专利名称：水稻干旱诱导型启动子oxhs4p的鉴定和利用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种植物逆境特异诱导型启动子的分离鉴定和应用。通过分离和鉴定一个水稻根中干旱诱导型基因的启动子，可以将其应用于植物的基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。
背景技术：
随着全球环境恶化、气候异常，干旱胁迫是造成作物减产的重要原因之一，日益危害着粮食生产安全。对于中国这样一个淡水资源短缺的国家，干旱对农业生产、甚至对社会生活造成了极其严重的影响。提高植物抗旱性一直以来都是一个长期而艰巨的任务。随着分子生物学的不断发展，转基因已经成为研究功能基因组学的有效手段，并且通过转基因途径改良植物抗逆性近年来正逐步得到可行性论证和普遍接受。已经有大量文献报道通过在植物中超量表达逆境应答相关基因能够在一定程度上提高植物的抗逆 t生(Saijo 等，Over-expression of a single Ca2+-dependent protein kinase confers both cold and salt/drought tolerance on rice plants. Plant J 23 :319-327, 2000 ；Zhang 等，Two cysteine proteinase inhibitors from Arabidopsis thaliana， AtCYSa and AtCYSb, increasing the salt， drought， oxidation and cold tolerance. Plant Mol Biol 68(1-2) :131-143,2008 ；Hou A homolog of human ski-interacting protein in rice positively regulates cell viability and stress tolerance. Proc Natl Acad Sci 106(15) :6410-6415,2009 ；Ma Enhanced tolerance to chilling stress in 0sMYB3R_2 transgenic rice is mediated by alteration in cell cycle and ectopic expression of stress genes. Plant Physiol 150(1) :244_56，2009)。但是报道中的这些超量表达通常用的都是组成型启动子，尽管组成型启动子超量表达效应高，但通常会伴随着不可避免的负面效应，如对植物产生毒害或负担或者使转基因植 tt · (Shavindra Transgenic approaches to increase dehydration-stress tolerance in plants. Mol Breed 5 :493_503，1999)。尽管已经有文献报道从植物中
Win (Yamaguchi Characterization of the expression of
a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol Gen Genet 23 :331-340,1993 ；Kasuga 等，A combination of the Arabidopsis DREBlA gene and stress-indueibIe rd29A promoter improved drought—and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer. Plant Cell Physiol 45 :346-350,2004 ；Xiao 等，Over-expression ofa LEA gene in rice improves drought resistance underthe field conditions.TheorAppl Genet 115(1) :35_46，2007)，但是这些启动子在植物的各组织器官中均有广泛的表达，难以避免转基因植株所造成的食品安全性问题。组织特异性启动子由于其表达的空间特异性而具有许多组成型启动子所不具备的特点，将外源基因在转基因植物中定位表达不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，还可以提高外源基因在特定部位的浓度，增加转基因的效果。因此，挖掘一些组织特异性表达并受干旱诱导的启动子在改良作物抗旱育种上具有十分重要的意义。XHS基因是一类植物中特有的基因家族，在植株的生长发育和逆境应答中发挥着多种功能(Mourrain等，Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell 101(5) :533-42,2000 ;Bateman 等，The SGS3 protein involved in PTGS finds a family,BMC Bioinformatics3(21) :1741-2105, 2002 ;Qin 等，Systematic identification of Xl-homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice. Plant Mol Biol 71(4-5) :483-96,2009)。
发明内容
本发明的目的是克隆、鉴定一个在根中特异表达，并受干旱胁迫诱导表达的植物内源启动子，并利用该启动子构建抗旱相关基因表达载体，通过遗传转化方法达到提高植物的抗逆性的目的。本发明通过以下技术方案实施首先是分离受干旱强烈诱导表达的候选基因的启动子。所选择的候选基因是水稻内源基因XHS家族的一员，命名为0XHS4。该基因在水稻品种明恢63的苗期干旱胁迫中受到强烈的上升诱导表达(Qin 等，Systematic identification of Xl-homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice.Plant Mol Biol 71(4-5) 483-96,2009) (Κ0ΜΕ注释号AKM2745)。所分离的该基因的启动子来源于水稻品种“中花 11”，申请人将其命名为0XHS4P。0XHS4P启动子是具有图1中碱基第1-1620位的序列； 在444-449、1424-14 碱基位点含有与干旱相关的应答元件MYB2C0NSENSUSAT (Abe等， Arabidopsis AtMYC2(bHLH)and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell 15 :63_78，2003)。在 649-655，674-679 碱基位点含有与干旱相关的应答元件 MYCATERDl (Simpson 等，Two different novel cis-acting elements of erdl， a clpA homologous Arabidopsis gene function in induction by dehydration stress and dark-induced senescence. Plant J 33 :259-270,2003 ； Tran 等,Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress. Plant Cell 16 :2481-2498,2004)，在 64-69、206-211、549-554、649-654、674-679、892-897、984-989、1290-1295、1386-1391、 1483-1488、1575-1580碱基位点含有与干旱相关的应答元件MYCCONSENSUSAT (Oh等， Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth. . Plant Physiology 138 :341-351,2005 ； Chinnusamy 等，Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants.J Exp Bot. 55 :225-236,2004)。 另外，在854-858，1490-1494，1556-1560碱基位点含有与根特异表达相关的应答元件 R00TM0TIFTAPOX1 (Elmayan T 等，Evaluation in tobacco of the organ specificity and strength of the rol D promoter， domain A of the 35S promoter and the 35S2 promoter. Transgenic Res 4 :388-396,1995)。
本发明所提供的启动子0XHS4P区域含有多个与干旱相关的顺式作用元件(如图 1所示)，能特异性地对干旱起应答反应。申请人利用0XHS4P启动子构建的GUS表达载体 (如图2所示)，转化水稻受体品种中花11，可以在转基因植株受到干旱胁迫时强烈地诱导报告基因GUS的表达(如图3所示)。本发明的效果详见具体实施方式
。详细的技术方案如下所述一种分离出的水稻DNA分子，其核苷酸序列如图1和序列表SEQ ID NO :1所示，其中启动子0XHS4P包含图1和SEQ ID NO 1所示的序列中的1-1620位碱基的核酸序列。所述的一种分离的DNA分子，其特征在于区域内除基本启动子元件外 (TATA-box)，还包含多个干旱应答顺式作用元件(MYB2C0NSENSUSAT、MYCATERD1、 MYCCONSENSUSAT)的组合以及根中特异表达元件R00TM0TIFTAPOX1。所述的0XHS4P启动子全部或部分序列可用于构建水稻表达载体。所述的0XHS4P启动子全部或部分序列构建水稻表达载体，可通过遗传转化方法培育改良植物。所述的0XHS4P启动子全部或部分序列可用于构建水稻表达载体，其可以通过遗传转化培育抗逆植物的遗传材料。所述的抗逆植物的材料是指植株、种子或细胞无性系。按照以上的技术方案，申请人或申请人以外的其他人可以利用本发明所提供的 0XHS4P启动子构建抗逆相关基因的表达载体转化植物以提高植物的抗旱性。受体植物可以是包括水稻、小麦、玉米等在内的禾谷类作物以及一些其他的重要经济作物，例如玉米、棉花、油菜或番茄等。
序列表SEQ ID NO :1，是本发明克隆的水稻启动子0XHS4P的序列，序列长度为 1620bp。图1 显示的是0XHS4P启动子序列。下划线序列为扩增0XHS4P启动子所用的引物序列；阴影部分显示的是基本启动子元件序列；波浪线表示的是干旱应答元件核心序列； 根特异表达元件用斜体并加下划线表示。图2 显示的是本发明构建的表达载体pCAMBIA1391Z-0XHS4P表达载体。该载体含潮霉素抗性筛选基因，启动子0XHS4P被融合到GUS基因5’端非翻译区。图3 显示的是0XHS4P启动子控制下的⑶S基因在在正常和干旱胁迫处理下的表达活性。A和B是正常条件下⑶S分别在主根和侧根根尖中的表达；C-E，20X目镜下观察在正常条件⑶S在根尖中的表达；F-G，20X目镜下观察在干旱胁迫条件⑶S在根尖中的表达。图4 显示的是0XHS4P启动子控制下的⑶S基因在干旱胁迫处理下的表达水平。 TGU TG2和TG3是pl391Z-0XHS4P转化中花11得到的3个独立的转基因阳性家系，3个时间点分别是胁迫0、15min、30min。
具体实施例方式1、0XHS4P启动子分离和鉴定通过水稻品种“明恢63”(来自福建省农业科学院，见《遗传资源来源披露登记表》)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱显著诱导的基因，其TIGR(http://rice, plantbiology. msu. edu/) ID 为 L0C_0s02gl9130，被命名为 0XHS4 (Qin 等，Systematic identification of Xl—homologous genes reveals a family involved in stress responses in rice. Plant Mol Biol 71(4-5) :483-96, 2009)，对应的 BAC 克隆号为 AP003988,在 KOME 数据库(http//cdnaOl. dna. affrc. go. jp/cDNA/)中对应的全长 cDNA 编号为AKM2745。下一步就是分离该基因的启动子。具体步骤如下在NCBI (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)找到该基因对应的粳稻“日本晴”的基因组序列(AP003988)并选取该基因的转录起始位点上游2Kb的范围作为候选启动子区域进行PCR扩增。设计引物 0XHS4P_F(5，-taa GAATTC ATGTGTTCCTCTGCTCGC-3，)禾口 0XHS4P_R(5，-taa GGATCC ATGTGTTCCTCTGCTCGC-3，)，并在引物5，端分别添加限制性酶切位点EcoRI和BamHI (用斜体加下划线表示，酶切位点前的三个碱基为保护碱基)。首先利用引物0XHS4P-F和0XHS4P-R 以中花11 (来自中国农业科学院作物研究所商业品种，见《遗传资源来源披露登记表》)基
DNA (CTAB^^i^, Zhang^, genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis. Theor Appl Genet，83，495-499，1992)为模板进行扩增，反应体系为20uL GC buffer I体系(购自宝生物工程大连有限公司)，反应条件是94°C预变性 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2mim, 32 个循环；72°C延伸 7min。 PCR产物连入pGEM-TCasy载体上(来源见《遗传资源来源披露登记表》)，筛选阳性克隆并测序(ABI3730测序仪，Applied Biosystem，测序在国家植物基因中心[武汉]完成)，结果证实所扩增序列为预期的0XHS4P启动子序列，其包含多个干旱应答顺式作用元件(如图1)。2、0XHS4P启动子驱动报告基因的水稻遗传转化本发明的实施方案就是构建0XHS4P启动子的GUS基因表达载体并转化到水稻品种“中花11”中，定性、定量地检测0XHS4P启动子在干旱胁迫下的诱导表达水平。具体操作如下首先将分离的0XHS4P启动子的PCR产物连入pGEM-TCasy载体，转化大肠杆菌 DH5a (购自Promega公司，见《遗传资源来源披露登记表》))并获得阳性克隆。通过EcoR I和BamH I双酶切从pGEM_T Easy阳性克隆上回收0XHS4P再将其连接到⑶S表达载体 PCAMBIA1391Z (来自CAMBIA公开使用的载体，载体含有GUS报告基因，见《遗传资源来源披露登记表》)。酶切验证阳性克隆并检测插入方向正确后，通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法导入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、 分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用Hiei等人 艮道的方法(参见Efficient transformation of rice,Oryza sativa L., mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA. Plant Journal 6 :271-282,1994)并在其基础上进行改良优化。主要步骤和试剂如下(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧节青霉素)； KT(Kinetin, 1 ] ) ；NAA(Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ；IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-DQ，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- 二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone， Zigt了) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,)；
HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(IOX)]的配制硝酸钾(KNO3)28. 3g磷酸二氢钾(KH2PO4)4. Og硫酸铵(NH4)2SO4)4. 63g硫酸镁(MgSO4· 7H20)1. 85g氯化钙(CaCl2· 2H20)1. 66g逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000ml。2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制碘化钾(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g硫酸锰(MnSO4· 4H20)0. 44g硫酸锌(ZnSO4· 7H20)0. 15g室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。3)铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)的配制准备800ml双蒸水并加热至70°C，加入乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小时，用蒸馏水定容至1000ml，4°C保存备用。4)维生素贮存液(100X)配制
烟酸(Nicotinic acid)0. Ig
维生素 Bl (Thiamine HCl)0. Ig
维生素 B6(Pyridoxine HCl)0. Ig
甘氨酸(Glycine)O. 2g
肌醇(Inositol)IOg
用蒸馏水定容至1000ml，4°C保存备用ο
5) MS培养基大量元素母液(10X)的配制
硝酸铵(NH4NO3)16. 5g
硝酸钾19. Og
磷酸二氢钾1.7g
硫酸镁3. 7g
氯化钙4. 4g
室温下溶解并用蒸馏水定容至1000mlO
6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制
碘化钾0. 083g
硼酸0. 62g
硫酸锰0. 86g
钼酸钠(Na2MoO4 · 2H20)0. 025g
硫酸铜(CuSO4· 5H20)O. 0025g室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ml。7)2,4-D|C存液(lmg/ml)的配制秤取2，4-D IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全 后定容至100ml,于室温下保存。8)6-BA|C存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，室温保存。9)萘乙酸(NAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取NAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶解完全后 定容至100ml，4°C保存备用。10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(lmg/ml)的配制秤取IAA IOOmg,用Iml IN氢氧化钾溶解5分钟，然后加IOml蒸馏水溶 解完全后定容至100ml，4°C保存备在一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水和硫酸铁 (FeSO4· 7H20) 2. 78g。在另一个大三角瓶中加入300ml蒸馏水。11)葡萄糖贮存液(O. 5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸馏水溶解定容至250ml，灭菌后4°C保存备用。12) AS贮存液的配制秤取AS O. 392g, DMSO 10ml，分装至I. 5ml离心管内，4°C保存备用。13) IN氢氧化钾贮存液秤取氢氧化钾5. 6g，并用蒸馏水溶解定容至100ml，室温保存备用。(3)用于水稻遗传转化的培养基配方I)诱导培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml2，4_D 贮存液2.5ml脯氨酸(Proline)O. 3gCHO. 6g鹿糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。2)继代培养基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 贮存液(100X)IOml维生素贮存液(100X)IOml
2，4_D 贮存液2.0ml脯氨酸0. 5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。3)预培养基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4_D 贮存液0.75mlCH0. 15g鹿糖5g琼脂粉(Agarose)1. 75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养 基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。4)共培养基N6max 母液(10X)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4-D 贮存液0.75mlCH0. 2g鹿糖5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 6，封口灭菌。使用前加热溶解培养 基并加入5ml葡萄糖贮存液和250 u 1 AS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。5)悬浮培养基N6max 母液(10X)5mlN6mix 母液(100X)0.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)0.5ml维生素贮存液(100X)lml2，4_D 贮存液0.2mlCH0. 08g蔗糖2g加蒸馏水至100ml，调节pH值到5. 4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使 用前加入lml葡萄糖贮存液和100 u 1 AS贮存液。
6)选择培养基N6max 母液(10X)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml2，4_D 贮存液0.625mlCH0. 15g蔗糖7.5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250 yl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。7)预分化培养基N6max 母液(10X)25mlN6mix 母液(100X)2.5mlFe2+EDTA 贮存液(100X)2.5ml维生素贮存液(100X)2.5ml6-BA 忙存液0.5mlKT 贮存液0.5mlNAA|C存液50 ulIAA|C存液50 ulCH0. 15g鹿糖7. 5g琼脂粉1.75g加蒸馏水至250ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 9，封口灭菌。使用前溶解培养基， 加入250 u 1 HN和200ppm CN,分装倒入培养皿中(25ml/皿)。8)分化培养基N6max 母液(10X)100mlN6mix 母液(100X)10mlFe2+EDTA 贮存液(100X)10ml维生素贮存液(100X)10ml6-BA 贮存液2mlKT 贮存液2mlNAA 贮存液0.2mlIAA 贮存液0.2mlCHlg蔗糖30gPhytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到 50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。0166]9)生根培养基
0167]MSmax 母液(IOX)50ml
0168]MSmix 母液(100X)5ml
0169]Fe2+EDTA 贮存液(100X)5ml
0170]维生素贮存液(100X)5ml
0171]蔗糖30g
0172]Phytagel3g加蒸馏水至900ml，IN氢氧化钾调节pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中05ml/管)，封口灭菌。(4)农杆菌介导的遗传转化步骤1)愈伤诱导(1)将成熟的水稻种子去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0. 15%氯化汞 (HgCl2)种子表面消毒15分钟；(2)用灭菌水洗种子4-5次；(3)将种子放在诱导培养基上；(4)将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25士 1°C。2)愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25 士 1°C。预培养挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度 25 士 1°C。3)农杆菌培养(1)在带有对应抗性选择的LA培养基上预培养农杆菌EHA105 (来源于CAMBIA，商用菌株)两天，温度；(2)将农杆菌转移至悬浮培养基里，28°C摇床上培养2-3小时。5)农杆菌侵染(1)将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；(2)调节农杆菌的悬浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；(4)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养2天，温度 19-20 "C。6)愈伤洗涤和选择培养(1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；(2)浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；(3)转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；(4)转移愈伤至选择培养基上选择2-3次，每次2周。(第一次潮霉素筛选浓度为 400ppm，第二次以后为250ppm)7)分化(1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上黑暗处培养5-7周；
(2)转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度^TC。8)生根剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中，光照下培养2-3周，温度 26°C。9)移栽洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田生长至收种。3、启动子0XHS4P的组织特异性和干旱诱导表达活性的鉴定申请人:构建的P1391Z-0XHS4P载体(如图2)按上述方法转化水稻“中花11”，得到转基因阳性植株22株。选取3个转启动子阳性家系Tl代种子进行潮霉素(HN)抗性筛选发芽(种子在含100 μ M/L潮霉素的水中浸种2天后置于33度培养箱催芽)，将发芽的苗子种于面包盒中水培培养至3叶期。取植株的各组织器官(叶，叶鞘和根)浸于⑶S溶液中， 在37°C中反应1 后在体式显微镜下观察⑶S的表达部位和表达强度。⑶S显色实验结果显示GUS在叶和叶鞘中不表达，只在主根和侧根的根尖部位的伸长区和根毛区表达。在根尖内部组织结构的表达部位集中在中柱，在皮层中有少量表达(见图幻。取植株进行干旱处理，干旱胁迫方法是将植株置于空气中自然失水，取0min、15min、30min根的样品，每份样品取的是该家系的混合样(不少于6株)。同时取干旱处理0和30min的根尖置于GUS 溶液中，反应1 后在体式显微镜下观察⑶S的表达部位和表达强度。结果显示⑶S在干旱处理30min根尖中的表达强度显著强于在Omin根尖中的表达，在中柱和皮层中的表达显著加强，并且在根毛的表达也从无到有(图幻。表明0XHS4P是受干旱胁迫显著诱导的。干旱胁迫处理过程中各时间点的样品的总RNA采用TRIZOL试剂(购自 ^witrogen公司)提取(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶SSIII (购自^witrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据^witrogen公司反转录酶试剂说明书)。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物(5’ -AAACTGCCTGGCACAGCAAT-3’和 5’ -CGAAAACTGTGGAATTGAT-3’ )对GUS基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长78bp)。同时用引物(5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3’ 和 5’ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’ )对水稻 Actinl基因做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为 950C IOsec, 95°C 5sec,60°C 34seC，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明0XHS4P启动子控制下的GUS基因表达水平受到干旱胁迫的强烈诱导，在三个独立转基因家系中⑶S基因在干旱处理30min根样品的表达水平是胁迫前的约4至12倍(如图
4)。
附录水培试剂(营养液)配方
1、无机盐的大量元素部分(溶液)
DNH4NO391. 4g ；
2) NaH2PO4 · 2H2040. 3g ；
3) K2SO471. 4g ；
4) CaCl288. 6g ；
5) MgSO4 · 7H20324g ；
分别溶解加水稀释至1L，调PH = 6. 0，为营养液-1。
2、无机盐的微量元素部分(溶液)
MnCl2 · 4H20(NH4) 6Mo7024 ‘ 4H20H3BO3
15g ； 0. 074g ； 0. 734g 0. 035g 0. 031g 7. 7g ； 11. 9g；ZnSO4 · 7H20CuSO4 · 5H20FeCl3 · 6H20C6H8O7分别溶解后加50ml浓硫酸(98%浓度)混合定容至1L，为营养液_2。水培培养水稻时，每4L培养液中加上述营养液-1和营养液-2各5ml，混勻。本发明是鉴定一个在根中特异表达，并受干旱强烈诱导的水稻XHS基因的启动子，通过启动子活性定量分析表明，可以将该启动子用于抗逆性相关基因在水稻等作物中的表达，从而有效地提高植株的抗逆境性能。
权利要求
1.一种被干旱诱导并在根中特异表达的启动子0XHS4P，其核苷酸序列如SEQ ID NO=I 所示。
2.权利要求1所述的启动子0XHS4P在调控基因在植物的根中特异表达中的应用。
3.权利要求1所述的启动子0XHS4P在调控基因在植物根干旱诱导表达中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种植物干旱特异诱导型启动子的分离鉴定和应用。通过分离和鉴定获得一种在水稻中受干旱诱导并在根中特异表达的基因的启动子OXHS4P，它具有如序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，序列长度为1620bp。本发明的启动子可以应用于植物的基因工程中，以达到植物遗传改良特别是提高植物抗旱性的目的。
文档编号C12N15/82GK102586246SQ20111000480
公开日2012年7月18日 申请日期2011年1月10日 优先权日2011年1月10日
发明者熊立仲, 覃永华 申请人:华中农业大学