr/min离心2min，弃上清，加50ul双蒸馏水重悬；2)重悬后的菌体经微波1000W处理60s，5000r/min离心lmin，取上清，得到模板DNA；3)设计一对SHC引物JLX-F和JLX-R，其中 引物 JLX-F 5' -CGGCACCTGGTCCATTTATC-3' 引物 JLX-R 5' -TCGAGCCCTTCAAACCCTTT-3'；4)将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增；5)1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系含2μ1模板DNA， 2 μ 1DNTP，2. 5μ 1 10 倍 buffer，10 μ mo 1 · Γ1 的引物 JLX-F 和引物 JLX-R 各 1. 5 μ 1，以及 0. 2 μ 1的rTaq DNA聚合酶5U · μ Γ1, PCR扩增条件为94°C预热％iin，然后进行30个循 环，94°C解链45s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循环结束后，最后72°C延伸lOmin。
全文摘要
本发明公开了一种苹果汁中脂环酸芽孢杆菌PCR快速特异性检测方法，该方法使用微波直接从果汁样品中提取DNA，根据GenBank中提供的AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM3922T的鲨烯环化酶(Shc)基因序列设计了一对特异性引物，将模板DNA、引物JLX-F和引物JLX-R构成25ul体系进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测在648bp处获得目的条带，即得检测结果。并分别对引物特异性、微波提取DNA的扩增效果及检测灵敏度进行了研究，验证，其检测时间缩短，检测成本降低，能够实现从苹果汁生产的在线检测。
文档编号C12Q1/04GK102134608SQ201110004200
公开日2011年7月27日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者樊明涛, 焦凌霞 申请人:西北农林科技大学