专利名称：一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及华支睾吸虫的检测方法，特别是一种快速检 测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒。
背景技术：
华支睾吸虫病(Clonorchiasis sinensis)又称肝吸虫病，是由华支睾吸虫寄生在 人的肝胆管内所引起的肝胆病变为主的一种食源性人兽共患寄生虫病。曾在中国、日本、韩 国、菲律宾、新加坡和马来西亚、俄罗斯等国有华支睾吸虫感染的报道。近年来，由于食物的 多样化和国外饮食习惯的引入，本病在我国的感染率逐步增高，人群感人率从1 30%不 等。根据全国首次寄生虫病调查表明，全国感染率平均为0. 356%,以此推算，全国大约有 470万感染者。其主要原因是食生鱼的习惯所致。据1988年的调查资料表明，黑龙江佳木 斯地区的麦穗鱼感染率也为100% ；台湾省日月潭地区，麦穗鱼、克氏鲦鱼感染华支睾吸虫 囊蚴的感染率高达100%。华支睾吸虫囊蚴主要分布在鱼体的各个部分，如肌肉、头、皮、鳍 及鳞等，一般以鱼肉及鱼头肉最多。除淡水鱼外，淡水虾，如细足米虾(Caridina nilotica gracilipes)、巨掌沼虾(Macrobrachium superbum)等也有囊蚴寄生，因此，水产品、特别是 淡水鱼中囊蚴的检测已经成为食品安全的首要问题。华支睾吸虫囊蚴呈椭圆形(如图1所示)，大小92μπι ΙΙΟμ ΧΙΟΟμπι
140 μ m,囊壁分两层，外壁较厚，内壁较薄。囊内有一幼虫，幼虫具口、腹吸盘、肠管和含黑色 钙质颗粒的排泄囊。当人体感染华支睾吸虫囊蚴后，可引起机体消化不良、腹泻、腹痛、肝剧痛、肝肿 大、消瘦、侏儒症。在患者晚期可并发阻塞性黄疸、胆绞痛、胆管炎、胆囊炎及原发性胆管性 肝癌。吸虫囊蚴直接威胁着人民的饮食安全，因此，需要一种快速、敏感、简单的检测淡水鱼 中华支睾吸虫囊蚴方法尤显十分迫切和必须。FTA技术包含一种包埋在过滤基质中的蛋白质变性剂、螯合剂和自由基捕捉剂的 特殊干燥化学试剂混合物。它对人无毒，用FTA技术收集的核酸可以在室温和高湿度环境 下保存多年而不降解。FTA卡的工作原理是样品中感染性病原体在接触FTA时裂解失活，病 原体中的核酸则被固定下来。通过简单的一步，从卡上纯化洗脱下来DNA就可以应用于下 游扩增实验。FTA技术具有①节省低温运输样品以及保存样品的低温冰箱的成本。②使有 机体快速失活，避免了操作过程中样品污染的风险。③处理样品、分离得到DNA仅需15-30 分钟，缩短、减少分离的步骤(4-16小时)。④样品处理只需一个简单的洗脱DNA的过程，省 去了使用纯化试剂盒的花费。⑤样品需求量最小化(每个样品采集区12-40 μ 1)因此，已 广泛的用于病毒、微生物、寄生虫等生物DNA的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂 盒，所述的这种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法及其试剂盒要解决现有技术中检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法复杂而且灵敏度不高的技术问题。本发明提供了一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，包括一个对离体的 淡水鱼样品处理的步骤、一个提取样品DNA的步骤、一个对样品的DNA进行PCR扩增的步骤 和一个对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤；在所述的对离体的淡水鱼样品处理的步骤 中，将待检测的样品加入缓冲液玻璃株勻浆打碎，然后吸取勻浆液滴在FTA卡上；在所述的 提取样品DNA的步骤中，将FTA卡自然干燥，然后将FTA卡用FTA卡洗液洗涤；在所述的对 样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将洗涤后的FTA卡晾干后放入PCR反应管中进行PCR 扩增，扩增采用的上游引物为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物为GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然后对扩增的产物进行电泳并观察。进一步的，还包括一个对阳性的对照品进行DNA提取和PCR扩增的步骤，所述的阳 性的对照品为华支睾吸虫成虫或者囊蚴。进一步的，在所述的对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤中，将待检测的样品 的电泳条带和阳性对照的电泳条带进行比较，如果扩增产物的长度为3Mbp，则表示样品中 含有华支睾吸虫囊蚴，反之，则表示样品中不含有华支睾吸虫囊蚴。进一步的，在所述的对样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将FTA卡裁剪后放入 PCR反应管中进行PCR扩增。进一步的，所述的FTA卡洗液为由Tri s-HCl和EDTA组成的水溶液，所述的 Tris-HCl在FTA卡洗液中的浓度为0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的浓度为 0. lmmol/L, pH 为 8. 0。进一步的，所述的PCR扩增的反应体系为2XTaq PCR Master Mix50 μ L, 1 % BSA 4 μ L, 10 μ mol/L上游引物和下游引物分别为3 μ L，ddH2040 μ L。进一步的，PCR反应条件是94°C预变性:3min ；94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C 延伸Imin, 40个循环；72°C延伸IOmin0本发明还提供了一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的试剂盒，所述的试剂盒 含有检测引物CSl和检测引物CS2，所述的CSl的序列为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列为 GGAAAGTTAAGCACCGACC。进一步的，还含有阳性对照品，所述的阳性对照品为华支睾吸虫成虫或者囊蚴的样品。进一步的，所述的试剂盒中还含有PCR反应液，本发明的工作原理是本发明首先采用FTA法快速的提取待检测样品中的DNAJf 提取的DNA PCR扩增，然后将阳性对照品和待检测样品的扩增产物进行电泳，观察电泳的长 度，如果扩增产物的长度为3Kbp，则表示样品中含有华支睾吸虫囊蚴，反之，则表示样品中 不含有华支睾吸虫囊蚴。本发明和现有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明提供了快速检测淡水鱼 中华支睾吸虫囊蚴方法，用本发明的方法能检测到每g淡水鱼中1个吸虫囊蚴，定量PCR技 术能区分淡水鱼中3种不同的囊蚴，具有简便、快速且敏感性高的优点，适宜食品安全、海 关防疫检验。
图1是华支睾吸虫囊蚴就剖镜下囊蚴形态鉴定图。图2是本发明的一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法的流程图。④「图3是淡水鱼中检测华支睾吸虫囊蚴的电泳比较图。图中“1”表示1克样品 中含ι个华支睾囊蚴，“3”表示1克样品中含3个华支睾囊蚴，依次类推。
具体实施例方式本发明采用的试剂为FTA卡(Whatman公司)；FTA卡洗液TE buffer :0. Olmol/ L Tris-HCl, pH 8. 0 ；0. lmmol/L EDTA, (Whatman 公司)；TAE 电泳缓冲液(购自上海生 工生物制品有限公司)(储备液50X):扑化碱对28、冰醋酸57. lmL、0.5mol/L EDTA(pH 8. 0) lOOmL，用蒸馏水定容至1，OOOmL，混勻，室温保存，使用时取2mL 50 X TAE电泳缓冲液， 稀释为200mL工作液(0. 5X)即可。水PCR用水符合GB/T 6682中一级水的规格并用DEPC 水处理；2XTaq PCR Master Mix(含有 0. IU Taq 聚合酶/L、500mol/L dNTPeach、20mmol/ L Tris-HCl (pH8. 3) UOOmmol/L KCl、3mmol/L MgCL2、其它稳定剂和增强剂，(购自上海生 工生物制品有限公司)；marker2000(takara公司)；0. lmmol/L EDTA (pH 8.0)(购自上海生 工生物制品有限公司)。实施例本发明的一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法1.鱼肉样品DNA的提取将鱼去鲮后，取背、尾鳍部肌肉，称取鱼肉1克，再加入PH 8. 0缓冲液(0. lmmol/L EDTA)用细玻璃珠勻浆打碎，吸取勻浆液20 μ L滴在FTA卡上，自然干燥(或56°C 5min)后 直接提取DNA，用打孔机打孔制的一张直径6mm的滤膜片，用FTA卡洗液洗3次，每次5min， 凉干后剪碎滤纸片于PCR反应管中，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。2. PCR检测步骤PCR扩增总体积为100 μ L0反应体系为DNA模板剪碎(制好的直径6mmFTA滤 膜片一片)，2XTaq PCR Master Mix 50 μ L ； 1 % BSA 4 μ L ;10 μ mol/L 弓|物各 3 μ L ;ddH20 40 μ L，扩增采用的上游引物为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物为GGAAAGTTAAGCACCGACC。反应条件94°C预变性:3min；94°C变性 lmin，62°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，40 个 循环；72°C延伸IOmin。3.电泳扩增产物长度分别为3Kbp。琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有特征条带(采 用溴化乙锭显色)。如果扩增产物的长度为3Kbp，则表示样品中含有华支睾吸虫囊蚴，反之，则表示 样品中不含有华支睾吸虫囊蚴。(如图3所示)实施例2传统的试剂盒法试剂盒法主要步骤是1.将超净台酒精消毒，紫外灭菌；镊子和剪刀灭菌；取灭菌1. 5ml离心管，加入虫 体(或囊蚴)，反复用单蒸水充分水洗，最后将洗液弃去。2.预先调好恒温器55摄氏度；样品管加入=Nuclei lysis solution 200微升; 0.5M EDTA (PH8. 0 50 微升；Proteinase K U0mg/ml) 20 微升；RNase A Solution (4mg/ml)5微升。3.放入55摄氏度加热16-18小时，加入250微升lysis Buffer，漩涡震荡，马上 移入minicolumns中(预先准备好)。4. 13000转，离心，3分钟30秒，倒掉收集管中的液体，将柱子重新放回收集管。5.加入 650 微升 wizard SV wash solution, 13000 转离心 1 分 40 秒，弃去废液， 13000转离心，2分30秒。6.将柱子移入新的1. 5ml离心管，加入30微升Nuclease-Free Water,室温放2 分钟。7. 13000转离心1分钟30秒，离心后加入30微升Nuclease-Free Water,室温放 2分钟。8.再离心13000转，2分30秒，去掉微型柱，离心管内液体为所需的DNA。9.然后进行扩增和电泳，如果扩增产物的长度为3Kbp，则表示样品中含有华支 睾吸虫囊蚴，反之，则表示样品中不含有华支睾吸虫囊蚴(如图3所示)。由图3可知，试剂盒法和FTA法的结果是一致的，但是传统的试剂盒法处理样品、 分离得到DNA时间比较长，而且步骤繁琐，花费也比较高。
权利要求
1.一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，包括一个对离体的淡水鱼样品处 理的步骤、一个提取样品DNA的步骤、一个对样品的DNA进行PCR扩增的步骤和一个对PCR 扩增的产物进行电泳观察的步骤；其特征在于在所述的对离体的淡水鱼样品处理的步骤 中，将待检测的样品加入缓冲液用玻璃株勻浆打碎，然后吸取勻浆液滴在FTA卡上，在所述 的提取样品DNA的步骤中，将FTA卡自然干燥，然后将FTA卡用FTA卡洗液洗涤，在所述的 对样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将洗涤后的FTA卡晾干后放入PCR反应管中进行PCR 扩增，扩增采用的上游引物为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，下游引物为GGAAAGTTAAGCACCGACC， 然后对扩增的产物进行电泳并观察。
2.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于还包 括一个对阳性的对照品进行DNA提取和PCR扩增的步骤，所述的阳性的对照品为华支睾吸 虫成虫或者囊蚴。
3.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于在所 述的对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤中，将待检测的样品的电泳条带和阳性对照的 电 泳条带进行比较，如果扩增产物的长度为3Mbp，则表示样品中含有华支睾吸虫囊蚴，反 之，则表示样品中不含有华支睾吸虫囊蚴。
4.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于在所 述的对样品的DNA进行PCR扩增的步骤中，将FTA卡裁剪后放入PCR反应管中进行PCR扩 增。
5.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于所述 的FTA卡洗液为由Tris-HCl和EDTA组成的水溶液，所述的Tris-HCl在FTA卡洗液中的浓 度为0. 01mol/L,所述的EDTA在FTA卡洗液中的浓度为0. lmmol/L, pH为8. 0。
6.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于所述 的 PCR 扩增的反应体系为 JXiTaq PCR Master Mix 50μ L, 1% BSA 4 μ L，10 μ mol/L 上游 引物和下游引物分别为3 μ L，ddH20 40 μ L。
7.如权利要求1所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，其特征在于PCR反 应条件是94°C预变性:3min ；94°C变性lmin，62°C退火lmin，72°C延伸Imin，40个循环；72°C 延伸lOmin。
8.一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中含 有检测引物CSl和检测引物CS2，所述的CSl的序列为CGAGGGTCGGCTTATAAAC，所述的CS2 的序列为 GGAAAGTTAAGCACCGACC。
9.如权利要求8所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的试剂盒，其特征在于还 含有阳性对照品，所述的阳性对照品为华支睾吸虫成虫或者囊蚴的样品。
10.如权利要求8所述的快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的试剂盒，其特征在于所 述的试剂盒中还含有PCR反应液。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的方法，包括一个对离体的淡水鱼样品处理的步骤；一个提取样品DNA的步骤；一个对样品的DNA进行PCR扩增的步骤；一个对PCR扩增的产物进行电泳观察的步骤；在一个对淡水鱼样品处理的步骤中，将待检测的样品加入缓冲液匀浆用玻璃珠打碎，然后吸取匀浆液滴在FTA卡上；在一个提取样品DNA的步骤中，将FTA卡自然干燥，然后将FTA卡用PTA卡洗液洗涤。本发明还提供了一种快速检测淡水鱼中华支睾吸虫囊蚴的试剂盒，用本发明的方法能检测到每g淡水鱼中1个吸虫囊蚴，定量PCR技术能区分淡水鱼中3种不同的囊蚴，具有简便、快速且敏感性高的优点，适宜食品安全、海关防疫检验。
文档编号C12Q1/68GK102146446SQ20111000477
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者张永年, 李树清, 艾琳, 陈家旭, 陈韶红 申请人:中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所