【技术领域】
本发明涉及基因工程技术，特别涉及一种目的蛋白制备方法及其用途。
背景技术：
随着基因工程技术的发展，一些具有生物活性的小分子多肽如虎纹镇痛肽等受到高度重视。虎纹镇痛肽是从我国特有的虎纹蜘蛛毒液中提取的由33个氨基酸组成的多肽。动物实验表明，虎纹镇痛肽具有非常强的镇痛效果，其作用机理和部位与吗啡完全不同，具有非成瘾性、无依赖性的特点。有望研制成为替代吗啡的镇痛新药，特别用于癌症病人和手术后病人的疼痛治疗。
目前，活性多肽的制备多采用化学合成或生物组织提取的方法，作为活性多肽的虎纹镇痛肽，目前主要是从虎纹蜘蛛毒液中提取。为了摆脱天然虎纹镇痛肽的提取对虎纹蜘蛛的依赖，获得质量高、疗效好的虎纹镇痛肽制剂，有必要探索应用基因工程方法制备重组虎纹镇痛肽。与化学合成方法或组织提取方法相比，基因工程方法用于生产虎纹镇痛肽制品在降低成本、提高产量、减少毒性副产物或恢复生物活性方面具有一定的优势和改良。但是，由于以往的表达都是单拷贝，造成宿主表达潜能浪费，产量较低。
将多肽基因进行串联表达可解决单拷贝表达产量低的原因：（1）串联增加了多肽基因数量，有利于提高表达量；（2）串联多聚体形式的表达可有效屏蔽宿主毒性；（3）多聚体表达产物更稳定。因此，对虎纹镇痛肽采用构建多聚体的方法对于提高表达量具有突出的优势。
迄今，多种肽的多聚体、多拷贝形式已获得成功表达[1-4]。但由于多克隆酶切位点的存在，这些成功表达的多肽的N端和C端都带有多个冗余的氨基酸，并且国内尚无报道提及虎纹镇痛肽的定向多拷贝克隆制备方案。
目前，存在的主要问题是如何提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性。因此需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种提高表达量、易于纯化和保持良好的生物学活性的蛋白制备方法。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案，包括以下步骤：
目的蛋白核苷酸序列片段的获得；
目的蛋白重组表达载体的构建；
目的蛋白的诱导表达；
目的蛋白的纯化；优选采用HPLC进行纯化；
纯化产物的切割；
所述目的蛋白的核苷酸序列片段的前面插入单体切割的识别位点；优选地，在目的蛋白的核苷酸序列片段上游引入kex2酶切位点，在下游引入盐酸羟胺切割位点；
所述目的蛋白的核苷酸序列片段通过SOE技术获得，通过引物引入单体切割的识别位点；
优选的，目的蛋白是人神经生长因子，胸腺肽、虎纹克胰肽、虎纹镇痛肽，目的蛋白并不限于此。
在目的蛋白纯化之前还可以包括鉴定蛋白表达的步骤。
所述目的蛋白重组表达载体构建中的目的蛋白基因是一个或一个以上拷贝，可通过一个拷贝目的蛋白重组表达载体经过酶切连接制备得到。
所述单体切割的识别位点被化学试剂或酶切割，优选地，化学试剂包括溴化氰、甲酸和羟胺，酶试剂包括胰蛋白酶、梭菌蛋白酶、弗林蛋白酶、凝血酶和亮氨酸氨肽酶。
当所述目的蛋白基因是一个以上拷贝时，是以目的蛋白表达盒为单位进入表达载体进行克隆的；
优选地，当得到一个拷贝数的重组表达载体时，在此基础上经过酶切连接等手段重组得到两个拷贝数的重组表达载体；依次类推，得到一个以上拷贝数的各重组表达载体。
所述的载体为酵母表达载体。
本发明还保护由该方法所得的目的蛋白制品。
本发明还保护由该方法所得的目的蛋白制品用于医药的用途。
本发明以虎纹镇痛肽为例来说明本发明的方法。
本发明提供的方法具有如下设计方案：
1、根据基因组数据库获得编码感兴趣多肽的基因编码区碱基序列，并商业化合成模板链和编码链寡核苷酸链。
2、合成的寡核苷酸链具有如下特征：编码链的5’端依次具有限制性内切酶EcoRI、BglII酶切位点序列、酵母kex2酶切位点序列，3’端依次具有盐酸羟胺切割位点(NG)序列、BamHI、NotI酶切位点序列。
3、上述编码链依次经BglII/NotI、BamHI/NotI双酶切，回收目的片段，连接，依次经行，从而获得含有高拷贝的感兴趣多肽基因片段定向连接单元。
4、所获得的高拷贝的感兴趣多肽基因片段定向连接序列经EcoRI/NotI双酶切后回收连接到pPIC9K载体上，经电转化至毕赤酵母GS115。
5、所述单一切割位点序列被化学试剂和酶切割后，感兴趣多肽N端为天然末端，C端产生一个多余的氨基酸残基N。本发明上游的kex2酶切位点为酵母本身的蛋白酶kex2裂解位点，以保证各串联的单体有天然的N端；下游的盐酸羟胺切割位点(NG)引入，以保证切除合成的单体C端冗余的氨基酸残基，使最终表达的目的多肽有天然的N端，C端只有一个冗余的氨基酸残基(N)。
6、所述多肽单体混合物经高效液相色谱（HPLC）方法进行深度纯化。
7、所述纯化后的感兴趣多肽单体产物的活性测定。
本发明的目的是构建虎纹镇痛肽的定向多拷贝克隆，得到的重组虎纹镇痛肽具有天然的N端，而C端只多了一个冗余的氨基酸(N)，进而实现虎纹镇痛肽的高效规模化制备，建立一种目的蛋白基因定向多拷贝克隆构建的方法。
本发明的一个实施例提供了用本发明的方法制备虎纹镇痛肽的步骤，与现有技术相比，本发明的制备方法表达量高、易于纯化、并保持了目的蛋白良好的生物学活性。
本发明的一个实施例通过用大鼠硬膜外用药热辐射-甩尾法测痛试验检测重组虎纹镇痛肽具有活性。
在本发明中，术语“定向”是指感兴趣多肽基因DNA片段按照编码链5’-3’方向相互连接，还指表达多肽产物按氨基端羧基端方向相互连接。
在本发明中，术语“多拷贝”是指感兴趣多肽基因DNA片段大于或等于两个拷贝数。
【附图说明】
图1为虎纹镇痛肽基因PCR鉴定的电泳检测图。
图2为虎纹镇痛肽基因2拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图3为虎纹镇痛肽基因3拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图4为虎纹镇痛肽基因4拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图5为虎纹镇痛肽基因5拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图6为虎纹镇痛肽基因6拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图7为虎纹镇痛肽基因7拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图8为虎纹镇痛肽基因8拷贝串联序列克隆的电泳检测图。
图9为虎纹镇痛肽基因单拷贝表达载体的PCR产物电泳检测图。
图10为虎纹镇痛肽基因2-4拷贝表达载体的PCR产物电泳检测图。
图11为虎纹镇痛肽基因5－8拷贝表达载体的PCR产物电泳检测图。
图12为虎纹镇痛肽1-8串联表达载体EcoRI/NotI双酶切鉴定电泳图。
图13为重组虎纹镇痛肽的Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图14为重组虎纹镇痛肽高效液相色谱图。
图15为重组虎纹镇痛肽纯化洗脱280nm紫外检测色谱图。
图16为重组虎纹镇痛肽纯化后的Tricine-SDS-PAGE电泳图。
【具体实施方式】
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下以目的蛋白是虎纹镇痛肽为例来进行说明本发明的方法，其它目的蛋白类似。
实施例1：虎纹镇痛肽基因的克隆。
1、虎纹镇痛肽基因寡核苷酸片段的设计
根据毕赤酵母对密码子的偏好性，对虎纹镇痛肽成熟肽编码基因进行优化，在不改变氨基酸序列的情况下，用毕赤酵母使用频率较高的密码子代替稀有密码子，设计了4条Oligo，其中每相邻的Oligo有15-16个碱基互补。Oligo由Invitrogen生物科技有限公司合成。
Oligo1：ATGAATTCGCTTGTAAGGGTGTC（SEQIDNO:1）其中单下划直线为EcoRI酶切位点，双下划直线为BglII酶切位点，单下划波浪线为酵母kex2酶切位点，
Oligo2：GTTTGGACAACACTCGTTCTTACCTGGAGTACAAGCGTCGAAGACACCCTTACAAGC（SEQIDNO:2）
Oligo3：GAGTGTTGTCCAAACAGAGTTTGTTCTGACAAGCACAAGTGGTGTAAGTGGAAGTTG（SEQIDNO:3）
Oligo4：TATGCGGCCGCCTACAACTTCCACTTACA（SEQIDNO:4）其中下划波浪线为盐酸羟胺切割位点(NG)，双下划直线为BamHI，单下划直线为酶切位点NotI酶切位点，下划虚线为SalI酶切位点，
2、虎纹镇痛肽编码基因的克隆
上述合成的核苷酸片段经通过SOE(SplicingbyOverlapExtension)法获得虎纹镇痛肽成熟肽的编码基因。PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，Oligo1(10μmol/L)和Oligo4(10μmol/L)各5μL，Oligo2和Oligo3(10μmol/L)各0.2μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，70℃变性30s；30℃退火30s，37℃延伸30s，70℃保持60s；其后94℃预变性5min，然后进行35个循环的60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果正确的，进行凝胶回收纯化后连接到pMD19T，鉴定结果见图1，图1中泳道M为DNAmarker；泳道1-5为随即挑选的阳性克隆子菌液PCR结果，从图1可以看出，克隆子2和3为阳性克隆子。再将阳性克隆转化到菌株大肠杆菌DH5α，制备新鲜菌液，并由Invitrogen生物科技有限公司测序，测序结果表明为正确的虎纹镇痛肽编码基因。
编码链的5’端依次具有限制性内切酶EcoRI(gaattc)、BglII(agatct)酶切位点序列、酵母kex2酶切位点序列(gagaaaaga)，3’端依次具有盐酸羟胺切割位点(NG)序列(aacggc)、BamHI(ggatcc)、NotI(gcggccgc)和SalI(gtcgac)酶切位点序列。
虎纹镇痛肽的基因序列如下：
5’-GCTTGTAAGGGTGTCTTCGACGCTTGTACTCCAGGTAAGAACGAGTGTTGTCCAAACAGAGTTTGTTCTGACAAGCACAAGTGGTGTAAGTGGAAGTTG-3’（SEQIDNO:7）
3、虎纹镇痛肽基因片段多拷贝定向克隆
将步骤2所得测序正确的虎纹镇痛肽编码基因用EcoRI和SalI双酶切凝胶回收纯化后连接到同样双酶切的载体PUC57（购于杭州百细生物工程公司）上，构建的质粒记作PUC57-HWAP-I，进行虎纹镇痛肽多拷贝串联基因的拼接。经测序正确的质粒PUC57-HWAP-I经BglII/NotI双酶切后回收HWAP-I片段；同时经BamHI/NotI双酶切后回收PUC57-HWAP-I片段，将回收的目的片段经T4连接酶连接，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，转化的菌液涂布于含Amp的LB平板上37℃培养14-16h进行筛选。筛选到的阳性克隆子经PCR检测，PCR产物电泳结果见图2，泳道M为DNAmarker；泳道1-9为随机挑选的阳性克隆子菌液PCR结果，泳道10为PUC57-HWAP-Ⅰ的PCR结果。从图2可以看出，阳性克隆子1、4-7、9的PCR产物的大小与2拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符，然后制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成虎纹镇痛肽的2拷贝串联基因的构建，质粒记作PUC57-2HWAP-I。经测序正确的质粒PUC57-2HWAP-I经BglII/NotI双酶切后回收2HWAP-I片段；同时经BamHI/NotI双酶切后回收PUC57-2HWAP-I片段，将回收的PUC57-2HWAP-I片段分别与HWAP-I和2HWAP-I经T4连接酶连接，完成虎纹镇痛肽的3、4拷贝串联基因的构建，质粒分别记作PUC57-3HWAP-I和PUC57-4HWAP-I，其鉴定结果见图3和图4，泳道M为DNAmarker；泳道1-9为随机挑选的阳性克隆子菌液PCR结果，图3的泳道10为PUC57-2HWAP-ⅠPCR结果，图4泳道10为PUC57-3HWAP-ⅠPCR结果，图3中的阳性克隆子1、3-5、7-9的PCR产物的大小与3拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符，图4中的阳性克隆子1-9的PCR产物的大小与4拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符，然后制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成虎纹镇痛肽的3、4拷贝串联基因的构建。经测序正确的质粒PUC57-3HWAP-I和PUC57-4HWAP-I分别经BglII/NotI双酶切后回收3HWAP-I和4HWAP-I片段；质粒PUC57-4HWAP-I经BamHI/NotI双酶切后回收PUC57-4HWAP-I片段，将回收的PUC57-4HWAP-I片段分别与HWAP-I、2HWAP-I、3HWAP-I和4HWAP-I经T4连接酶连接，进行虎纹镇痛肽的5-8拷贝串联基因的构建，质粒分别记作PUC57-5HWAP-I、PUC57-6HWAP-I、PUC57-7HWAP-I和PUC57-8HWAP-I(图5-8)。其中泳道M为DNAmarker；泳道1-9为随机挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；图5的泳道10为PUC57-4HWAP-ⅠPCR结果；图6的泳道10为PUC57-5HWAP-ⅠPCR结果；图7的泳道10为PUC57-6HWAP-ⅠPCR结果；图8的泳道10为PUC57-7HWAP-ⅠPCR结果；图8的泳道10为PUC57-8HWAP-ⅠPCR结果。图5中的阳性克隆子1-9的PCR产物的大小与5拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符；图6中的阳性克隆子1、3-4、6-9的PCR产物的大小与6拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符；图7中的阳性克隆子4-9的PCR产物的大小与7拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符；图8中的阳性克隆子1-2、4-5和7的PCR产物的大小与8拷贝虎纹镇痛肽串联基因理论值相符，然后挑选PCR产物大小与理论值的大小相符的阳性克隆子制备新鲜菌液经Invitrogen公司测序鉴定，完成虎纹镇痛肽的5-8拷贝串联基因的构建。
实施例2：虎纹镇痛肽基因多拷贝定向克隆构建体真核表达与纯化
1、虎纹镇痛肽基因多拷贝定向克隆构建体酵母表达
含有虎纹镇痛肽1-8串联基因的质粒PUC57-HWAP-I――PUC57-8HWAP-I分别经EcoRI/NotI双酶切后回收虎纹镇痛肽1-8串联基因，回收的片段经T4连接酶连接到经EcoRI/NotI双酶切后回收的pPIC9K载体（本实验室保存）上，连接混合物转化至大肠杆菌DH5α中，转化的菌液涂布于含卡那霉素的LB平板上37℃培养14-16h进行培养筛选。对筛选到的阳性克隆子首先进行PCR检测，结果见图9-11。其中图9的泳道M为DNAmarker；泳道1为空载pPIC9K；泳道2-9为随机挑选的阳性克隆子菌液PCR结果；从图9可以看出，阳性克隆子2、5的PCR产物的大小与单拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符。图10的泳道M为DNAmarker；泳道1为pPIC9K-HWAP-Ⅰ质粒PCR结果；泳道2-4为pPIC9K-2HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；泳道5-7为pPIC9K-3HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；泳道8-10为pPIC9K-4HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；从图10可以看出，阳性克隆子2-4的PCR产物的大小与2拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符；阳性克隆子5-7的PCR产物的大小与3拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符；阳性克隆子8-10的PCR产物的大小与4拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符。图11中的泳道M为DNAmarker；泳道1-3为pPIC9K-5HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；泳道4-6为pPIC9K-6HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；泳道7-9为pPIC9K-7HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果；泳道10为pPIC9K-8HWAP-Ⅰ阳性克隆子菌液PCR结果。从图11可以看出，阳性克隆子1-3的PCR产物的大小与5拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符；阳性克隆子6的PCR产物的大小与6拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符；阳性克隆子7和8的PCR产物的大小与7拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符；阳性克隆子10的PCR产物的大小与8拷贝虎纹镇痛肽表达载体理论值相符。
再对能够检测出目的条带的菌株摇菌提取质粒，再进行EcoRI/NotI双酶切鉴定，酶切鉴定图谱图12的泳道M为DNAmarker；泳道1-8为1-8拷贝串联表达载体双酶切结果；从图12可以看出，每个质粒都被酶切出两条明显的条带，虎纹镇痛肽1-8拷贝基因片段明显，且大小与理论值相符。对双酶切鉴定正确的菌株制备新鲜菌液由Invitrogen生物科技有限公司测序。至此1-8拷贝虎纹镇痛肽串联编码基因毕赤酵母表达载体构建成功。
大量提取构建好、测序正确的表达载体质粒，用SalⅠ单酶切24h使其线性化，用等体积的酚、酚：氯仿、氯仿各抽提一次，再加入1/10体积的3MpH5.2醋酸钠和2.5倍体积的冷无水乙醇，混匀后-20℃放置1h，12000rpm离心5min，用70%乙醇洗涤2次，在超净台上吹干，用灭菌双蒸水溶解后稀释为终浓度为1μg/μL，取10μL以2kV，25μF，200Ω的条件下电转化至毕赤酵母GS115。电击转化后，转化产物转移到5ml离心管于30℃静置1.5－2h，取0.1ml均匀涂布于含0.25mg/mLG418的YPD选择平板上，30℃培养5天。
将具有G418抗性的最初转化子菌落，通过影印法克隆到MM平板(1.34%YNB，4×10-5%biotin，0.5%methanol，1.5%agar)和MD平板(1.34%YNB，4×10-5%biotin，2%dextrose，1.5%agar)上，30℃培养3d，挑选在两种培养基上都生长良好的Mut+菌落。将筛选到的阳性重组子先经BMGY(2%蛋白胨、1%酵母浸出物、1.34%酵母氮源(YeastNitrogenBase,YNB)、0.4mg/L生物素、1%苷油、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基培养至A600达到3-6，利用通用鉴定引物α-Factor和3’AOX进行菌液PCR鉴定。
其中通用鉴定引物α-Factor和3’AOX序列（Invitrogen公司合成）分别如下：
α-Factor：TACTATTGCCAGCATTGCTGC（SEQIDNO:5）
3’AOX：GGCAAATGGCATTCTGACATCCT（SEQIDNO:6）
PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，dNTP4μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，α-Factor和3’AOX引物(10μmol/L)各5μL，加双蒸水至50μL。PCR反应程序：先94℃预变性5min，然后进行35个循环的94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；循环结束后再72℃保持5min，冷却4℃。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。对检测出目的条带的菌株离心收集菌体重悬于BMMY(2%蛋白胨、1%酵母浸出物、1.34%YNB、0.4mg/L生物素、0.5%甲醇、100mmol/L磷酸盐缓冲液)培养基中进行28℃，250rpm诱导表达96小时，分别于24、48、72和96小时取2mL菌液，10000rpm4℃离心5min，取上清离心进行Tricine-SDS-PAGE分析，结果显示(图13)酵母诱导表达上清里面成分单一，分子量大小与虎纹镇痛肽的理论值相符。取200μL上清液经HPLC分析，结果见图14，与标准品（虎纹镇痛肽样品由湖南师范大学生命科学院提供）相比在相应位置出现目的峰。诱导表达结束后离心收集培养上清，-20℃冻存，用于纯化分析。
2、表达产物的初步纯化
利用离子交换层析进行重组蛋白的纯化。离子交换柱为弱阳离子交换柱（购于TOSOH公司），ToyoScreenGigaCapCM-650M5ml预装柱。离子交换柱首先以pH6.5的0.02mol/L初始磷酸缓冲液平衡后4个柱体积。样品上清液先用磷酸调节pH值至6.5后上样，上样完毕，继续用pH6.5的0.02mol/L初始磷酸缓冲液洗脱。待流出液A280nm＜0.05后改用1.0MNaCl盐溶液梯度洗脱，收集目的峰流出液，由图15可以看出，与虎纹镇痛肽标准品相比，重组虎纹镇痛肽同样在洗脱进行3分钟后出现洗脱峰（上清液共275毫升，标准品上样不到1毫升）。收集洗脱峰。把收集的重组蛋白在羟胺酶切缓冲液(2M盐酸羟胺，0.2MTris-HCl,pH9.0)在45°С孵育4h，然后降至室温，用HCl调节PH至6.0终止反应。调节缓冲液的pH至6.5，然后按照上述方法过层析柱，收集层析柱洗脱液，进行Tricine-SDS-PAGE分析，分析结果见图16。从图16可以看出，重组虎纹镇痛肽的泳道有明显的蛋白条带，分子量大小与虎纹镇痛肽标准品相当。
所述初步纯化的产物用BCA法测定蛋白含量。
实施例3：虎纹镇痛肽单体产物活性研究
用SD大鼠硬膜外用药热辐射-甩尾法测痛试验检测重组虎纹镇痛肽的生物活性。参照张勇的方法(张勇博士学位论文，针刺治疗慢性神经病理痛的作用及其初级感觉神经机制，1999，4，同济医科大学)。SD大鼠购于厦门大学医学院动物中心。活性检测结果显示，上述步骤所得的重组虎纹镇痛肽具有一定的镇痛效应，并存在一定的正的量效关系。
SEQUENCELISTING
<110>厦门北大之路生物工程有限公司
<120>一种目的蛋白制备方法及其用途
<130>P6792
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<212>DNA
<213>人工合成
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gtttggacaacactcgttcttacctggagtacaagcgtcgaagacacccttacaagc57
<210>3
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<212>DNA
<213>人工合成
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<213>人工合成
<400>4
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<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
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<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
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<210>7
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<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
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gtttgttctgacaagcacaagtggtgtaagtggaagttg