SNP位点基因型分型的方法与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种SNP位点基因型分型的方法。

背景技术：

锁核酸(Locked nucleic acid，LNA)是指核苷酸糖环上的2'-O与4'-C由亚甲基桥相连的一类RNA衍生物，可以与DNA或RNA按照一般的碱基配对原则进行配对。这种桥连结构增加了核酸骨架的稳定性，提高了退火温度，增强了碱基配对的特异性，极大的降低了错配发生的概率。因此锁核酸在基因芯片、RNA干扰等许多领域得到了广泛的应用(Braasch,D.A.and D.R.Corey,Locked nucleic acid(LNA):fine-tuning the recognition of DNA and RNA.Chemistry&biology,2001.8(1):p.1-7.)。

理论上，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)的顺利进行是以模板单链与引物链按照碱基配对原则正确配对为前提。所以，在包含碱基差异的区域，设计一组只有单碱基差异的PCR引物，利用常规的PCR扩增仪，进行扩增，检测是否有符合设计片段长度的扩增产物产生，可以判断目标区域靶位点的碱基类型。但在使用常规PCR引物时，即使存在单碱基的错配，PCR反应有时也可以正常进行，得到与目的片段长度相同的扩增产物。因而使用常规引物进行PCR扩增分型时，无法排除假阳性结果，进而可能会得到错误的基因型分型结果。

目前，常用的SNP位点基因型检测方法主要有测序法、芯片法以及质谱法等，其中测序法价格比较昂贵，而芯片法和质谱法只有在同时测定多个位点或研究大群体样品时较有优势，且这三种方法都必须以相关的大型仪器平台作为支撑，存在多种局限。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种SNP位点基因型分型的方法，以解决现有技术中SNP位点基因型分型技术假阳性高或复杂、价格昂贵的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种SNP位点基因型分型的方法。该方法包括以下步骤：S1，对目标区域的DNA序列进行克隆测序和多重比对，确定待测SNP位点；S2，针对SNP位点设计PCR扩增引物，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP位点，对对应待测SNP位点的3'末端上的核苷酸进行LNA修饰；S3，采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物中目的条带的有无确定待测样本的SNP位点基因型。

优选地，步骤S3中采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增是在通过梯度实验得到的最佳PCR扩增条件和反应体系下进行的。

优选地，对PCR扩增引物中的与模板杂交亲和程度高的引物3'末端进行LNA修饰。

优选地，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒数第一个或倒数第二个核苷酸对应待测SNP位点。

优选地，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因5上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的3'末端上的倒数第一个核苷酸进行LNA修饰。

优选地，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因5上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的3'末端上的倒数第一个核苷酸进行LNA修饰。

优选地，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因8上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的3'末端上的倒数第二个核苷酸进行LNA修饰。

优选地，PCR扩增的条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火58～65℃30s或20s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃10min。

优选地，PCR扩增的体系为：20ng基因组DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10×PCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，补充水至25μl。

由于错配现象的存在，普通的PCR扩增引物与模板DNA链无法进行完全正确的杂交结合，也就意味着无法通过检测PCR扩增产物的有无来判断靶位点的核苷酸类型。为了解决这一技术问题，应用锁核酸修饰的技术手段，对引物组中的单碱基差异核苷酸进行修饰，在最佳的退火温度和PCR反应条件下，可以显著地提高PCR扩增引物与模板DNA链集合的特异性，使其完全正确的遵循碱基配对原则进行PCR扩增，以达到通过检测扩增产物的有无来判断靶位点核苷酸类型的目的，实现待检测SNP位点的基因型分型。也就是说，应用本发明的技术方案，采用锁核酸引物进行PCR扩增以确定SNP位点的基因型，不仅增加了检测结果的精确性和可靠性，而且极大地提高了实验的灵活性，简化了配套条件并显著地降低了实验成本。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实施例1中退火温度梯度PCR扩增产物电泳结果图，G：使用正向引物C5SNP1GF和反向引物C5SNP1R的PCR扩增产物点样泳道，T：使用正向引物C5SNP1TF和反向引物C5SNP1R的PCR扩增产物点样泳道。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

针对现有技术中SNP位点基因型分型技术假阳性高或复杂、价格昂贵的技术问题，本发明的发明人利用锁核酸的特性改进了SNP位点基因型分型方法，对引物组中的引物，仅在差异位点以相应的锁核酸取代对应的普通核苷酸，合成特殊的锁核酸引物，进行PCR扩增，以检测目的长度片段是否存在来推断差异位点的基因型类型，来取得可信的SNP基因型检测结果。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种SNP位点基因型分型的方法。该方法包括以下步骤：S1，对目标区域的DNA序列进行克隆测序和多重比对，确定待测SNP位点；S2，针对SNP位点设计PCR扩增引物，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端对应待测SNP位点，对应待测SNP位点的3'末端上的核苷酸进行LNA修饰；S3，采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增，并根据扩增产物中目的条带的有无确定待测样本的SNP位点基因型。

本发明的技术方案，可直接应用于植物和微生物等个体或群体的SNP位点的基因型检测，而且理论方法清晰，研究群体位点数量不限，实验设计灵活，所需设备简单，操作易于掌握，过程方便快捷，结果精确可靠，价格优势明显。

在本发明的一种典型实施方式中，上述步骤S2具体包括，设计一组PCR引物，使其中正向引物(或反向引物)的3'末端倒数第一个或倒数第二个碱基与待检测SNP位点配对，并在进行引物合成时将此碱基所在的核苷酸的糖环进行锁核酸桥联修饰(LNA修饰)。由于待检测位点一般有两种基因型，所以要同时合成两条LNA修饰的单碱基差异正向引物(或反向引物)与相应的基因型对应，即引物中只有待检测位点对应的核苷酸有差异，其余核苷酸序列不变。另一条反向引物(或正向引物)可依据常规引物设计法则进行设计合成，作为共用引物与正向引物(或反向引物)搭配使用。由于进行LNA修饰的那条引物的位置相对固定，所以在确定是对正向引物还是对反向引物进行LNA修饰时，可参考引物设计法则，选择最容易与DNA链杂交结合的一条引物进行LNA修饰。一组引物中可以共有三条引物：两条LNA修饰的单碱基差异正向引物(或反向引物)，一条共用的常规反向引物(或正向引物)，可以最多扩增出两条长度相等的目的条带。当然，如果SNP位点有多种基因型，引物的设计也随之增多。

优选地，步骤S3中采用PCR扩增引物对待测样本的DNA进行扩增是在通过梯度实验得到的最佳PCR扩增条件和反应体系下进行的，这样可以提高基因型检测的准确度。

在实际操作中，由于在发现和确定候选SNP位点时，部分个体的待检测位点基因型类型已经明确，所以可在其中选择几个个体的DNA，作为梯度实验试验PCR扩增的模板DNA，更好的找出最佳PCR扩增条件和反应体系。

使用PCR扩增引物对模板DNA进行退火温度梯度PCR扩增，全部引物对与全部模板DNA两两搭配，形成一个“反应组合”，使用相同退火温度，其中每个搭配(包含两个相似的PCR扩增)都是一个“反应单元”。退火温度梯度数量与“反应组合”数量相同。温度范围的确定根据PCR扩增仪的不同略有不同。其遵循的一般原则是以该组引物对应的非LNA修饰引物的退火温度为最低温度，向上以0.5℃或1℃为一个单位逐级递增，上限一般不超过72℃。其它PCR反应条件暂时设定为常规PCR反应的条件，当扩增结果不理想时再进行调整。

将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每个“反应单元”的两个扩增产物在相邻的泳道进行点样，以方便后续的亮度比较和结果统计，有目的条带产生的反应表示该LNA修饰引物配对成功，即表示其所对应的碱基类型存在；没有目的条带产生，即表示其所对应的碱基类型不存在。一个“反应单元”(即使用一组引物)可以确定一个待检测位点的基因型。其中，有两条相同亮度的目的条带出现表示该位点为杂合型，一条泳道中出现清晰明亮的目的条带而另一条泳道中没有出现目的条带表示该位点为纯合型，并且可以根据目的条带所在的位置确定显隐性纯合类型。

如果整个退火温度梯度PCR扩增产物电泳结果都不理想，特别是纯合基因类型的电泳结果出现跳跃性，无法产生“一亮一无”的最佳结果，此时应该缩小退火温度梯度范围，在拐点结果所对应的退火温度周围设定温度梯度，并适当减小单位变化温度，重新进行退火温度梯度PCR扩增，直到确定出最佳退火温度。在某些情况下，缩小温度变化范围和减小单位变化温度，依然得不到最佳的结果，在退火温度较低时，纯合基因型所对应“反映单元”的扩增产物中，会出现一明一暗两条目的条带(暗条带的出现会干扰结果的统计)，而相邻的较高退火温度的“反应单元”中，两条目的条带都没有出现(表明退火温度已过高)。此时，可以采取缩短退火步骤时间和(或)减少PCR扩增循环数的措施，重新进行退火温度梯度PCR扩增，直到确定出最佳退火温度。如果根据扩增结果依然无法确定最佳PCR扩增条件，就在结果相对理想的PCR扩增条件基础之上，优化PCR反应体系(降低试剂和DNA模板浓度)，使用touchdown PCR，并增加热启动步骤等。

根据本发明一典型的实施方式，对PCR扩增引物中的与模板杂交亲和程度高的引物3'末端进行LNA修饰，以提高引物与模板结合的特异性，使其正确地按照碱基配对原则进行杂交扩增。优选地，PCR扩增引物中的正向引物或反向引物的3'末端倒数第一个或倒数第二个核苷酸对应待测SNP位点。

根据本发明一典型的实施方式，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因5上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:1(C5SNP1TF:5'-CGTCTTTCTCACTACCTCCT-3'),SEQ ID NO:2(C5SNP1GF:5'-GTCTTTCTCACTACCTCCT-3')和SEQ ID NO:3(C5SNP1R:5'-AGCTTCTCTCTAACTCTCCACTT-3')。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的3'末端上的倒数第一个核苷酸进行LNA修饰。PCR扩增的条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火62℃30s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃10min。PCR扩增的体系为：20ng基因组DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10×PCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，补充水至25μl。

在本发明一种典型的实施方式中，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因5上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:4(C5SNP14F:5'-GGACGAGGGGAAGATTCTG-3')、SEQ ID NO:5(C5SNP14GR：5'-ACACGAGAACGAGGGATG-3')和SEQ ID NO:6(C5SNP14AR：5'-ACACGAGGACGAGGGATG-3')。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的3'末端上的倒数第一个核苷酸进行LNA修饰。PCR扩增的条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火60℃20s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃10min。PCR扩增的体系为：20ng基因组DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10×PCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，补充水至25μl。

在本发明一种典型的实施方式中，待测样本为毛白杨，待测SNP位点位于纤维素合酶基因8上，PCR扩增引物的碱基序列为SEQ ID NO:7(C8SNP13R:5'-TCATGGGCTTCACCTGCGC-3')、SEQ ID NO:8(C8SNP13CF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCG-3')和SEQ ID NO:9(C8SNP13TF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCG-3')。SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的3'末端上的倒数第二个核苷酸进行LNA修饰。PCR扩增的条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火59℃20s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃10min。PCR扩增的体系为：20ng基因组DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10×PCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物，补充水至25μl。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

实施例1

使用LNA修饰引物PCR扩增的SNP分型技术，对毛白杨自然群体纤维素合酶基因5中的SNP1(SNP1是指纤维素合酶基因5基因全长的第23bp处，其所在区域的基因序列如下：ATCGTCTTTCTCACTACCTCCTCAATCCACACTCTCTTTCTTTCTCTGT，斜体为SNP位点)位点进行基因型检测。

材料取自山东冠县毛白杨基因库(全国毛白杨种质资源库)中460株个体。

S1，提取每株个体的DNA后，按照地域分布，随机挑选40株个体，逐一对其纤维素合酶基因5进行克隆测序，确定候选SNP位点。

S2，针对SNP1位点(黑体下划线标注)，整个自然群体包含两种类型的DNA模板链，其中模板链I:3'-GCAGAAAGAGTGATGGAGGANNNNNNNNNNNN-5',模板链II:3'-GCAGAAAGAGTGATGGAGGANNNNNNNNNNNN-5'。对应的基因型分别为T和G。选择基因型分别为TT、TG和GG的三株个体进行退火温度梯度PCR扩增，以确定基因型检测最佳PCR扩增条件。

设计合成两条3'末端核苷酸LNA修饰(3'末端倒数第一个核苷酸)的正向引物：SEQ ID NO:1(C5SNP1TF:5'-CGTCTTTCTCACTACCTCCT-3'),SEQ ID NO:2(C5SNP1GF:5'-GTCTTTCTCACTACCTCCT-3')，一条常规反向引物SEQ ID NO:3(C5SNP1R:5'-AGCTTCTCTCTAACTCTCCACTT-3')。两条LNA修饰正向引物分别与常规反向引物搭配使用，组成一组引物组。扩增产物目的片段长度为396bp。

S3，将S2中所述三株个体的基因组DNA模板与所设计合成的引物组分别组合，进行退火温度梯度PCR扩增，退火温度范围设定为从58℃到65℃，单位变化温度为1℃。其它反应条件为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火30s，延伸72℃1min，30个循环，最后延伸72℃10min，10℃保存。25μl反应体系中包括：20ng基因组DNA，0.8UTaq酶，0.2mMdNTPs，10xPCR buffer以及50ng正向引物和50ng反向引物。

将退火温度梯度PCR扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，每两条泳道检测一株个体的基因型，其中退火温度为62℃时结果最佳(如图1所示)。图1中点样孔上方，字母G表示该泳道为使用正向引物C5SNP1GF和反向引物C5SNP1R的PCR扩增产物点样泳道，字母T表示该泳道为使用正向引物C5SNP1TF和反向引物C5SNP1R的PCR扩增产物点样泳道，最右侧为DL2000Marker。根据目的片段的有无，可以确定三株个体的基因型分别为GG，GT和TT，与已知结果一致。可以将62℃作为最佳退火温度，并结合5中所述其它反应条件和反应体系，采用常规PCR扩增的方法，使用4中所述LNA修饰引物组，对整个毛白杨自然群体进行SNP1位点的基因型检测。

在取自山东冠县毛白杨基因库中460株个体中，有187株个体基因型为GT，有229株个体基因型为TT，有44株个体基因型为GG。

实施例2

使用LNA修饰引物PCR扩增的SNP分型技术，对实施实例1中毛白杨自然群体纤维素合酶基因5中的SNP14(SNP14是纤维素合酶基因5基因全长的第977bp处，其所在区域的基因序列如下：CATAGGCTCAAAAGCATTGTCTCCCTTATGCTCTATTCAATGTCAGAAA，斜体为SNP)位点进行基因型检测。

实验材料及步骤参考实施实例1。

根据待检测位点和DNA模板链的序列特点，设计合成一条常规正向引物：SEQ ID NO:4(C5SNP14F:5'-GGACGAGGGGAAGATTCTG-3')，两条3'末端核苷酸LNA修饰(3'末端倒数第一个核苷酸)的反向引物：SEQ ID NO:5(C5SNP14GR：5'-ACACGAGAACGAGGGATG-3')，SEQ ID NO:6(C5SNP14AR：5'-ACACGAGGACGAGGGATG-3')，分别检测基因型G和A。扩增产物目的片段长度为304bp。

通过退火温度梯度PCR扩增，确定最佳退火温度为60℃，退火步骤时间为20s，其它条件与实施实例1中反应条件和反应体系一致。

对毛白杨自然群体纤维素合酶基因5中的SNP14位点基因型检测结果为：有347株个体基因型为AG，有89株个体基因型为AA，有24株个体基因型为GG。

实施例3

使用LNA修饰引物PCR扩增的SNP分型技术，对实施实例1中毛白杨自然群体纤维素合酶基因8中的SNP13(SNP13是纤维素合酶基因8基因全长的第546bp处，其所在区域的基因序列如下：GATAAGAGGTTGCTTCTGAGGTTGAGAGTTAGAGAAGCGACGCTTCGATGCTCTCTGTATGATTAGGG，斜体为SNP)位点进行基因型检测。

实验材料及步骤参考实施实例1。

根据待检测位点和DNA模板链的序列特点，设计合成一条常规反向引物：SEQ ID NO:7(C8SNP13R:5'-TCATGGGCTTCACCTGCGC-3')，两条3'末端核苷酸LNA修饰(3'末端倒数第二个核苷酸)的正向引物：SEQ ID NO:8(C8SNP13CF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCG-3')，SEQ ID NO:9(C8SNP13TF:5'-GGTTGAGAGTTAGAGAAGCG-3')，分别检测基因型C和T。扩增产物目的片段长度为390bp。

通过退火温度梯度PCR扩增，确定最佳退火温度为59℃，退火步骤时间为20s，其它条件与实施实例1中反应条件和反应体系一致。

对毛白杨自然群体纤维素合酶基因8中的SNP13位点基因型检测结果为：有237株个体基因型为CT，有136株个体基因型为CC，有107株个体基因型为TT。

从以上的描述中，可以看出，本发明的技术方案：首先，设计一组正反向PCR引物，使待检测SNP位点与此对引物中的正向引物或反向引物的3'末端(倒数第一个或倒数第二个碱基)配对，并将该3'末端核苷酸用锁核酸替换(锁核酸桥联修饰)。然后，使用此对锁核酸引物，对所研究群体中已确定待检测位点基因型的个体进行退火温度梯度PCR，并确定退火温度、退火时间、循环数等其它PCR反应条件和反应体系。然后选择与已知基因型结果一致的反应条件对整个群体进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳检查并统计结果，以确定群体中所有个体的基因型类型。

应用本发明的技术方案，采用锁核酸引物进行PCR扩增以确定SNP位点的基因型，不仅增加了检测结果的精确性和可靠性，而且极大地提高了实验的灵活性，简化了配套条件并显著地降低了实验成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。