一种对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列的制作方法

本发明涉及一段具有抑制免疫作用的序列，确切讲本发明涉及对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列。

背景技术：

口蹄疫是一种由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)引起的，主要危害偶蹄兽的急性、热性和高度接触性人畜共患传染病。其特征是传播途径多，传播速度快，流行范围广，传染性强，感染率高，病原变异大，危害程度烈，几乎每年都给养殖业造成巨大的经济损失。交叉保护试验和血清学试验确证口蹄疫病毒有7个血清型，即O、A、C(欧洲型)和Asia1(亚洲1型)以及STA1、STA2、STA3(南非型)。目前还没有针对该病的有效治疗药物，主要还是以预防为主。然而实验证明，各不同血清型间几乎没有交互免疫性，即一种抗血清仅能保护一种病毒类型的感染。此外，口蹄疫发病迅速,传染极快，感染动物通常在2～3天内便发生严重的疾病。灭活疫苗一般在接种7天后才能产生保护性抗体，开始发挥抗病毒作用。因此，目前的疫苗不足以应对快速的疾病爆发，需要开发更有效的抗病毒策略来解决这些问题。

技术实现要素：

本发明提供对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列，以及由这些靶序列制备的质粒，预期这些干扰靶序列和质粒能够使奶牛对口蹄疫病毒有一定抑制作用，并可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。

本发明的对口蹄疫病毒有抑制作用的干扰靶序列是位于奶牛功能基因ENTPDase6mRNA上的RNA干扰靶序列，其序列为序列表中的SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列、SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列所示的核苷酸序列。

上述的序列SEQ IDNo.1、SEQ IDNo.2和SEQ IDNo.3在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。

根据前述的SEQ IDNo.1靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQ IDNo.1片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQ IDNo.4；反义链序列为序列表中SEQ IDNo.5。

根据前述的SEQ IDNo.2靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQ IDNo.2片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQ IDNo.6；反义链序列为序列表中SEQ IDNo.7。

根据前述的SEQ IDNo.3靶序列可确定出发夹状DNA互补序列，利用合适的基因载体将该DNA序列转染至牛细胞后可以转录成发夹状双链RNA，能够与奶牛功能基因ENTPDase6中的SEQ IDNo.3片段特异性结合，从而抑制ENTPDase6的正常表达，使其表达产物量降低，进而抑制口蹄疫病毒的复制。该发夹状DNA互补序列的正义链序列为序列表中SEQ IDNo.8；反义链序列为序列表中SEQ IDNo.9。

上述的各发夹状DNA互补序列可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。

利用前述的发夹状DNA互补序列可以制备成相应的重组质粒。这些重组质粒也可在培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛中的应用。

众所周知，病毒的感染及致病性决定于病毒和机体两方面。病毒基因决定着病毒的侵入与复制能力；机体则通过主动或诱导产生的免疫物质发挥抗感染作用。因此，抗病毒感染研究也应从病毒基因和机体抗病毒基因两个方面进行研究。由于口蹄疫病毒存在多个血清型并且病毒本身容易容易变异，单纯用疫苗来预防口蹄疫的爆发难以达到理想的效果。而从动物机体本身入手，培育出具有抗病毒感染或复制的转基因动物是一个诱人的研究方向。转基因动物研究是人类按照意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，是基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程技术的一项实验技术。转基因动物的产生标志着人们可成功应用转基因技术，避开物种间杂交不育的生殖隔离，进行基因交流，打破物种界限，突破亲缘关系的限制，培育出自然界和常规育种难以产生的具特别优良性状的动物品种。

RNA干扰(RNA interference)是一种有效的基因沉默技术，可通过沉默同源病毒基因或沉默与病毒复制有关的宿主基因，抑制病毒感染，且很少出现副作用，因此是一个强有力的潜在抗病毒武器。RNAi是一种序列特异性的转录后基因沉默过程，通过21-23bp的dsRNA分子引起与其同源性的mRNA序列的降解过程。

在抗口蹄疫病毒研究方面，RNAi也起到了重要的作用，很多学者对此进行了大胆尝试。Chen等首次将RNAi技术运用到抗FMDV的研究当中，其设计的靶向FMDV VP1基因的siRNA，在BHK-21细胞中siRNA表达质粒可使FMDV VP1基因的表达降低80％～90％。接着又采用重组腺病毒载体表达siRNA，结果腺病毒能够完全抑制FMDV在细胞内的复制；在豚鼠试验中，腺病毒的抑制效应亦十分显著。随后又有许多不同国家的学者应用不同的载体对FMDV不同基因进行了干扰试验，都取得了一定的抗病毒效果。说明RNAi技术在抗口蹄疫病毒的研究中具有很大的潜力。然而这种干扰病毒基因的策略很容易受到病毒血清型及其易突变的影响。

研究表明，FMDV主要以整联蛋白为受体，包括αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8四种整联蛋白和硫酸乙酰肝素，其中αv是四种整联蛋白的共同亚基。因此可利用基因敲除技术将奶牛体内编码整联蛋白的基因敲除掉活着沉默掉，然后利用胚胎干细胞克隆技术培育出整联蛋白基因缺失的奶牛胚胎干细胞，进而培育出对口蹄疫病毒具有一定抗性的奶牛。此种抗病奶牛对口蹄疫病毒不存在血清型的差异，具有普遍的抗性，因此具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。然而对于单纯依靠沉默病毒受体基因进行抗病育种来说并还未见有取得突破性的进展相关的报道。可能是由于受体基因本身对于动物机体的组成成分、新陈代谢及其它生理功能有重要的作用。

在动物机体内寻找与病毒的感染、复制、组装及释放相关的基因对抗病育种极其重要，可以通过沉默或修饰这些基因来达到抗病育种的目的。最近研究表明，破坏掉ENTPDse6基因可以一定程度上抑制口蹄疫病毒在牛细胞内的复制。ENTPDse6，即CD39L2，属于胞外核苷三磷酸-二磷酸水解酶家族，是一种完整的可以水解膜外核苷酸的等离子膜蛋白，已经证实在心脏、脑、肺脏、肝脏、骨骼肌及内皮组织中都有表达。ENTPDse6可以影响宿主蛋白糖基化必须的核苷数量，而这些宿主蛋白对于FMDV的复制或其它基本产生步骤是必需的。故可以考虑对此基因进行沉默改造，对抗口蹄疫育种来说无疑是种新的路径。

本发明的发明思路为：

RNA干扰通过21-23bp的dsRNA分子引起与其同源的mRNA序列的降解，是一种序列特异的转录后基因沉默过程。由于哺乳动物细胞最有效的siRNA是21-23个碱基大小、3′端有两个突出碱基的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默效果，并且受GC含量、自身稳定性及其他同源序列等因素的影响。因此，通常需要利用专门的设计工具来设计siRNA，直接合成siRNA价格昂贵且不稳定，所以根据载体需要设计合成与之互补的DNA，然后连接到载体上，使得操作能在DNA水平上进行。将合成的DNA片段连接到商品化质粒载体上，构建成含有与靶片断同源DNA片段的重组载体，然后将含有不同DNA片段的重组载体单独或混合转染至对口蹄疫病毒敏感的牛肾细胞，转录后形成针对靶序列的发夹状dsRNA。用不同血清型的口蹄疫病毒进行攻毒实验并检测含有重组载体的牛肾细胞对口蹄疫病毒的抵抗作用，进而选出抗病毒效果好的RNA干扰的靶位点。利用商品化的质粒载体能够简单快捷的验证所干扰的ENTPDse6中靶片段对抗口蹄疫病毒的有效性，可以为后续的培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛的打基础。

本发明首先对牛的ENTPDase6基因进行RNA干扰，筛选有效的干扰位点。经过实验筛选确定出本发明的3个干扰位点，即在奶牛的ENTPDase6基因中分别由靶序列SEQ IDNo.1、SEQ IDNo.2和SEQ IDNo.3所确定的位置，能够表现出较好的抗口蹄疫病毒效应。

本发明所中RNA干扰针对的是奶牛功能性基因，而非结构性基因。实验证实对ENTPDase6基因中的这三个位置进行干扰不会引起牛细胞的明显损伤，因此能大大提高转基因抗口蹄疫病毒奶牛培育的安全性和可行性。

本发明所涉及的靶序列不受口蹄疫病毒血清型的限制，对多种血清型的口蹄疫病毒都有不同程度的抑制作用，并且不易受口蹄疫病毒变异性强特性的影响。

本发明针对的是抑制口蹄疫病毒在细胞内的复制过程，而非病毒入侵过程。可以与沉默病毒受体基因的策略相互补充，加快培育转基因抗口蹄疫病毒奶牛的进程。

本发明所用技术路线均为目前较为成熟且普遍应用的技术，可操作性强。

附图说明

图1为pSilencer 4.1-CMV puro载体图谱；

图2为重组质粒BamHⅠ、HindⅢ双酶切及BamHⅠ、HindⅢ单酶切图；

图3为嘌呤霉素抗性条件下转染重组质粒及正常MDBK细胞图；

图4为转染重组质粒及正常MDBK细胞Western-blot图谱；

图5为靶序列基因沉默后对不同血清型FMDV的抑制效果图；

具体实施方式

本发明具体实施方式所用材料及设备来源：

1、细胞和病毒：牛肾细胞(MDBK)，A型，O型，亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒。

2、所用菌种和载体：大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自于大连宝生物公司)，载体pSilencer^TM4.1-CMV puro(购自于吉泰生物科技有限公司)。

3、工具酶和生化试剂：普通质粒小提试剂盒，氨苄青霉素，T4DNALigase,BamHⅠ,HindⅢ,DNAMarker(均购于TaKaRa公司)；脂质体Lipofection 2000购自GIBCO公司；嘌呤霉素(Puromycin)购自Amersco公司；细胞培养用DMEM，胎牛血清购自TBD公司；其它试剂均为国产和进口分析纯。

4、设备和器材

GHP-9080隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；

SWCJ-1F超净工作台，苏净集团安泰公司；

HH.S-1-Ni电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂；

MICROCL 17微量离心机，上海迭戈生物科技有限公司；

XDS-1B倒置生物显微镜，北京佳源兴业科技有限公司；

SWCJ-1CU洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

DYCP-31DN型电泳槽，北京六一仪器厂；

DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂；

JY04S-3C凝胶成像分析系统,北京君益东方电泳设备有限公司。

美国Shellab二氧化碳培养箱，上海普林斯顿生物科技发展有限公司；

实施例1：本发明中重组载体具体构建及制备方法：

1、siRNA模板设计

从GeneBank中下载牛ENTPDase6基因的mRNA序列(GeneBank登录号：NM_001045991)，利用siRNA设计软件筛选出以下三个干扰靶片段：

SEQ ID No.1：AATGTACAGTTCTCGAAATAA

SEQ ID No.2：AAGTGCTCATGCAGAAGCTGT

SEQ ID No.3：AAGCCAGGTCTTTCTGCTTAT

根据pSilencer 4.1-CMV载体(图1)要求，确定分别针对上述各靶序列RNA干扰序列模板，人工合成这些长度为55bp的DNA序列：

(1)根据SEQ ID No.1确定的发夹状DNA互补序列

SEQ ID No.4：

正义链：

5'-GATCCTGTACAGTTCTCGAAATAATTCAAGAGATTATTTCGAGAACTGTACATTA-3'SEQ ID No.5：

反义链：

5'-AGCTTAATGTACAGTTCTCGAAATAATCTCTTGAATTATTTCGAGAACTGTACAG-3'

(2)根据SEQ ID No.2确定的发夹状DNA互补序列

SEQ ID No.6：

正义链：

5'-GATCCGTGCTCATGCAGAAGCTGTTTCAAGAGAACAGCTTCTGCATGAGCACTTA-3'SEQ ID No.7：

反义链：

5'-AGCTTAAGTGCTCATGCAGAAGCTGTTCTCTTGAAACAGCTTCTGCATGAGCACG-3'

(3)根据SEQ ID No.3确定的发夹状DNA互补序列

SEQ ID No.8：

正义链：

5'-GATCCGCCAGGTCTTTCTGCTTATTTCAAGAGAATAAGCAGAAAGACCTGGCTTA-3'SEQ ID No.9：

反义链：

5'-AGCTTAGCCAGGTCTTTCTGCTTATTCTCTTGAAATAAGCAGAAAGACCTGGCG-3'

2、重组载体构建

(1)退火条件：将上述合成DNA单链溶于退火缓冲液，使浓度为1ng/μL。等体积混合，90℃3min，37℃1h退火，形成具有与pSilencer 4.1-CMV载体对应的粘性末端的双链DNA。

(2)连接体系：取上述退火后DNA溶液1μL，pSilencer 4.1-CMVvector 1μL，10×T4DNA Ligase Buffer 1μL，T4DNAligase(5U/μL)1μL，Nuclease-free Water 6μL，混合均匀，16℃过夜连接。

3、制备培养基及转化平板：

(1)LB液体培养基配制(400ml)：Tryptone 4g,Yeast Extract 2g,NaCl 4g,加300mlddH2O，充分搅拌使其溶解，滴加5N NaOH约80μL，调节PH约7.0，加ddH2O定容至400ml。121℃，0.1MPa，高压灭菌20min，4℃保存备用。

(2)含抗生素(氨苄青霉素)的LA固体培养基配制(400ml)：Tryptone 4g,Yeast Extract 2g,NaCl 4g，Agra powder 4.8g，加300mlddH2O，充分搅拌使其溶解，滴加5N NaOH约80μL，调节PH约7.0，加ddH2O定容至400ml。121℃，0.1MPa，高压灭菌20min，冷却至60℃左右，在超净台内向其加入抗生素(氨苄青霉素)200μL，混匀后倒平板，4℃保存备用。

4、转化感受态细胞DH5α

(1)将5μL上述连接产物加入50μL感受态细胞DH5α中，混匀，冰浴30min；

(2)42℃热应激90s，然后立即冰浴3min；

(3)加入300μL提前37℃预热好的不含抗生素的LB培养基中，37℃，150rpm摇床培养1h；

(4)取200μL(3)中LB培养基涂转化平板，干燥后，37℃倒置平板培养约14h。

(5)挑取靠近平板中部，中等大小的单个菌落接种到含有氨苄的LB液体培养基中，37℃摇床，150rpm培养约14h。

5、质粒提取、双酶切鉴定及测序

(1)按照质粒小提说明书从上述(5)中菌夜中提取质粒，并按照50％甘油和菌液1:1的比例于-20℃保存菌种。

(2)对质粒做BamHⅠ，HindⅢ双酶切实验，向灭菌的1.5ml EP管中依次加入上述质粒DNA 10μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL，10×K buffer 2μL，ddH2O补足总体系至20μL，混匀；37℃水浴条件下酶切2h，70℃10min终止酶切。

(3)对上述双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对酶切结果理想的重组质粒送至金唯智生物公司测序。

6、重组质粒的大量制备

(1)从－20℃保存的甘油菌吸取50μL测序结果正确的菌液，接种到3-4mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600大于1.6-1.8。

(2)取1mL的菌液于400mL LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600大于2.0以上。再加入氨苄青霉素至170μg/mL，37℃振荡培养摇15h。

(3)按照Promega Midiprep System说明书从上述菌液中提取质粒，-20℃保存备用。

重组质粒双酶切结果如图2所示，泳道1-4分别为：BamHⅠ，HindⅢ双酶切；BamHⅠ单酶切；HindⅢ单酶切；5000marker。质粒载体全长4781bp，接近5000bp；连接片段仅为55bp(电泳图中观察不到)。另外质粒测序结果完全符合理论值，证明已经成功构建出上述重组载体。

实施例2：细胞转染及筛选实验

1、材料

(1)细胞和载体

MDBK细胞(实验室保存)，重组质粒载体pSilencer-SEQ4、pSilencer-SEQ5、pSilencer-SEQ6；

(2)试剂

无血清DMEM培养基，10％胎牛血清，脂质体转染试剂盒Lipofection Reagent 2000均购自GIBCO公司；嘌呤霉素(Puromycin)购自Amersco公司；胰蛋白酶购自Promega公司，其他试剂为国产和进口分析纯。

2、实验设备和器材

6孔细胞培养板，美国Corning公司；

XDS-1B倒置生物显微镜，北京佳源兴业科技有限公司；

HH.S-1-Ni电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂；

SWCJ-1CU洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞瓶、移液枪、EP管等常用的实验室器材。

3、实验方法

(1)提前24h，将牛肾细胞按照3×10⁵的密度接种到6孔细胞培养板上。

(2)制备转染液：在EP管中制备以下两液，为每一个孔细胞所用的量。

A液：不含血清的培养基94μL+上述三种重组质粒各2μL，终量100μL，(温育5min)；

B液：不含血清培养基95μL+5μL lipofectamine 2000，终量100μL。

(3)轻轻混合A、B液，室温条件下放置20min。

(4)将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍，加入1ml无血清培养基。

(5)将A液与B液的混合液逐滴加入孔中，轻轻摇动培养板，混匀。37℃，5％CO2培养箱中保温6小时。

(6)6小时后，更换含有血清的完全培养基，在37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，以1：10的稀释比例接种到新的细胞培养板中。

(7)加嘌呤霉素进行筛选培养，用含嘌呤霉素终浓度为4μg/ml的无血清培养基连续培养24h，然后用嘌呤霉素终浓度为3μg/ml的完全培养基连续传代培养5-6代。

4、实验结果

如图3所示，图为转染重组质粒和未转染的MDBK细胞的生长状况图。经过嘌呤霉素抗性筛选，对照组细胞已经大部分细胞在48h内变圆脱落，而转染重组质粒的细胞传代5-6代仍生长良好。

5、结论

结果表明已经成功将重组质粒载体导入MDBK细胞，在有嘌呤霉素选择压力存在的情况下，重组质粒可以在细胞内持续存在并能稳定表达。

实施例3：SDS-PAGE及Western-blot的鉴定分析

1、材料

(1)细胞

正常MDBK细胞，转染重组质粒后传至第6代的MDBK细胞。

(2)试剂

PBS，SDS Buffer，分离胶和浓缩胶，脱色液；抗ENTPDase6多克隆抗体，酶标二抗(实验室保存),其它试剂均为国内及进口分析纯。

2、实验设备和器材

MICROCL 17微量离心机，上海迭戈生物科技有限公司；

LBC-20BA2电磁炉，广东洛贝电子有限公司；

WD9405B水平摇床，北京市六一仪器厂；

164-5050电泳仪、电泳槽，美国BIORAD；

JY300C型转移电泳仪，北京君意东方电泳设备有限公司；

超低温冰箱，美国热电公司；

3、实验方法

(1)样品处理：收集转染重组质粒的第6代MDBK阳性细胞以及正常的MDBK细胞，以800rmp，4min离心收集细胞，用PBS洗涤MDBK阳性细胞3次尽量除去残留的培养基。加入100μL PBS重新悬浮细胞，在-80℃条件下速冻速融三次，然后加入100μL2×SDS Buffer[50mmol/L Tris-HCL pH6.8；100mmol/L二硫苏糖醇(DTT)；2％SDS；0.1％溴酚蓝；10％甘油]使其充分与PBS-细胞悬浮液充分混合，煮沸10min，12000rmp离心获得上清。

(2)制备12％的分离胶和5％的浓缩胶及电泳缓冲液：

5ml 12％的分离胶配方：ddH2O 2.17ml；40％胶溶液1.5ml；1.5M Tris HCl(PH 8.8)1.25ml；10％SDS 50μL；10％APS 25μL；TEMED 2.5μL。

5％的浓缩胶配方：ddH2O 3ml；40％胶溶液625μL；0.5M Tris HCl(PH 6.8)1.25ml；10％SDS 50μL；10％APS 25μL；TEMED 5μL。

SDS-PAGE电泳缓冲液配方：甘氨酸4.32g；Tris碱0.91g，10％SDS 3ml；ddH2O定容至300ml。

(3)利用微量加样器取上述样品20μL上样，开始时以80伏电泳，待样品进入分离胶后调至120伏，继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部，电泳结束，取下凝胶，考马斯亮蓝[25％异丙醇(V/V)，10％(V/V)冰醋酸，0.1％(W/V)考马斯亮蓝R-250]染色2h后移出染色液，用脱色液[10％(V/V)冰醋酸，5％(V/V)乙醇]脱色，其间更换脱色液2～3次，直至脱色充分，观察电泳情况。

(4)配制Western Blot相关液体：

转移缓冲液(1L)：2.93g甘氨酸，5.28g Tirs碱，0.37g SDS，200ml甲醇，ddH2O定容至1L；

免疫印迹底物溶液：30ml PBST中溶解15mg DAB(二甲基联苯胺)，9mg CoCl2·6H2O，10μL 30％的H2O2混合。

(5)转膜：将SDS-PAGE后的聚丙烯酰胺凝胶用去离子水冲洗后3次，平放于用转移缓冲液预湿的硝酸纤维素(NC)膜上，除尽气泡。在硝酸纤维素膜下和凝胶上分别放置用转移液预湿的四张准确对齐或略小于硝酸纤维素膜和凝胶大小的滤纸，置于半干式电转移仪中，使得凝胶在负极，NC膜在正极，冰浴，横流120mA转印150min。

(6)切取含有蛋白分子量标准的纤维素膜，用氨基黑染色5min，再用脱色液脱色。余下的含有检测样品的纤维素膜用PBST充分漂洗三次后，加入5％的脱脂奶粉过夜封闭，然后用20ml PBST洗膜三次，加入用封闭液1∶150稀释的抗ENTPDase6多克隆抗体，25℃作用1h。用PBST在摇床上洗膜4～5次，加入1∶20000稀释的酶标二抗，室温孵育1h，用PBST漂洗3次。加入15ml底物溶液避光显色数秒后，用去离子水终止反应，观察结果。

4、实验结果

如图4所示，图中1、2、3分别为标准蛋白、转染重组载体的MDBK细胞蛋白、正常MDBK细胞蛋白。目标蛋白ENTPDase6大小为56kDa。

5、实验结论

与正常MDBK相比，转染重组载体的MDBK的ENTPDase6表达量明显降低，说明重组载体在牛肾细胞内能够干扰ENTPDase6基因的正常表达，使其表达量有所降低。

实施例4：攻毒及检测实验

1、材料

(1)细胞和病毒

正常及转染重组载体的MDBK细胞，BHK-21细胞，A、O、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(实验室保存)；

(2)试剂

DMEM培养基，10％胎牛血清，Hanks液，其他试剂均为国内和进口分析纯。

2、实验设备和器材

96孔细胞培养板，美国Corning公司；

LD4-2低速离心机，北京医用离心机长；

XDS-1B倒置生物显微镜，北京佳源兴业科技有限公司；

SWCJ-1CU洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞瓶、移液枪、EP管等常用的实验室器材。

3、实验方法

(1)第6代MDBK阳性细胞以及正常的MDBK细胞培养20-24h后，用4×10²TCID50/孔的FMDV感染，37℃，5％CO2温箱中孵育1h，使病毒感染细胞，对A、O、亚洲Ⅰ型三个不同血清型FMDV做平行实验。

(2)1h后，以800rmp，2min离心收集细胞，用冲洗缓冲液(150mM NaCl,20mM吗啉乙磺酸酸，PH 6.0)冲洗以杀死培养基及细胞表面的残留病毒，然后换以新鲜DMEM培养基连续培养。

(3)收集不同时间段的细胞培养上清液(病毒液)，滴定BHK-21细胞，以测定不同时间段上清液的TCID50。

(4)根据Reed-Muench法测定病毒的TCID50。具体方法如下：

①每孔1ml已培养好的BHK-21细胞，37℃5％CO2培养箱中培养到细胞长成单层。

②将上述病毒液用维持液作10倍系列稀释，使其浓度分别为10^-1、10^-2…10^-10。

③弃去BHK-21细胞培养板上的生长液，用Hanks液洗涤3次，每孔加入不同稀释度的病毒液1ml，每个稀释度3-4个孔，对照孔加1ml维持液，37℃5％CO2培养箱中吸附1h，吸出毒样后补加1ml维持液。轻轻摇匀，37℃5％CO2培养箱中培养。逐日观察各孔的细胞病变情况，连续观察4天。

④细胞全部出现CPE为(++++)；50％-70％细胞出现CPE为(+++)；2％-50％细胞出现CPE为(++)；25％以内细胞出现CPE为(+)；无CPE为(-)，按Reed-Munch计算法进行TCID50。

4、实验结果

如图5所示，图5(A)、5(B)、5(C)分别表示用不同血清型FMDV(A型、O型、亚洲Ⅰ型)对MDBK细胞攻毒后的不同时间细胞培养液的TCID50，可以反应出MDBK细胞的排毒情况。

由图5可以看出，转染重组载体的MDBK细胞在攻毒后的不同检测时间内，其培养液中的病毒量都明显低于正常MDBK细胞。本实验证明上述三种靶序列被干扰后能够一定程度上抑制口蹄疫病毒在MDBK细胞内的复制，在抗口蹄疫病毒转基因奶牛培育方面有很好的应用潜能。