本发明属于分子生物学、医学和生物
技术领域：
，尤其涉及18种mirna检测探针和液相芯片。
背景技术：
：micrornas(mirnas)是一类进化上高度保守的单链rna，通常长度在22nt左右。它们由基因组dna编码，在rna聚合酶ii的作用下转录成为pri-pre-microrna，通过一系列酶切之后形成成熟的microrna，与rna诱导的沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,rics)结合于靶mrna的3'-utr区域，阻遏翻译甚至直接降解mrna，抑制基因表达。目前，已经有超过1000种人类mirna被发现。目前很多研究表明，mirnas影响多种病理、生理过程，例如细胞发育、分化、干细胞功能等，其不但可以成为预测某些疾病发生的分子标志物而且还有可能成为治疗某些疾病的分子靶点。许多mirna的异常表达都与肿瘤或其他一些疾病有关，例如，在子宫内膜异位症患者的组织中，mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p表达差异上调，而mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p表达却差异下调。目前，针对mirna的检测方法主要有northernblot、原位杂交、基因芯片、荧光定量探针法；但northernblot方法敏感度低、耗时长且rna的用量较大，不适合高通量分析；原位杂交技术在一次实验过程只能检测有限的mirna，仍然难以满足高通量要求；基因芯片技术能实现mirna的高通量分析，即在一块芯片上同时检测多个mirna，但缺点是结果准确性低，重复性差，实验价格昂贵。荧光定量探针法检测灵敏度高，但检测费用昂贵；而基于微球的流式细胞术技术将探针固定于微球上并置于液相中，更有利于捕获mirna序列，因此提高了准确性，但是由于mirna同源性高，长度较短，细胞或组织内含量低，针对它的高灵敏高选择性检测方法仍然有待进一步完善。目前，也有报道采用的三明治结构嵌合杂交探针(tag—靶标mirna反向互补序列—polya或oligocca)用于mirna的检测，与现有技术相比，该设计更为简单，更具有实用性。但对于针对能够实现多个mirna既能单独检测也能并行检测时，其高特异性和高灵敏度是最大的瓶颈，主要是因为所设计的杂交探针、tag序列以及anti-tag序列之间往往存在交叉反应，这限制了多个mirna的并行检测的实现。技术实现要素：本发明的目的之一提供了一种mirna检测探针片，该探针可以定量检测的18种mirna包括有mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p，mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p。实现上述目的的技术方案如下。一种mirna检测探针，包括有(1)杂交探针：其5'端为tag标签序列，3'端为结合序列，所述tag标签序列和所述结合序列之间还设有待检测靶标mirna反向互补序列；所述结合序列为polya序列或为oligocca序列，其长度为8-20个碱基；所述tag标签序列选自seqidno.21-seqidno.40；所述待检测靶标mirna反向互补序列选自针对mir-1的seqidno.1，针对mir-29c的seqidno.2，针对mir-145的seqidno.3，针对mir-143的seqidno.4，针对mir-99a的seqidno.5，针对mir-99b的seqidno.6，针对mir-126的seqidno.7，针对mir-100的seqidno.8，针对mir-122的seqidno.9，针对mir-23a的seqidno.10，针对mir-17-5p的seqidno.11，针对mir-141的seqidno.12，针对mir-9-3p的seqidno.13，针对mir-21的seqidno.14，针对mir-26a的seqidno.15，针对mir-145-3p的seqidno.16，针对mir-141-5p的seqidno.17，针对mir-542-3p的seqidno.18，和用于对照的内标1序列和内标2序列；(2)信号探针：其5'端为信号序列，3'端为polyt或oligotgg；所述polyt或oligotgg是杂交探针中结合序列的反向互补序列；所述信号序列为oligogt、oligotg或oligogtt序列，其长度为60-90个碱基。在其中一个实施例中，所述结合序列的长度为15-17个碱基。在其中一个实施例中，所述信号序列的长度为80-90个碱基。在其中一个实施例中，所述内标1序列为seqidno.19，所述内标2序列为seqidno.20。在其中一个实施例中，所述tag标签序列为选自于以下：针对mir-1的seqidno.21，针对mir-29c的seqidno.22，针对mir-145的seqidno.23，针对mir-143的seqidno.24，针对mir-99a的seqidno.25，针对mir-99b的seqidno.26，针对mir-126的seqidno.27，针对mir-100的seqidno.28，针对mir-122的seqidno.29，针对mir-23a的seqidno.30，mir-17-5p的seqidno.31，针对mir-141的seqidno.32，针对mir-9-3p的seqidno.33，针对mir-21的seqidno.34，mir-26a的seqidno.35，mir-145-3p的seqidno.36，mir-141-5p的seqidno.37，针对mir-542-3p的seqidno.38，针对内标1序列的seqidno.39和针对内标2序列的seqidno.40。本发明的另一目的是提供了一种mirna检测试剂盒。实现上述目的的技术方案如下。本发明所述mirna检测试剂盒，包括以下组份：a、上述检测探针；b、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与杂交探针5’端的tag序列互补配对。在其中一个实施例中，还包括有生物素标记的dctp、datp、dttp或dgtp。在其中一个实施例中，所述anti-tag序列与微珠之间连接有间隔臂序列。在其中一个实施例中，所述间隔臂为序列为5～10个t。本发明的主要优点在于：(1)本发明所设计的各种检测探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且选择的各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使本发明试剂盒和检测方法能够形成一个检测效果完好的系统。(2)本发明试剂盒具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的杂交探针、tag序列以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体杂交探针、结合序列、信号探针的结合，能够避免交叉反应，实现多个mirna的并行检测。(3)本发明的检测方法步骤简单，20种mirna(18种目标mirna及2种内标mirna)可通过一个反应过程即可完成目标mirna的定量检测，避免了反转录等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。具体实施方式为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例1mirna检测探针本发明所述的检测探针包括杂交探针和信号探针，其中：(1)关于杂交探针杂交探针包括三部分，5’端为tag标签序列，中间是待检测的成熟靶标mirna完整序列的反向互补序列，3'端为结合序列，所述结合序列为polya，长度为8-20个碱基。杂交探针结构：(5’→3')tag标签序列—待检测的成熟靶标mirna完整序列的反向互补序列—结合序列(polya)(2)关于信号探针信号探针包括两部分，5'端为信号序列，3'端为polyt，是杂交探针3'端结合序列的反向互补序列，其中信号序列为oligogt、oligotg或oligogtt序列，所述oligogt、oligotg或oligogtt序列长度为60-90个碱基。信号探针结构：(5’→3')信号序列—polyt(3)待检测的成熟靶标mirna本发明目标检测的mirna包括有：mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p，mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p以及内标一、内标二。所述待检测的成熟靶标mirna完整序列的反向互补序列如下：表1靶标mirna的反向互补序列seqidno.mirna名称目标检测mirna的序列的反向互补序列1mir-1auacauacuucuuuacauucca2mir-29cuaaccgauuucaaauggugcua3mir-145agggauuccugggaaaacuggac4mir-143gagcuacagugcuucaucuca5mir-99acacaagaucggaucuacggguu6mir-99bcgcaaggucgguucuacgggug7mir-126cgcauuauuacucacgguacga8mir-100cacaaguucggaucuacggguu9mir-122caaacaccauugucacacucca10mir-23aggaaaucccuggcaaugugau11mir-17-5pcuaccugcacuguaagcacuuug12mir-141ccaucuuuaccagacaguguua13mir-9-3pacuuucgguuaucuagcuuuau14mir-21ucaacaucagucugauaagcua15mir-26aagccuauccuggauuacuugaa16mir-145-3pagaacaguauuuccaggaaucc17mir-141-5puccaacacuguacuggaagaug18mir-542-3puuucaguuaucaaucugucaca19内标一caagcugauuuacacccgguga20内标二ugauuugaguauuugagauuu(4)tag标签序列本发明杂交探针的结构为：tag标签序列—待检测的成熟靶标mirna完整序列的反向互补序列—结合序列(polya)，其中，使用到的tag标签序列如表2所示。表2tag序列seqidno.5’tag序列21tcatgtcaatcagtcatcagcaat22taatgatacatgtcatctgctaca23caatagcatcatctgtatcagtac24gtactgattcagtaacattagtac25aagctacaaatccgataagctcgt26tcaagcatagtctcatagtccaag27ctagttcatgtactttgtactacg28ctgcagattcaaatgactactgac29taacagtacaacgatactatgtac30caatgaactacgtacaatgcatgc31ttcgtaactgcaatagatcatcgt32ttcagaacatcagtcataagttag33cttgctatctttgtactcgataat34atgctaactcgactaactttgaac35tcatgcatatacgtaccgattgat36ttcactgttcaatcaactgtaatg37tcaatgaattacttgctcaagtac38atacgtcattcagtcatcaatgca39atcatagatacatacgaatctacg40aatcctgttacattcagtacttag(5)包被有anti-tag序列的微球根据所设计的杂交探针，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与目标检测mirna片段可能形成的二级结构，选择的20种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表3所示：表3微球编号与微球上相应的anti-tag序列seqidno.anti-tag序列微球号41attgctgatgactgattgacatga542tgtagcagatgacatgtatcatta743gtactgatacagatgatgctattg844gtactaatgttactgaatcagtac945acgagcttatcggatttgtagctt1146cttggactatgagactatgcttga1547cgtagtacaaagtacatgaactag1648gtcagtagtcatttgaatctgcag1949gtacatagtatcgttgtactgtta2050gcatgcattgtacgtagttcattg2151acgatgatctattgcagttacgaa2252ctaacttatgactgatgttctgaa2553attatcgagtacaaagatagcaag3054gttcaaagttagtcgagttagcat3355atcaatcggtacgtatatgcatga3856cattacagttgattgaacagtgaa4057gtacttgagcaagtaattcattga4158tgcattgatgactgaatgacgtat4259cgtagattcgtatgtatctatgat4560ctaagtactgaatgtaacaggatt48所述微珠的直径介于10纳米-100微米，可以为磁性或非磁性，例如具体可以含有聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、和四氧化三铁中一种或以上的成分。当微珠含有聚苯乙烯和四氧化三铁时，该微珠即为磁珠，使用磁力分离，如磁力架或离心方法均能取得很好的分离效果，当使用非磁性微球时，使用离心方法也能实现相应的技术效果，本实施例中所述微珠为磁珠。选择的20种微珠购自美国luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个t的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个t的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddh2o配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dt，即poly(dt)，寡聚四聚乙二醇以及(ch2)n间隔臂(n≥3)，如(ch2)12、(ch2)18等。另外，如果存在poly(da)干扰，还可以用poly(ttg)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个t，微球包被的过程如下：分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自luminex公司)悬浮于5μl0.1mol/l的mes溶液中(ph4.5)，加入10μl合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的edc(n-(3-dimethylaminopropyl-n-ethylcarbodiimide)(购自piercechemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5μl的edc工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5μl的edc工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的tween-20洗涤一次，再用0.1％的sds液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100μl的tris-edta溶液[10mmol/ltris(ph8.0)]，1mmol/ledta中，2-8℃避光保存。实施例2试剂盒的组成本发明mirna检测试剂盒，主要包括有：a、实施例1中针对目标检测mirna的杂交探针、信号探针；b、包被有anti-tag序列的微珠，所述anti-tag序列与目标mirna检测探针5’端的相应的tag序列互补配对，具体如表3所示；本实施例中，anti-tag序列与微球之间还连接有10个t的间隔臂序列；c、生物素标记的dctp、datp、dttp或dgtp(使用的时候选择具体的一种)。使用实施例1中的目标mirna序列、tag和anti-tag序列，构建本实施例的检测试剂盒组分，其中杂交探针和信号探针具体为：1)杂交探针由实施例1可知，本发明杂交探针结构：(5’→3')tag标签序列—待检测的成熟靶标mirna完整序列的反向互补序列—结合序列(polya)表4杂交探针其中，本发明的polya长度可以为8-20个碱基，本实施例中，所选的polya为16个碱基a。根据上述形式构成的杂交探针序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2)信号探针由实施例1可知，信号探针结构：(5’→3')信号序列—polyt其中，本实施例中的信号序列使用oligogt，长度为90个碱基；同时，根据本实施例杂交探针中使用的polya为16个碱基a，信号探针中的polyt相应地使用16个碱基t。根据上述形式构成的信号探针序列，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例3一种检测mirna的方法使用本发明实施例2中的试剂盒，对10个样品中的目标mirna：mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p，mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p以及内标一、内标二等进行检测。1、检测方法1)形成信号标记复合体：针对目标检测mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p，mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p以及内标一、内标二等20种mirna，分别取pcr管，按照下表配置预结合液，95℃变性3min，4℃预结合反应1min，得到预延伸产物；往上述的预延伸产物中添加延伸标记液，并根据延伸反应条件，得到相应的信号标记复合体。本实施例中的信号序列使用oligogt，因此使用的延伸标记液选用biotin-dctp。具体为：延伸反应条件如下：2)与含有mirna的样本杂交；每组加入1x杂交液21ul、预延伸产物4ul、含有mirna的样本2ul，其中1x杂交液配方如下：试剂名称配置250ml用量2mnacl25ml1mtrisph8.025mltrironx-1000.2mldepc水定容至250ml反应程序如下表：温度℃时间min903781576157415721570156815661564156215601537过夜3)微珠捕获反应：pcr仪温度60℃，3min时暂停，加入相应的25ul包被anti-tag序列的磁珠混合液，37℃震荡过夜。4)rnase酶切反应，用杂交缓冲液稀释rnasea/t1，稀释比例为1:250，每组加入5ulrnasea/t1稀释液(0.4％),反应30min。5)杂交液洗脱，用枪吹打杂交液3次，转移杂交液至96孔u型板中，固定于磁力板上静置2min，倒扣去除杂交液，吸水纸上印干；加入100μl1x杂交液，静置15s，倒扣去除洗涤液，吸水纸上印干；卸下磁力板。6)sa-pe孵育与洗板，1×杂交液(rnasefree)70ul和sa-pe(5x)5ul配置成sa-pe工作液，混匀后每孔中加入75ul重悬磁珠，封膜，盖上盖子，将u型板置于恒温培养箱内(无光照)微量振荡器上37℃，震荡孵育10min。固定于磁力板上静置2min，倒扣去除杂交液，吸水纸上印干；加入100μl1x杂交液，静置15s，倒扣去除洗涤液，吸水纸上印干；卸下磁力板，加入75μl1x杂交液。7)用液相芯片检测仪对步骤六中的反应产物进行检测，得到检测结果。2、检测结果与数据分析：在20个目标检测mirna中，其中，18个为需要定量的目标mirna，分别是：mir-1，mir-29c，mir-145，mir-143，mir-99a，mir-99b，mir-126，mir-100，mir-122，mir-23a，mir-17-5p，mir-141，mir-9-3p，mir-21，mir-26a，mir-145-3p，mir-141-5p，mir-542-3p；2个为内参mirna，分别是：内标一、内标二。将读取的荧光值按照以下方法进行均一化处理：步骤1：获得原始数据(mfi值)；步骤2：样品的mfi减去空白孔n的mfi＝netmfi；步骤3：每个样品的2个内参mirna的netmfi值分别取几何平均值，得到相应的g1、g2、g3……gn；步骤4：每个样品目标mirna的netmfi除以对应的gn得到相应的nn，nn即为已排除上样量差异，可在样品间进行相对表达量比较的数值。采用上述试剂盒，对10例样本进行检测，检测结果并与荧光定量检测结果进行比较，结果如下：表5原始数据(mfi值)表6本发明检测结果相对表达量表7荧光定量pcr检测结果由表5-7检测数据可见，采用本发明的试剂盒和方法对临床样品进行检测，其mirna的相对表达量与荧光定量pcr检测结果相接近。本发明试剂盒检测结果稳定、可靠。实施例4关于信号序列的使用本实施例以检测mir-99a，mir-100，mir-9-3p及内标一、内标二为例。依据本发明所构建的mirna杂交探针，结构为“tag—待测靶标互补序列—结合序列”，结合序列碱基长度为10个碱基的polya，与结构为“信号序列+polyt”信号探针进行杂交反应，与biotin-dctp进行聚合反应，从而使目标检测mirna带上生物素标记，信号序列分别采用60、70、80或90个碱基的oligogt、oligotg或oligogtt，本实施例采用生物素标记的dctp。试验设计具体如表8所示：表8试剂盒的组成采用上述探针组成，根据实施例3所述的方法，对10例样本进行检测，并与荧光定量检测方法进行比较，结果如下：表9group1原始数据与相对表达量表10group2原始数据与相对表达量表11group3原始数据与相对表达量表12group4原始数据与相对表达量表13荧光定量pcr检测结果由本实施例的检测数据可见，对相同样本的检测，一方面，荧光信号随着信号序列的增多而增强，当使用80或90个碱基的oligogt信号序列时，荧光信号趋于平稳，另一方面，上述实验组mirna的相对表达量一致，即采用60、70、80或90个碱基的oligogt信号序列检测效果一致，相对表达量与荧光定量pcr的结果接近。当信号序列采用oligotg或oligogtt时，能取得与实施例4相同的检测效果，具体实验数据省略。实施例5关于信号探针的使用依据本发明所构建的mirna杂交探针，一方面杂交探针3’端直接用生物素标记，另一方面杂交探针分别与信号探针“oligogt+polyt”进行杂交反应，分别与biotin-dctp进行聚合反应，从而使目标检测mirna带上生物素标记，其中杂交探针3’端结合序列碱基长度采用10个碱基，信号序列oligogt长度采用90个碱基。本实施例以检测mir-126、mir-23a、mir-21及内标一、内标二为例，分别使用上述所述情况的试剂盒，对10个样本进行检测，比较其检测效果，具体如表14所示，检测步骤参照实施例3的检测方法。表14试剂盒的组成表15group5原始数据与相对表达量表16group6原始数据与相对表达量表17荧光定量pcr检测结果由上述检测结果可见，直接用生物素标记的group5，与oligogt+polyt进行杂交反应再与biotin-dctp进行聚合反应的group6的试验检测，两组的相对表达量与荧光定量pcr的结果接近，而使用信号探针oligogt+polyt作信号放大，检测效果更佳。实施例6tag序列及anti-tag序列的选择以mir-141-5p为例，按照实施例1的方法设计检测探针，采用实施例3的检测方法，其中杂交探针3’端结合序列碱基长度采用10个碱基，信号序列oligogt长度采用90个碱基，杂交探针分别与信号探针“oligogt+polyt”，与biotin-dctp进行聚合反应，从而使目标检测mirna带上生物素标记，而杂交探针5’端的tag序列则选自seqidno.21-seqidno.40，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自seqidno.41-seqidno.60。具体设计如下表(表18)所示。表18tag序列及anti-tag序列组合本实施例将分别使用上述所述情况的试剂盒，对10个样本进行检测，比较其检测效果，具体如表19、20所示，检测步骤参照实施例3的检测方法。表19检测结果原始数据表20相对表达量与荧光定量pcr检测结果从上述实施例可见，本发明所设计的tag和anti-tag标签序列中，杂交探针5’端选用不同的tag序列时，试验检测结果一致，并且与荧光定量pcr检测结果吻合。可见选用不同的mirna，杂交探针5’端运用不同的tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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