高稳定性的人胰蛋白酶突变体的制作方法

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及高稳定性的人胰蛋白酶突变体。

背景技术：

自从体外重组技术自70年代成熟应用至今，大量的体内蛋白被重组克隆。重组蛋白相比于从动物体内提取的蛋白，有几大明显的优势：首先不涉及动物来源，无动物源性生产过程；其次，背景清楚，纯度高，适合重组药物生产，无血清培养等。

胰蛋白酶在临床的肿瘤免疫治疗，组织培养、人用疫苗的生产等过程均不可缺少，现用胰蛋白酶为动物源性，有病毒污染的可能性，从而导致人蓄共患病的传播，采用无动物源性的重组胰蛋白酶是解决这一问题的根本方案。

在2014年，美国药典对于应用于生物制药过程中的重组胰蛋白酶，给出了重组胰蛋白酶最新的检测标准。在皮肤组织细胞培养过程中，无动物源性的产品越来越受到的青睐。Went等人分别用提取的动物源性的胰蛋白酶和重组胰蛋白酶消化表皮层中的角质层细胞。表明重组胰蛋白酶消化后皮肤组织细胞的生长情况要明显优于动物源性胰酶处理后的细胞。

综上，本领域需要大规模生产人来源的胰蛋白酶。但是天然的人胰蛋白酶酶的活性低、稳定性差，大大限制了其推广应用。因此，本领域迫切需要找到提高其稳定性的有效手段。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高稳定性的人胰蛋白酶突变体。

在本发明的第一方面，提供人阴离子胰蛋白酶的突变体，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys。

在一个优选例中，所述突变体的氨基酸序列还包括：对应于SEQ ID NO:1，第206位由Ser突变为Cys；或第122位由Arg突变为Leu；并且，所述的突变体不是氨基酸序列如SEQ ID NO:1氨基酸序列且第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys的突变体。

在另一优选例中，所述突变体是：

如SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys、第121位由Ser突变为Ala第122位由Arg突变为Leu(简称S139C-S206C-S121A-R122L)；或

如SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第122位由Arg突变为Leu(简称S139C-S206C-R122L)；或

如SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但其中第139位由Ser突变为Cys、第206位由Ser突变为Cys和第121位由Ser突变为Ala(简称S139C-S206C-S121A)；或

如SEQ ID NO:1的氨基酸序列，但其中第121位由Ser突变为Ala和第122位由Arg突变为Leu(简称S121A-R122L)。

在另一优选例中，S139C-S206C-S121A-R122L在pH3-11，25℃保存2h，酶的活力均保持在80％以上；pH3，60℃保存12h残余酶活仍可保持在70％以上；其高温耐受性及pH耐受性极佳。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的人阴离子胰蛋白酶的突变体的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的人阴离子胰蛋白酶突变体的用途，用于酶解蛋白质或者变性蛋白质，或用于细胞培养过程。

在本发明的另一方面，提供一种提高重组的人阴离子胰蛋白酶稳定性的方法，所述方法包括：将人阴离子胰蛋白酶的第121位由Ser突变为Ala和/或第122位由Arg突变为Leu。

在一个优选例中，还包括将人阴离子胰蛋白酶的第139位由Ser突变为Cys和/或第206位由Ser突变为Cys。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、四种胰蛋白酶的一级序列比对。ht1为人阳离子型胰蛋白酶；ht2为人阴离子型胰蛋白酶；bt1为牛胰蛋白酶(SEQ ID NO:3)；pt1为猪胰蛋白酶(SEQ ID NO:4)。

图2、mhTg2-S139C-S206C蛋白电泳表达鉴定(a，b)及Western blot结果(c)。mhTg2表示突变型人阴离子胰蛋白酶。

(a-b)S139C-S206C蛋白电泳表达鉴定结果；(a)中，lane 1、3、5：S139C-S206C-JM109(DE3)诱导前；lane 2、4、6：S139C-S206C-JM109(DE3)诱导后；lane 7、9、11：S139C-S206C-Rosetta(DE3)诱导前；lane 8、10、12：S139C-S206C-Rosetta(DE3)诱导后；(b)中，lane 1、3：37℃上清；lane 2、4：37℃沉淀；lane 5：25℃上清；lane 6：25℃沉淀；lane 7：15℃上清；lane 8：15℃沉淀。

(c)S139C-S206C Western blot作用结果；lane 9、12：诱导后；lane 10、13：上清；lane 11、14沉淀；M：Maker。

图3、S139C、S139C-S206C-R122L表达鉴定结果。

lane 1：S139C，诱导前；lane 2-4：S139C诱导后；lane 5：S139C-S206C-R122L诱导前；lane 6-12S139C-S206C-R122L诱导后；M:Marker。

图4、S139C及S139C-S206C-R122L的洗脱曲线及电泳图。

(a)S139C的洗脱曲线。

(b)S139C-S206C-R122L的洗脱曲线。

(c)S139C和S139C-S206C-R122L的纯化电泳图，lane1：S139C纯化电泳图；lane 2：S139C-S206C-R122L纯化电泳图；M：Maker。

图5、S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S121A、S139C-S206C-S121A-R122L表达鉴定结果。

(a)lane 1：S139C-S206C-S121A诱导前；lane 2-4：S139C-S206C-S121A诱导后；lane 5：S121A-R122L诱导后；lane6-12S139C-S206C-S121A-R122L诱导后；M：Maker；

(b)lane 1：S121A诱导前；lane 2-9：S121A诱导后；M:Maker。

图6、洗脱曲线及纯化鉴定。

S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L、S121A-R122L和S121A的纯化电泳图：lane1：S139C-S206C-S121A；lane2：S139C-S206C-S121A-R122L；lane3：S121A-R122L；lane4：S121A；(b)S139C-S206C-S121A洗脱曲线；(c)S139C-S206C-S121A-R122L洗脱曲线；(d)S121A-R122L洗脱曲线；(e)S121A洗脱曲线。

图7、S139C和S139C-S206C-R122L的pH稳定性。

图8、S121A、S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L和S121A-R122L的pH稳定性。

图9、S139C和S139C-S206C-R122L的温度稳定性。

(1)：S139C；(2)：S139C-S206C-R122L。

图10、S121A(1)、S139C-S206C-S121A(2)、S139C-S206C-S121A-R122L(3)和S121A-R122L(4)的温度稳定性。

图11、hT1、hT2S121A；2：S139C-S206C-S121A；3：S139C-S206C-S121A-R122L；4：S121A-R122L温度稳定性比较(60度，12h)。

图12、hT2、R122L、mhT2-S139C、mhT2-S139C-S206C-R122L HPLC结果。

A：S139C-S206C-R122L；B：R122L；C：S139C；D：hT2WT。

图13、hT2、R122L、S121A、S121A-R122L、S121A-S139C-S206C及S139C-S206C-S121A-R122L温度稳定性的HPLC检测。

A：S121A-R122L；B：S139C-S206C-S121A-R122L；C：R122L；D：S139C-S206C-S121A；E：S121A；F：hT2 WT。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，意外地发现人阴离子胰蛋白的一些位点与其对热或pH值的稳定性相关，所述位点是第121位或第122位，在此基础上获得了一类人阴离子胰蛋白突变体，与野生型相比，所述突变体具有较高的稳定性。并且，人阴离子胰蛋白在前述突变基础上再结合第139位或206位的选择性突变使得效果更为理想。

如本文所用，除非另外说明，所述的“人阴离子胰蛋白酶的突变体”、“人胰蛋白酶的突变体”、“mhTg2”、“突变型人阴离子胰蛋白酶的突变体”、“突变型hTg2”可互换使用，是指对应于野生型人阴离子胰蛋白酶(如SEQ ID NO:1)，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys；更佳地还包括对应于SEQ ID NO:1第206位由Ser突变为Cys或第122位由Arg突变为Leu构成的蛋白。

若需要表示野生型的人阴离子胰蛋白酶，其将被标示为“野生型人阴离子胰蛋白酶”、“hTg2”或“野生型蛋白”，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

如本文所用，所述的“人阴离子胰蛋白酶(或突变体)活性”是以酶的活力单位来定义的。酶的一个活力单位(1U)定义为25℃，pH7.6条件下，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-arginine ethyl ester，BAEE)使253nm下的吸收值增加0.001定义为一个BAEE单位。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的人阴离子胰蛋白酶突变体”是指人阴离子胰蛋白酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化人阴离子胰蛋白酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述人阴离子胰蛋白酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人阴离子胰蛋白酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的人阴离子胰蛋白酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，对应于野生型人阴离子胰蛋白酶，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys；更佳地对应于SEQ ID NO:1第206位由Ser突变为Cys或第122位由Arg突变为Leu。

在本发明中，术语“人阴离子胰蛋白酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人阴离子胰蛋白酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，对应于野生型人阴离子胰蛋白酶，第121位由Ser突变为Ala和/或第139位由Ser突变为Cys；更佳地对应于SEQ ID NO:1第206位由Ser突变为Cys或第122位由Arg突变为Leu。

本发明还提供了编码本发明人阴离子胰蛋白酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明的人阴离子胰蛋白酶突变体核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或人阴离子胰蛋白酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的人阴离子胰蛋白酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人阴离子胰蛋白酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人阴离子胰蛋白酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人阴离子胰蛋白酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

作为本发明的另一个实例，通过基因工程手段生产人阴离子胰蛋白酶突变体，比如利用任何适宜的基因工程菌生产所述的人阴离子胰蛋白酶突变体，分离所述的人阴离子胰蛋白酶突变体。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为本发明的优选方式，所述的突变体是含有S121A或R122L或它们的复合突变体、含有S139C-S206C与S121A和/或R122L的复合突变体，这些人阴离子胰蛋白酶突变体具有良好的稳定性，表现为温度稳定性较为理想，pH稳定性较为理想，且生物活性高。因此，该突变体对于拓宽胰蛋白酶的实际应用具有重要价值。

对本发明的突变体进行HPLC分析，得到峰型单一的β-trypsin，不含有或较少含有降解的α-trypsin。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、突变体S139C-S206C的表达及鉴定

1、点突变设计

在野生型人阴离子胰蛋白酶序列的基础上，设计多种点突变，突变体如下：

(hT2-)S139C突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第139位由S突变为C；

(hT2-)S139C-S206C突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第139位由S突变为C，第206位由S突变为C；

(hT2-)S139C-S206C-R122L突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第139位由S突变为C，第206位由S突变为C，第122位由R突变为L；

(hT2-)S121A突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第121位由S突变为A；

(hT2-)R122L突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第122位由R突变为L；

(hT2-)S139C-S206C-S121A突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第139位由S突变为C，第206位由S突变为C，第121位由S突变为A；

(hT2-)S121A-R122L突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第121位由S突变为A，第122位由R突变为L；

(hT2-)S139C-S206C-S121A-R122L突变体：在SEQ ID NO:1(ht2)基础上，第139位由S突变为C，第206位由S突变为C，第121位由S突变为A，第122位由R突变为L。

hT1-C139S-C206S突变体：在SEQ ID NO:2(ht1)基础上，第139位由C突变为S。

交由生工生物技术有限公司制备上述点突变的多肽的编码序列(经大肠杆菌偏好的密码子优化)，插入到pET-32a质粒的NdeI/Hind III位点中，测序正确后，可得到点突变的重组质粒，用于重组表达。

2、重组质粒的表达鉴定

将前述制备的插入了点突变的人阴离子胰蛋白酶的编码序列的重组质粒，转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。涂板后放入37℃恒温培养箱中，倒置培养12-16h。分别挑取单菌落置于30ml摇瓶中，待OD600＝0.5-0.6时，加入IPTG诱导，37℃培养4h后，进行SDS-PAGE鉴定。结果见图2。

3、超声破碎

将诱导培养后的菌液，于3000rpm离心20min，收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl pH 8.0缓冲液将菌体充分悬浮。将悬浮好的菌液置于超声破碎仪中，工作5s，间隔5s，超声功率200W，循环99次。将破碎后的菌液于12000rpm，4℃离心10min，分离上清沉淀。分别取上清沉淀进行SDS-PAGE鉴定。

4、Western blot的实验步骤

将蛋白电泳胶置于PVDF膜上，用滤纸覆盖，置于电转槽中转移1-2小时(1mA-2mA/cm2，10％gel)，转移结束后加入含有5％脱脂牛奶的封闭液，室温孵育1小时后，加入稀释后的一抗，室温孵育1小时，洗掉一抗后，根据所加的一抗加入稀释后的二抗孵育2小时，后经ECL显色显影定影，观察结果。结果见图3。

5、结果

将包含编码突变体S139C-S206C的质粒转化至大肠杆菌JM109(DE3)及Rosetta(DE3)表达菌中进行表达鉴定，如图2(a)所示，未见明显的表达条带。但是通过诱导后和诱导前的泳道相比较来看，在14kDa以下有很明显的降解条带。

将S139C-S206C基因克隆至pET-32a质粒上，分别选用15℃、25℃、37℃温度条件下进行诱导表达鉴定，如图2(c)。发现在15℃及25℃下的沉淀中14kDa以下有明显的一条表达条带，但与目的蛋白位置29kDa处不符。37℃中，29kDa以上的沉淀中有一条较深的条带，但在后续试验中没有得到大量的沉淀。后进行了Western Blot鉴定(图2(b))。结果表明，在25℃沉淀中可以见到少量的表达，并且有很明显的小分子条带，由此推断，可能是S139C-S206C在表达过程中极其不稳定，从而会发生降解。

实施例2、突变体S139C、S139C-S206C-R122L的表达

按照实施例1的方法进行构建和表达鉴定。结果见图3。

通过将诱导前后的泳道进行比较后可以看出，S139C突变体及S139C-S206C-R122L突变体在29kDa左右有一条很明显的表达条带，其表达量约为占总蛋白量的60％以上。

实施例3、S139C和S139C-S206C-R122L的纯化

1、包涵体的洗涤及复性

将破菌得到的沉淀重新悬浮于含有0.5％Triton X-100(v:v)，20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA的溶液中，室温下搅拌1h后，于12000rpm、4℃离心10min去上清，收集沉淀后再重悬于20mmol/L Tris-HCl pH 8.0溶液中重复上述步骤两次。最后将洗涤干净的包涵体用8M Urea溶液溶解，进行稀释复性。

2、纯化预处理

通过酶活测定及SDS-PAGE检测复性液中酶活性及激活情况。将复性液12000rpm离心去除沉淀，上清液以1：10(v:v)对1mmol/L HCl透析。透析6h换外液一次，共更换4次。将透析后的复性液进行下一步纯化。

3、CM-FF离子交换层析

采用2×15cm层析柱，预先加入1/10柱体积的水，封闭出口，将CM-FF吸附树脂用水悬浮成50％(v:v)的溶液，使用玻璃棒引流装入层析柱中。使用2倍柱体积的水冲洗后用0.5M NaOH溶液慢速处理1-2h。用5倍柱体积的水冲洗至中性，再用1M NaCl慢速处理2柱体积。用20mmol/L NaAc-HAc pH 5.0缓冲液平衡10柱体积，将复性液用200Mmol/L NaAc调至pH 5.0，连接紫外检测器开始上样。上样结束后用20mmol/L NaAc-HAc pH 5.0缓冲液平衡2柱体积。洗脱时使用10倍柱体积含0～500mmol/L NaCl的20mmol/L NaAc-HAc pH 5.0缓冲液连续梯度洗脱。根据紫外检测器数值变化收集目的峰，依次测定每管OD280和酶活，并计算蛋白的回收率。

4、人胰蛋白酶活力的检测

本发明中采用的是N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(N-benzoyl-L-arginine ethyl ester，BAEE)作为底物检测人胰蛋白酶活力。由于人胰蛋白酶可特异性水解精氨酸碳末端的肽键，故可将N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)降解为N-苯甲酰-L-精氨酸(benzoyl-L-arginine，BA)。在253nm波长下，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)的吸收值远远小于其降解物N-苯甲酰-L-精氨酸(benzoyl-L-arginine，BA)。在一定的条件下，随着催化反应的进行，产物BA逐渐增多，体系的紫外吸收值逐渐增加，最后以253nm下紫外吸收值的变化量△A253nm计算人胰蛋白酶的活性，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。酶活性的换算标准为1 USP Unit等于3 BAEE Units。在配制BAEE底物时，使用的缓冲液为25mmol/L Tris-HCl pH7.6含有0.1mol/L NaCl及0.01mol/L CaCl2。底物的工作浓度为25mmol/L，测活温度为25℃。

5、结果

结果如图4所示。经过CM-FF离子交换层析，得到了较为纯净的蛋白，在洗脱的过程中发现，突变体S139C在100mmol/L NaCl附近会洗脱下一小峰，基本没有酶活，可能是降解下来的小肽。突变体S139C-S206C-R122L则出峰比较单一，且洗脱峰相对较早期结合能力稍弱于突变体S139C。

经过蛋白电泳鉴定，两种蛋白的纯度都达到了预期目标，纯化后测得S139C和S139C-S206C-R122L的比活分别为16018.2U/mg和10332.1U/mg。

实施例4、突变体S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S121A、S139C-S206C-S121A-R122L的表达及纯化

突变体S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S121A、S139C-S206C-S121A-R122L的重组表达及鉴定方法按照实施例1进行。

将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌中，进行表达鉴定，结果如图5所示，在29kDa附近，突变体S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S139C-S206C-S121A-R122L及S121A均得到了表达。在实施例1中无法得到完整的表达的S139C-S206C突变体，但是这里加入S121A突变后，得到了S139C-S206C-S121A的表达，可见，S121A对于稳定蛋白表达起到了显著性的作用。

纯化方法参照实施例3进行，结果见图6。

如图6(a)所示，经过纯化后，四种突变体均得到了比较纯的蛋白。从洗脱曲线上来看，S139C-S206C-S121A-R122L结合能力稍强，如图6(c)，其它四种蛋白结合能力都相近，S121A如图6(d)，在前边有一个杂蛋白峰。

突变体S139C-S206C-S121A纯化后比活为11000U/mg、S139C-S206C-S121A-R122L纯化后比活为13500U/mg、S121A-R122L比活为11500U/mg、S121A纯化后的比活为10000U/mg。

实施例5、ht2二硫键S139C-S206C系列突变体的pH稳定性

本实施例中，进行ht2系列突变体S139C和S139C-S206C-R122L与野生型hT1和hT1突变体的pH稳定性的比较。

将酶液分别置于pH 3～11缓冲液中，蛋白浓度控制在0.5mg/ml，于25℃下水浴2h后测定活性，缓冲液依次为50mmol/L NaAc-HAc(pH 3～6)，Tris-HCl(pH 7～8)，Gly-NaOH(pH 9～11)，所有缓冲液均25℃配制。以水浴前的酶液初始活性作为100％，计算相应pH下的残余酶活。

突变体S139C、S139C-S206C-R122L、R122L和hT2、hT1及hT1-C139S-C206S的pH稳定性的比较结果见图7所示。分别考量了其在不同pH值下，25℃水浴2h后酶活的变化情况。hT1在pH3-11的范围内均表现出了良好的稳定性，残余酶活均在80％以上。在pH3-4及10-11极其稳定，基本不会影响酶活，在pH5左右酶活下降到80％。相比之下，hT2只有在pH3时表现出了一定的稳定性，在pH4-11范围内，残余酶活都不超过50％，在pH5及pH9时最不稳定，残余活只有20％。突变体hT2-R122L在一定程度内提高了hT2的pH稳定性，尤其是耐碱性，在pH7-11的范围内均比hT2野生型提高了20％的残余酶活。突变体S139C与hT2的pH稳定性相近，对酸碱的稳定性略有提高。hT1-C139S-C206S这对二硫键缺失的突变体与hT1野生型相比，pH稳定性下降明显，在pH4及6-11的范围内，残余酶活均低于50％。S139C-S206C-R122L突变体表现出了很好的稳定性，除pH9以外，其它pH下残余酶活均在50％以上，并且在pH3-4及pH11附近酶活基本没有损失。与hT2野生型相比pH稳定性大大提高。

实施例6、人阴离子型胰蛋白酶S121A系列突变体的pH稳定性比较

本实施例中，进行ht2系列突变体S121A、S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L和S121A-R122L与野生型hT1和ht2的pH稳定性的比较。

将酶液分别置于pH 3～11缓冲液中，蛋白浓度控制在0.5mg/ml，于25℃下水浴2h后测定活性，缓冲液依次为50mmol/L NaAc-HAc(pH 3～6)，Tris-HCl(pH 7～8)，Gly-NaOH(pH 9～11)，所有缓冲液均25℃配制。以水浴前的酶液初始活性作为100％，计算项相应pH下的残余酶活。

S121A系列突变体的pH稳定性如图8所示，分别考量了其在不同pH值下，25℃水浴2h后酶活的变化情况。突变体S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S121A与hT2野生型相比，在各pH下稳定性大体相当。S121A-R122L在pH6-11的范围内均提高了10％左右的残余酶活。但是hT2-S139C-S206C-S121A-R122L却显著的提高了pH稳定性，从pH3-11的范围内来看，除pH9以外，残余酶活均在80％以上，在pH5和pH7附近均比hT1野生型要高，但在pH9时，其残余酶活却下降到了50％以下，这也是hT2及其突变体的共性。

实施例7、人胰蛋白酶二硫键突变体的温度稳定性比较

本实施例中，进行S139C和S139C-S206C-R122L与野生型hT1和hT1突变体S121A的稳定性比较。

取纯化后0.5mg/ml的酶液，分别置于4℃、25℃、37℃、40℃、50℃、60℃水浴中温育12h，每隔30min取样测定酶活，以水浴前酶液的初始活性作为100％计算各温度下的残余酶活。

见图9，分别考量了突变体S139C和S129C-S206C-R122L，在5mmol/L HCl中(蛋白终浓度1mg/ml)置于4～60℃下12h内酶活性的变化情况。两种突变体在4℃、15℃、25℃、37℃、40℃下，12h内活力相对稳定，残余酶活均在80％以上。在50℃时，突变体S139C活性下降明显，4h内活力已下降50％，12h后活力仅有初始酶活的20％，相比之下S139C-S206C-R122L残余酶活12h后为82％。在60℃时，突变体S139C活性下降的更为迅速，2h后活力就下降至20％，4h后活力几乎丧失殆尽。而S139C-S206C-R122L在60℃放置12h后，仍可以保留60％以上的活性。

实施例8、人胰蛋白酶S121A系列突变体温度稳定性的比较

方法同实施例7。结果如图10，为几种S121A突变体在不同温度下5mmol/L HCl中(蛋白终浓度1mg/ml)12h内的活性变化情况。在25℃以下，12h内，四种突变体活性情况基本稳定。37℃至50℃时，也都可以保留有80％残留活性。60℃、12h后突变体S139C-S206C-S121A-R122L，仍保留了70％以上的活力，但是S121A、S139C-S206C-S121A、S121A-R122L这三种突变体，活力都下降了50％左右。所以这个既包含有二硫键的突变，又包含有自切位点突变的突变体S139C-S206C-S121A-R122L，稳定性很好。

检测将两组突变体及野生型一同置于60℃下，1mmol/L HCl中，12h后的残余酶活，结果如图11所示，在60℃下，12h后，ht2野生型完全失活，hT2-S139C的活性下降更快也在12h后完全失活。hT2-R122L突变体最终残余酶活为50％。hT1残余酶活为60％，S121A、S139C-S206C-R122L、S139C-S206C-S121A突变体最终酶活与之相当，但是活性下降的更慢。但是S139C-S206C-S121A-R122L耐热性极好，残余酶活仍在70％以上。

实施例9、人胰蛋白酶及其系列突变体的HPLC分析结果

HPLC检测人胰蛋白酶，方法如下：

流动相

流动相A：含有0.1％H3PO4(85％)水溶液。

流动相B：含有0.1％H3PO4(85％)的乙腈。

使用前用0.22μl滤膜过滤除菌，超声脱气。

色谱程序：参照美国药典2013年“Enzymes Used As Ancillary Material in Pharmaceutical Manufacturing”中对重组人胰蛋白酶HPLC测定方法的规定。采用C18柱(EF-C18(H)4.6×250mm，3μm)。

HPLC流动相洗脱程序：

进样量为1-20μl，每次上样中蛋白量不少于50μg。流速为1.0ml/min。柱温为40℃。检测波长为280nm。

采用HPLC胰蛋白酶美国药典的标准分析胰蛋白酶中不同构型的胰蛋白酶，分离时间为30min，其中根据胰蛋白酶构型不同，α-trypsin和β-trypsin的保留时间为12-17分钟。上样前分别加入终浓度为1mol/L的HCl对样品进行酸化处理。

从图12(D)上可以看出，hT2出峰时间为13.1min，在β-trypsin之前有两个小峰为α-trypsin。如图12(C)所示，S139C出峰时间与hT2基本相同但是主峰不够单一，可能是样品不够纯或者构象不够单一。R122L出峰时间较晚为15.8min峰型比较单一，见图12(B)。从图12(A)可见S139C-S206C-R122L出峰时间较晚，为16.3min，但是其主峰比较单一，并且没有α-trypsin存在。

如图13，通过比较几种突变体的HPLC检测结果发现，带有R122L位点的突变体出峰时间都会变晚。而添加了二硫键、R122L及S121A位点后，出峰时间还会延后。但是总体来看峰型都比较单一，都会得到比较纯的β-trypsin。而没有S121A或者R122L突变位点的突变体，如S139C-S206C-S121A及S121A都会存在α-trypsin，但hT2野生型更为明显，在α-trypsin位置前还会有更多的降解条带。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。