交联的-e-赖氨酸颗粒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种交联的聚-ε-赖氨酸聚合物。聚-ε-赖氨酸和交联剂通过酰胺键连接并且交联剂可具有能够与聚-ε-赖氨酸的α碳胺反应的至少两个官能团。聚合物合适地在水和其他溶剂中是可溶的，并且是以颗粒的形式。本发明提供了颗粒状支持物，其包括交联的聚-ε-赖氨酸聚合物，并且聚合物提供了颗粒本身或包被在颗粒上，所述颗粒例如是二氧化硅。所述聚合物可用于广泛的应用，包括伤口处理，用作医学诊断剂包括颗粒状支持物和被支持物结合或保留的功能性材料，以及肽、寡核苷酸、寡糖的合成，物质的固定化、细胞培养和色谱分离。
【专利说明】交联的-E-赖氨酸颗粒
[0001]本发明涉及一种聚合物支持物(polymeric support),制备所述支持物的方法和所述支持物在固相过程中的用途。尤其是，本发明涉及一种含有交联的聚-e -赖氨酸的聚合物支持物。所述支持物在广泛的物理和化学过程中有用，特别是当与底物的相互作用是例如固相合成、固相萃取、固相试剂、物质的固定化、细胞培养、催化、色谱分析以及医学诊断所需要的。
[0002]聚-ε-赖氨酸是一种由通过羧基和第五位(eε )氨基之间的酰胺键连接的氨基酸赖氨酸组成的自然发生的短链多分散的聚酰胺。这种结构其不寻常在于所述酰胺键由羧基和赖氨酸的第五位(ε)氨基之间形成,而在肽的氨基酸之间并且传统采用聚赖氨酸的正常肽键是在羧基和a氨基之间形成。在自然发生的聚-ε -赖氨酸的多分散性通常是在25-35个氨基酸之间。在传统的市售聚赖氨酸中，肽具有更宽的可控性不佳的多分散性，其通常含有5-500个氨基酸的任意。
[0003]交联的聚-ε -赖氨酸在结构上具有比传统的聚赖氨酸更有弹性的性质，是由于酰胺键之间更大的链长。结构上聚-eε-赖氨酸实际上是一种a-氨基的尼龙5。
[0004]目前，聚-赖氨酸是通过大规模的细菌发酵来制备用作食品防腐剂。其价格低廉并以商业数量随时可得。在本发明中，我们描述了聚-ε-赖氨酸的交联以形成不溶性聚合物支持物，其可应用于广泛的技术中。这些包括但不限于固相肽合成、固相寡核苷酸合成、固相萃取、固相试剂、物质的固定化、细胞培养、催化、色谱分析、农药的缓释、和药品的缓释、伤口护理、再生医学和医学诊断。
[0005]在固相合成过程中有用的固体支持材料是已知的。广泛的物理和化学过程采用固体支持材料，包括例如有机分子尤其是肽和寡核苷酸的合成、物质的固定化、催化剂的支持物、离子交换、从材料中提取物质、诊断和色谱分析。
[0006]通常情况下，有机分子的多级合成涉及众多的分离步骤以在进展到随后阶段之前分离在每个阶段产生的中间体。这些进程往往费时、昂贵并可能对于产率来说是低效的。中间体通常需要纯化以除去过量的试剂和反应副产物，并且可采用例如沉淀、过滤、双相溶剂萃取、固相萃取、结晶和色谱分析的步骤。
[0007]固相合成提供了超越液相合成的一些优势。例如，通过可逆地将目标分子附着于固体支持物可以在一定程度上避免液相合成中使用的分离步骤。通过过滤和洗涤固体支持物去除过量的试剂和一些副产物。目标分子可以在一些过程中以基本上定量的产率回收，这在液相合成中通常是特别困难的。此外，固体支持物上进行操作所需的时间通常远小于在液相合成中进行相应阶段所需的时间。
[0008]在一系列过程中的物质固定化也是已知的。例如，在传统的有机化学包括化学催化和生物催化中使用的催化剂的固定化通常使用聚合物支持物。也可以采用固定化的酶进行有机化学反应或手性拆分，例如固定化的青霉素酰胺酶用于仲醇的拆分(E.Baldaro等人Tet.Asym.4，1031，(1993))，以及固定化的青霉素G酰胺酶也可用于在制备阿莫西林中节青霉素的水解(Carleysmith, S.W.和 Lilly, M.D.Biotechnol.Bioeng., 21,1057-73,1979)。[0009]固体支持物也可用于在医疗和诊断应用中固定化生物大分子。这包括蛋白质、单克隆和多克隆抗体的固定化。细胞培养通常在固体支持物上进行，具有特定的表面特性和形态。在支持物上的固定化的酶也可用作传感器来产生信号。一个实例是通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶偶联酶系统检测葡萄糖，其中葡萄糖的存在产生过氧化氢，而这又是过氧化物酶的底物，所述过氧化物酶用于氧化广泛多样的底物来提供的颜色、荧光或冷光信号。
[0010]其荧光对特定的阳离子或阴离子敏感的各种荧光剂可用于指示特定离子的浓度，包括用于PH测量的氢离子。
[0011]聚合颗粒通常用于色谱分析，其中固体支持物被称为稳定相。在特定模式的色谱分析中，稳定相的成本可能是限制性的。在其他模式中，稳定相的物理性质可能降低技术的效率。例如，亲和、离子交换和凝胶渗透色谱分析中常用的软聚合物因为颗粒的可变形性质不能在高流速下使用。用于许多其他模式的色谱分析的刚性大孔聚合物往往是机械易碎的并由此遭受短的使用期的困扰。[0012]在色谱分离中固体支持物或固定相的应用是非常广泛的，例如用于制药和生物技术行业的复杂的高科技分离和用于采矿业的较大规模的过程。制药行业的一些最有价值的药物是通过制备色谱进行纯化，并且改良的色谱分离会是技术上有益的并在经济上有利的。在采矿和贵重金属回收行业中，世界上大部分的钯可使用固定化的冠醚进行精炼(refine)，钯是广泛的工业应用和过程中的关键组分，包括催化转换器和高价值产品的制造(Traczyk, F.P.;Bruening, R.L.; Izatt, N.E.〃The Application of MolecularRecognition Technology(MRT)for Removal and Recovery of Metal 1ns from AqueousSolutions"; In Fortschritte in der Hydrometallurgie; 1998, Vortrage beim34.Metallurgischen Seminar des Fachausschusses fuer Metallurgische Aus—undWeiterbildung der GDMB;18-20Novemberl998;Goslar)0
[0013]聚合颗粒在固相萃取和固相试剂制备中的用途在化学、制药和生物技术行业也是已知的。
[0014]已知的固相支持物一般包括满足所述应用的具有特定大小和物理性质的聚合物颗粒。为了方便使用，这些聚合物颗粒通常是球形，并具有确定的粒度分布。颗粒的的球形性质促进聚合物的流动和过滤的特性。尽管使用固体支持物具有操作性的优势，固相法也有缺点。
[0015]在肽合成中，聚苯乙烯被广泛用作聚合物支持物来支持增长中的肽，并且其相对廉价、非常便于获得，而且在肽合成中提供可接受的性能。肽和寡核苷酸的固相合成中常用的其它市售的支持物可能是昂贵的，例如由于复杂的制造流程。一般使用微孔聚合物和大孔聚合物。微孔聚合物具有相对低水平的交联剂，其允许聚合物颗粒在合适的溶剂中溶剂化并因而膨胀。大孔聚合物通常在聚合物基质中具有高水平的交联剂并包含大孔。这些聚合物颗粒通常是刚性的并具有良好的流动特性，而且适于在填充柱中使用。
[0016]仍然需要找到一种可选的或改进的并符合成本效益的聚合物适合在广泛的应用中用作支持物。我们现在已经发现，一种交联的聚-e -赖氨酸聚合物提供了极好的特性组合，可根据所需的属性通过适当地选择交联剂来量身定做，并可以符合成本效益地用在广泛的应用。
[0017]在第一方面中，本发明提供一种交联的聚-e -赖氨酸聚合物。[0018]交联的聚-e-赖氨酸聚合物对于为广泛应用提供支持物是特别有用的，尤其是其中交联提供一种不溶于水和其它溶剂的聚合物。当采用较低水平的交联，聚合物可溶于水而且这提供了如下所述在某些应用中的优势。适宜地，聚合物包括聚-e -赖氨酸和通过酰胺键连接的交联剂。
[0019] 所述聚合物可以是任何合适的形式，包括非颗粒的宏观形式例如片、物品、纤维，或以颗粒形式。
[0020]交联的聚-e -赖氨酸中的聚-e _赖氨酸组分是交联的聚合物的主成分。交联剂作用于将聚-e -赖氨酸聚合物连接在一起从而聚-e -赖氨酸聚合物提供一种结构，例如用于一系列应用中的格架，所述应用包括支持例如多肽和多核苷酸的有机分子合成，色谱分析，用作如下文所述的功能性材料的支持物。
[0021]聚-e -赖氨酸聚合物通过反应的交联剂适当地交联，所述交联剂具有至少两个官能团，优选地两个或更多个羧酸基团，能与聚-e-赖氨酸聚合物中的游离a氨基反应。交联剂可以具有三个或更多个官能团连接到相同数量的聚-e -赖氨酸聚合物链，或更少的链但具有多个连接到一个或多个所述链。交联剂可以含有其它官能团，其不参与交联反应，并在使用交联的聚合物时保持可用于和其他物质的反应。
[0022]聚合物支持物中的交联水平可用来控制最终的交联的聚-e -赖氨酸的物理形态和化学反应性。引进高水平的交联会产生适合用于制备大孔聚合物支持物的刚性结构，而低水平的交联会产生更软更多微孔材料。氨基功能性高与低水平的交联相伴随，其可以容易地通过控制加帽来量身定制。处理、溶剂化和物理性质也可以通过引入不同的交联剂被定义。
[0023]适宜地，交联剂包括特定的化合物或化合物组。交联剂可以包括重复单元并是多分散的，然而多分散性是窄的以确保适当的控制交联时形成的格架结构。所述交联剂包括至少两个能与聚-e-赖氨酸的a碳氨基反应的官能团。适合于此目的的常见的官能团的实例包括羧酸。
[0024]酰胺键是可生物降解的，并且本发明所述交联的聚合物以及包含其的支持物在生物可降解性尤为重要的一些应用中是特别有用的。另外，酰胺键可被代谢例如通过酶包括蛋白酶，也可被生物降解并在医疗应用中的使用特别有优势，而且特别是在人体或动物体中的医疗应用。本发明所述聚合物和支持物在医疗应用中提供益处，其中聚合物或支持物随着时间的推移适当地降解，因而不需要在其功能完成之后去除支持物的流程。
[0025]在一个特别优选的实施方案中，交联剂和聚-e -赖氨酸之间的键包括酰胺键，优选地至少1%的e氨基被交联，更优选至少50%，所需地至少90%，特别是几乎所有的键是酰胺键。
[0026]在进一步优选的实施方案中，所述聚合物是轻微交联的，并且从1%上至50 %、1-20%以及1-10%的e氨基被交联。本发明的轻度交联的聚合物和支持物在有机物质(例如肽和核苷酸序列)合成以及在递送活性物质(例如药物活性剂)中特别有用。
[0027]因此，在一个优选的实施方案中，交联剂包括两个或更多个羧酸基团和连接两个或更多个的基团的脂肪链。交联剂可以包括多元酸。在一个优选的实施方案中，交联剂包括分子式为X[C02H]n的化合物，其中n为2或更大，优选2-6，更优选为2_4，并且X是疏水性或亲水性的连接基团，优选脂肪族的。适当地，基团X具有的分子量为14-250，更优选为28-140，不包括连接基团上的任何功能取代基。
[0028]X可以包含杂原子例如氧和氮作为连接基团的骨架的部分，并且可以包含官能团用于在使用交联的聚-e -赖氨酸期间与其他物质反应。
[0029]连接酸性基团的脂族链可以是亲水的，优选双-羧基-聚亚烷基二醇，例如双-羧基-聚乙二醇，或脂族链可以是疏水的提供疏水性交联剂，例如癸二酸提供更亲脂性的支持物。交联剂可以衍生自前体材料，例如酸酐。其它合适的交联剂的例子包括次氮基三乙酸、戊二酸和 hoocch2ch2conhch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2nhcoch2ch2cooh。适宜地，交联剂的选择是根据它的溶剂化特性，从而在与聚-e -赖氨酸聚合物反应时，聚合物和交联剂都包含在分散相中，所述分散相含有用于交联剂和聚-S-赖氨酸分布在不混溶的连续相中的溶剂。
[0030]在一个优选的实施方案中，X包括烃基并且仅包括氢和碳原子，优选为2-14个，更优选3-12个，而且特别是5-8个碳原子。所述烃基可以是直链或支链的，优选为直链。所述烃基可以是饱和的或不饱和的，优选为饱和的。优选的交联剂的实例包括具有8-12个碳
原子的二羧酸，如癸二酸、十二烷酸和壬二酸。
[0031]聚-e -赖氨酸可在交联之前衍生化或被修饰以允许本领域的技术人员所熟悉的其他交联化学。聚-e-赖氨酸可以使用氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)被交联。交联的聚-e -赖氨酸在这种情况下仅在降解时只生成天然存在的氨基酸。例如与胱氨酸反应，将产生以类似的方式交联的聚合物，但在这种情况下结构中将包含半胱氨酸二硫键，其在降解时也会产生天然存在的氨基酸。
[0032]优选的交联剂的例子包括谷氨酸、胱氨酸、EDTA (乙二胺四乙酸)、己二酸、十二烷二酸、合成肽(特别是基于天然胶原蛋白结构的肽)、含有三肽序列-Arg-Gly-Asp-的合成肽、纤维蛋白原和其他天然蛋白质中的细胞结合肽、含有多个羧酸基团的天然存在的聚合物包括明胶、特别适合用于金属螯合和色谱分析的具有多个羧酸基团的藻酸和冠醚。其它合适的例子如下:
[0033]
【权利要求】
1.交联的聚-e-赖氨酸聚合物。
2.根据权利要求1的聚合物，其包含通过酰胺键连接的聚-e-赖氨酸和交联剂。
3.根据权利要求1或权利要求2的聚合物，其中所述聚合物是与交联剂交联的，所述交联剂包含能够与聚-e-赖氨酸的a碳胺反应的至少两个官能团。
4.根据前述权利要求中任一项的聚合物，其中所述交联剂包含两个或更多个羧酸基团和连接两个或更多个的基团的脂肪链。
5.根据前述权利要求中任一项的聚合物，其在水和其他溶剂中是可溶的。
6.根据前述权利要求中任一项的聚合物，其是以颗粒的形式。
7.一种颗粒状支持物，其包括根据前述权利要求中任一项的交联的聚-e -赖氨酸聚合物。
8.根据权利要求7的颗粒状支持物，其中所述交联的聚-e-赖氨酸支持物是球形、椭球形或不规则颗粒。
9.根据权利要求7或权利要求8的颗粒状支持物，其中所述交联的聚-e-赖氨酸支持物用于直接或间接包被颗粒。
10.根据权利要求7-9中任一项的颗粒状支持物，其中所述交联的聚-e-赖氨酸支持物用于包被颗粒和与颗粒共价结合。
11.根据权利要求7-10中任一项的颗粒状支持物，其中所述交联的聚-e-赖氨酸用于包被有机聚合物颗粒。
12.根据权利要求7-10中任一项的颗粒状支持物，其中所述交联的聚-e-赖氨酸用于包被无机聚合物颗粒。`
13.根据权利要求7-12中任一项的颗粒状基于交联的聚-e-赖氨酸的支持物，其中所述交联的聚-e -赖氨酸是功能化的以提供包含下述的材料:催化剂、用于肽合成的引发剂物质、用于寡核苷酸合成的引发剂物质、用于固相有机合成的引发剂物质、药物活性物质、农药活性物质、用于色谱分离的表面、促进细胞培养或分化的物质、蛋白质或其他生物大分子。
14.伤口处理产品，其包括根据权利要求1-6中任一项的聚合物或根据权利要求7-13中任一项的颗粒状支持物和用于治疗伤口的组分和/或治疗剂。
15.医学诊断剂，其包含根据权利要求7-13中任一项的颗粒状支持物并包含被所述支持物结合或保留的功能性材料。
16.根据权利要求14的医学诊断剂，其中所述功能性材料包含被所述支持物支持的酶。
17.根据权利要求7-13中任一项的颗粒状支持物在选自下述的方法中的用途:肽、寡核苷酸、寡糖的固相合成；固相萃取；固相有机合成；选自固相试剂、金属和其他催化剂、生物催化剂、酶、蛋白质、包括多克隆和单克隆抗体的抗体、完整细胞和聚合物的物质的固定化；细胞培养；用于色谱分析的稳定相的制备；或用作吸收剂或用作受控释放产品的可生物降解载体。
【文档编号】C08J3/24GK103597011SQ201280028453
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月20日
【发明者】D·威灵斯 申请人:斯菲瑞技术有限公司