信号约束测序（SCS）和用于信号约束测序的核苷酸类似物的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年10月23日提交的美国临时申请62/067,952的优先权益。该优先权申请的全部内容并入本文以用于所有目的。

本文公开了核苷酸类似物，在合成测序(sequencing-by-synthesis:sbs)中使用核苷酸类似物的方法和信号约束方法。

背景技术：

用于给dna和rna测序的一些方法会遭遇：在碱添加中不准确，向dna模板引入疤痕，以及由于在反应中存在染料而导致不可接受的高背景噪音，从而削弱染料信号。需要用于对dna和rna测序的有效方法。

技术实现要素：

本文描述了具有以下化学式的核苷酸类似物：

其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；l不存在或者是连接基团；r¹是核苷碱基；r²是氢或保护基团(blockinggroup)；b是结合分子；x是检测标记。在一些实施方案中，r²是保护基团，并且保护基团是-nh2、-ch2ch＝ch2、-ch2n3、聚乙二醇或经取代或未经取代的烷基。在一些实施方案中，l是连接基团，并且连接基团是经取代或未经取代的烷基，经取代或未经取代的烯基或经取代或未经取代的芳基。任选地，连接基团是亚甲基或经取代的苯基。连接基团可进一步包括猝灭剂。任选地，结合分子是生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素或肽。任选地，检测标记是含有阳离子基团的分子、含有阴离子基团的分子、荧光(fluorescent)分子(例如荧光染料)、荧光性分子(afluorogenicmolecule)、金属、还原标记、含硫分子或经取代的或未经取代的烷基。

本文还描述了用于为靶核酸测序并约束信号的方法。用于为靶核酸测序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和具有以下结构的核苷酸类似物：

其中n为0、1、2、3、4、5、6或7；l不存在或者是连接基团；r¹是核苷碱基；r²是氢或保护基团；b是结合分子；x是检测标记，其中所述检测标记被猝灭。该方法还包括：通过并入核苷酸类似物来延伸引物；提供磷酸酶以在结合分子和连接基团之间或在结合分子和末端磷酸酯之间进行切割，从而产生核苷酸类似物的包含标记和结合分子的片段，其中标记是未被猝灭的；将片段与固定在表面上的捕获元件结合；以及检测来自被捕获在表面上的片段的标记的荧光发射。在一些实施方案中，结合分子包含寡核苷酸。

在一些实施方案中，捕获元件是含硫或含硫醇的分子。在一些实施方案中，捕获元件是链霉亲和素、抗体、蛋白质或树枝状聚合物。在一些实施方案中，捕获元件包含与模板核酸互补的固定的寡核苷酸。

在一些实施方案中，模板核酸是包含互补捕获序列的多个拷贝的固定化dna连环体。

在一些实施方案中，连接基团还包含猝灭剂。任选地，提供步骤可以包括从连接基团置换猝灭剂。

在一些实施方案中，该方法还可以包括从固体表面上的捕获元件去除片段。任选地，去除步骤包括加热片断和捕获元件。任选地，去除步骤包括用缓冲液洗涤片断和捕获元件。任选地，去除步骤包括添加酶以将片段从捕获元件切割开。

该方法还可以包括将保护基团从并入的核苷酸类似物切割开。

在一些实施方案中，使用荧光共振能量转移来执行检测步骤。

本文进一步描述的是测序方法。测序方法包括：组合模板核酸、与模板互补的引物、包含含氮碱基和可检测标记的核苷酸类似物和聚合酶；在使得在引物延伸反应中所述引物延伸的条件下维持在组合步骤中的组分以产生互补多核苷酸，其中所述含氮碱基通过所述聚合酶并入所述互补多核苷酸，并且所述可检测标记通过聚合酶与所述含氮碱基分离，并且未并入所述互补多核苷酸中，并且其中分离的所述可检测标记被捕获元件结合；以及检测由捕获元件结合的可检测标记，其中所述检测提供序列信息。

一个或多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。其他特征、目的和优点将根据说明书和附图以及权利要求书变得显而易见。

附图说明

图1a-d显示了使用核苷酸类似物的合成测序的方法的步骤。图1e是图1a-d的插图。

图2显示了描述核苷酸类似物转化为荧光分子的方案。

图3显示了含有固定化dna连环体并包含互补捕获序列的多个拷贝的液滴卡通图。

图4是显示使用核苷酸类似物的合成测序方法，其中荧光片段通过瞬时二溴马来酰亚胺接头连接到阵列的表面。

图5是显示使用含有生物素作为结合分子的核苷酸类似物的合成测序方法的方案。该方案中的捕获元件与引物的5'末端结合。

图6是显示使用含有生物素作为结合分子的核苷酸类似物的合成测序方法的方案。该方案中的捕获元件与寡核苷酸在引物的5'末端结合。

图7是显示合成测序方法的方案，其中通过杂交进行表面捕获。

图8是显示合成测序方法的方案，其中核苷酸类似物含有猝灭剂并通过杂交进行表面捕获。

图9a和9b包含合成测序方案，其中通过含链霉亲和素的捕获元件进行表面捕获。

图10包含合成测序方案，其中通过单色系统中的诱导物进行表面捕获。

图11包含合成测序方案，其中通过含硼酸盐猝灭剂的捕获元件进行表面捕获。

图12包含合成测序方案，其中通过含链霉亲和素的捕获元件进行表面捕获。

图13包含合成测序方案，其中通过双色系统中的诱导物进行表面捕获。

图14a-e示出了使用核苷酸类似物的合成测序方法的步骤。

定义

本文所用的术语“可检测标记”或“检测标记”是指可用于提供可检测和/或可量化信号的任何原子或分子。合适的标记包括放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发射化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。在一些实施方案中，检测标记是含有带电基团的分子(例如，含有阳离子基团的分子或含有阴离子基团的分子)、荧光分子(例如荧光染料)、荧光性(fluorogenic)分子或金属。任选地，检测标记是荧光性标记。荧光性标记可以是任何能够在处于非猝灭形式时发出光的标记(例如，当不被另一种试剂猝灭时)。当被合适的激发波长激发时，荧光部分以特定的发射波长发射光能(即发荧光)。当荧光部分和猝灭剂部分非常接近时，由荧光部分发射的光能被猝灭剂部分吸收。任选地，检测标记是荧光染料。在一些实施方案中，荧光染料是荧光素、罗丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些实施方案中，荧光性染料是羧基荧光素。合适的荧光性染料的其他示例包括在alexafluor产品系(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商购的荧光性染料。任选地，标记是氧化还原标记。任选地，标记是还原标签，含硫分子或经取代或未经取代的烷基。

术语“染料”在本技术领域具有其标准含义。本文所用的术语“荧光染料”通常是指当通过电磁辐射源(例如灯、光电二极管或激光)照射时，通过荧光机构发射较长波长的电磁辐射的任何染料。

术语“报道分子”是指能够产生荧光信号的分子。报道分子是可检测标记的示例。“猝灭剂分子”是指能够吸收受激报道分子的荧光能从而猝灭否则将从受激报道分子释放的荧光信号的分子。为了使猝灭剂分子猝灭受激的荧光团，通常有利的是猝灭剂分子在从报道分子的激发开始但在报道分子释放所存储的荧光能量之前的某个时间处于受激报道分子的最小猝灭距离之内。在基于邻近的猝灭应用中，报道分子和猝灭剂分子彼此充分接近，使得每当报道分子被激发时，受激态的能量转移到猝灭剂分子，其中其被非辐射地散发或以与报道分子的发射频率不同的发射频率发射。几个非辐射能量传递机构在较短距离上工作，并且适用于基于邻近的猝灭应用。

术语“配体”和“抗配体”是指抗配体对的成员。“抗配体对”是指彼此特异性结合的第一分子和第二分子。通常，样品中的结合对的第一成员与结合对的第二成员的“特异性结合”通过第一成员与第二成员的结合来证实，反之亦然，其中第一成员与第二成员比样品中其他组分具有更大的亲和力和特异性。结合对成员之间的结合可能是非共价的。结合配偶体不必限于成对的单分子。例如，单个配体可以通过两种或更多种抗配体的协同作用结合。结合对或结合配偶体之间的结合导致结合复合物的形成，有时称为配体/抗配体复合物或简单地作为配体/抗配体。示例性结合对包括但不限于：(a)与相应抗体或其结合部分或片段组合的半抗原或抗原性化合物；(b)核酸适配体和蛋白质；(c)非免疫结合对(例如生物素-抗生物素蛋白、生物素-链霉亲和素、生物素-中性抗生蛋白)；(d)激素-激素结合蛋白；(e)受体-受体激动剂或拮抗剂；(f)凝集素-碳水化合物；(g)酶-酶辅因子；(h)酶-酶抑制剂；和(i)能够形成核酸双链体的互补的寡核苷酸或多核苷酸对。

具体实施方式

1.概述

在一个方面，本发明提供了用于测序(例如，合成测序(sbs))的改进的系统。这些系统利用了包含并入新合成的模板互补链中的含氮碱基(例如a、t、g或c)或类似物的核苷酸类似物，以及称为标记元件的由于所述并入而与碱基分离可释放的标记部分。系统还使用捕获元件，当标签元件被释放时，捕获元件与标记元件结合。捕获元件与模板核酸共定位，使得结合的标签元件可以与模板相关联。本发明提供核苷酸类似物、使用本发明的核苷酸类似物测序的方法和测序系统。这些类似物、方法和系统在该第1节中总体上进行描述。第2节描述特别适用于测序方法的某些可磷酸酶切割的核苷酸类似物。第3节描述了本发明的系统。第4节提供了说明性的示例。

1.1核苷酸类似物

在一个方面，本发明的核苷酸类似物包含式[i]：

[x-b]-[q-k]-pn[i]

在式[i]中，pn是核苷酸或脱氧核糖核苷酸单磷酸酯，或任意一种的类似物，其包含能够与模板核酸的互补核苷酸碱基配对的含氮碱基。通常，含氮碱基选自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物。k是包含至少三个(例如3-10)磷酸酯或其类似物的可切割连接部分，使得核苷酸类似物是用于dna聚合酶的底物。q是猝灭部分。在一些实施方案中，[q-k]是寡磷酸酯，并且都是可切割的连接部分(例如用于碱性磷酸酶的底物)和猝灭部分。x是可检测标记；称为结合分子的b是配体-抗配体对的成员。下面提及的标签元件包括[x-b]。围绕x和b的括号([x-b])表示x和b可以以任何多种结构连接，条件是k处的裂解将x和b从q分离开来，并且不将x与b分离。

当可检测标签x和猝灭部分q在它们彼此接近的情况下，在诸如照明之类的检测条件下相互作用，使得接近于q的标记x的可检测信号(或不存在信号)可以与在x和q不接近时(例如当在k处的裂解破坏q或允许x从q扩散使得它们被物理分离时)的信号区分开来。猝灭剂可检测标记组合的示例如下所述。猝灭剂的一个示例是寡磷酸酯，如通过引用并入本文以用于所有目的美国专利公开20130053252所例证的。

在一些实施方案中，可检测标记是能够产生荧光信号的报道分子。示例性的报道分子是荧光有机染料，其可被衍生化以附着于核酸或其他有机分子。优选地，猝灭剂分子也是有机染料，其可以是或可以不是荧光的，具体取决于本发明的实施方案。例如，在本发明的优选实施方案中，猝灭剂分子是荧光性的。通常，猝灭剂分子是荧光性的或者仅仅通过非辐射衰变从报道物释放转移的能量，猝灭剂的吸收带应基本上与报道分子的荧光发射带重叠。本领域已知并且可以使用从受激的报道分子吸收能量但不通过辐射释放能量的非荧光猝灭剂分子(nfqm)，例如blackhole猝灭剂。

在文献中有大量实用的指南可用于选择适用于特定探针的报道物-猝灭剂对，如以下参考文献所例示的：grimmetal.,2013,“thechemistryofsmall-moleculefluorogenicprobes,”progmolbioltranslsci.113:1-34,其通过引用并入本发明，以及oushikietal.,2012,“near-infraredfluorescenceprobesforenzymesbasedonbindingaffinitymodulationofsquaryliumdyescaffold,”analchem.84:4404-10；clegg,1992,"fluorescenceresonanceenergytransferandnucleicacids,"methodsofenzymology,211:353-89；wuetal.1994,"resonanceenergytransfer:methodsandapplications,"anal.biochem.218:1-13；pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；等等。文献还包括提供荧光分子和nfqm的详尽列表以及它们的用于选择报道物-猝灭剂对的相关光学性质的参考文献，例如,berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colourandconstitutionoforganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(pergamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；等等。此外，在文献中有广泛的指导，以用于通过可添加至寡核苷酸的常见反应性基团而衍生化报道分子和猝灭剂分子以进行共价连接，如以下参考文献所例示的：ullman等人的美国专利no.3,996,345；khanna等人的美国专利no.4,351,760；等等。为了所有目的，上述出版物中的每一个的全部内容通过引用并入本文。

示例性的报道物-猝灭剂对可以选自呫吨染料(其包含荧光素)和罗丹明染料。这些化合物的许多合适形式可广泛用于商业上，其苯基部分上的取代基可以用作键合位点或用作与寡核苷酸连接的键合官能团。另一组荧光化合物是萘胺，其具有α或β位的氨基。这些萘氨基化合物中包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸盐。其他染料包括3-苯基-7-异氰酸香豆素(3-phenyl-7-isocyanatocoumarin)；吖啶，如9-异硫氰酸吖啶(9-isothiocyanatoacridine)和吖啶橙；n-(对-(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并二唑；二苯乙烯；芘等等。

在一些实施方案中，报道分子和猝灭剂分子选自荧光素和罗丹明染料。这些染料和适当的连接方法在许多参考文献中有描述，例如khannaetal.(上文引用)；marshall,histochemicalj.,7:299-303(1975)；menchen等人的美国专利no.5,188,934；menchen等人的欧洲专利申请no.87310256.0；以及bergot等人的国际申请pct/us90/05565。可用作探针的可检测标记的荧光团包括但不限于罗丹明、花青3(cy3)、花青5(cy5)、荧光素、vic^tm、liz^tm、tamra^tm、5-fam^tm、6-fam^tm、6-hex、calfluorgreen520、calfluorgold540、calfluororange560、calfluorred590、calfluorred610、calfluorred615、calfluorred635和texasred(分子探针)。在特定的实施方案中，用作猝灭剂的分子包括但不限于四甲基罗丹明(tamra)，dabcyl(dabsyl，dabmi或甲基红)蒽醌，硝基噻唑，硝基咪唑，孔雀石绿，blackholequenchers^tm(黑孔猝灭剂)，例如bhq1(biosearchtechnologies),iowablack^tm或zen猝灭剂(来自integrateddnatechnologies,inc.)，tidequencher2(tq2)和tidequencher3(tq3)(来自aatbioquest)。

猝灭剂可以是二甲基氨基苯磺酸(dimethylaminozobenzenesulfonicacid)；可从biosearchtechnologies(petaluma，ca)商购获得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可从anaspec，inc.(fremont，ca)商购获得；猝灭剂，其可从integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack产品系列中商购获得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可从li-corbiosciences(lincoln，ne)商购获得。

通过明智地选择标记，可以进行分析，其中在单个反应中不同标记被以不同波长激发和/或检测。参见例如fluorescencespectroscopy(pesceetal.,eds.)marceldekker,newyork,(1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach,marceldekker,newyork,(1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2nded.,academicpress,newyork,(1971)；griffiths,colourandconstitutionoforganicmolecules,academicpress,newyork,(1976)；indicators(bishop,ed.).pergamonpress,oxford,19723；以及haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,eugene(1992)。通常，报道分子和猝灭剂分子之间的距离将被最小化以增加猝灭剂分子的有效性。报道分子和猝灭剂分子的位置可以有策略地选择，使得在核苷酸类似物中，报道分子和猝灭剂分子分隔小于20nm、10nm、7.5nm、6nm、5nm、4nm、3nm、1nm、0.8nm、0.6nm、0.4nm或更小。

1.2使用的方法

图14

本发明的核苷酸分子(例如，式[i]-[iv])在改进的合成测序反应中的使用可以参考图14引入。读者应理解，许多变化和替代方法被构思，其包括偏离图14的大纲的变化和方法。

图14显示固定在底物上的单个核酸模板分子(测序靶)。实际上，本发明用于大规模并行的测序。因此，在一种方法中，使用核酸模板分子阵列进行测序，该阵列可以是例如但不限于单个分子的阵列(参见例如美国专利no.7,666,593)；连环体的阵列(参见例如美国专利no.8,445,194)，或克隆扩增产物阵列。总体上参见shendureandji,2008“next-generationdnasequencing”naturebiotechnology26:1135–45。

图14(a)显示了本发明的核苷酸类似物。参考式[i]，为简便起见，在该论述中，x是荧光染料，b是抗原，[q-k]是寡聚磷酸酯，它既是x的猝灭剂，也是可切割的连接部分(用于碱性磷酸酶的底物)，并且n是与寡磷酸酯连接的脱氧核糖核苷酸。因此，图14中的核苷酸类似物具有结构[1a]，其中p是四磷酸酯。

[x—b]—[q—k]—pn[i]

[x—b]—p2-9—pn[ia]

该阵列与用于合成测序的试剂组合，该试剂包括dna聚合酶和磷酸酶。

图14(b)说明通过聚合酶的作用并入pn。在一些实施方案中，每个互补链延伸至多一个核苷酸类似物(每个周期)，因为pn包含阻止进一步聚合的可逆保护基团。该并入反应产生具有x-b-p2-9结构的片段，其中x是未猝灭的。

图14(c)说明在第一轮并入后，将并入的核苷酸类似物暴露于切割试剂碱性磷酸酶，导致在k处的裂解并产生称为标签元件的包含x和b的片段。标签元件从并入的核苷酸类似物扩散并被捕获元件捕获(例如，被束缚)。在图14中，捕获元件是识别b表位并因此特异性结合[x-b]的抗体。更一般地，在本公开中，捕获元件通常包含作为b的抗配体的结合部分b'(“bprime”)。应当理解，尽管b和b'可以被称为配体-抗配体对，但更精确的表征是包含b'的捕获元件捕获包含b的标签元件。

在图14的实施方案中，捕获元件被固定或约束在接近模板核酸的位置(例如，与模板核酸在相同的底物上以及在邻近模板核酸的底物上)，使得给定捕获元件处的结合事件可以与附近的捕获部分相关联。对于阵列中任何给定的模板核酸(或扩增子的连环体或克隆群体等)，更多的某些捕获元件之一将接近或关联于固定的模板核酸，使得释放的片段具有高的靠近模板被捕获的可能性。

图14(d)示出了在标签元件并入捕获元件，与捕获元件切割开以及与捕获元件结合之后，洗去过量的试剂、未并入的核苷酸类似物和未结合的片段。

图14(e)示出了来自x的信号可以被检测并和将pn并入到与模板互补的链中相关联。

可以进行另外的一些测序，其可以尤其涉及除去阻断部分、去除标签元件和/或捕获元件等。

图1

图1所示的实施方案对于引入本发明也是有用的，其显示了对底物(例如硅芯片)上的核酸进行测序的方法。图1a-d的插图在图1e示出。使用dna连环体的阵列(例如dna纳米球(dnb)，completegenomics,inc.,mountainview,ca)描绘该方法。如图1a所示，延伸寡核苷酸(在图1a-d中示出为没有垂直延伸的水平线)和具有固定在其表面上的捕获元件的寡核苷酸(在图1a-d中描绘为具有垂直延伸的水平线)添加到阵列中并通过退火而被固定到dna连环体。延伸寡核苷酸与“引物位置”杂交。捕获元件被描绘为图1a中的寡核苷酸/抗体缀合物或多单元抗体结构。捕获元件允许结合分子附着到dnb结构上或者捕获元件允许结合分子附着到与dnb结构分离的表面(例如，到与dnb结构相邻的表面)。

如图1b所示，将聚合酶(如图1b和1c所示为饼状)与四个核苷酸类似物(a、c、g和t)一起添加到阵列中。每个核苷酸类似物可能含有不同的检测标记。磷酸酶和一种或多种另外的猝灭化学品也加到阵列中。聚合酶并入与dnb模板上的下一个核苷酸互补的核苷酸类似物(例如，与延伸寡核苷酸相邻)，磷酸酶切割五磷酸酯荧光性染料部分(即，配体染料复合物)。在图1b中，通过聚合酶并入t核苷酸类似物。聚合酶对dnb上的多个引物位置执行该反应。如上所述，并入的核苷酸类似物的3'末端上的保护基团阻止聚合酶持续到下一个循环。荧光性标记在此阶段保持猝灭。

图1c显示了含有通过聚合酶释放的猝灭染料的片段。磷酸酶和猝灭化学品消除了磷酸酯的猝灭能力(即，染料变得未猝灭)，并且还允许未猝灭的标记通过捕获元件与表面相互作用并被保留。dnb表面上的捕获元件可以是例如寡核苷酸-抗体缀合物或表面修饰结构，例如包含抗体的树枝状聚合物。应当理解，可以使用任何合适的配体-抗配体对来固定染料或染料缀合物。任选地，可以用荧光共振能量转移(fret)受体涂覆抗体以增加转移到染料的能量。

尽管图1a显示了捕获寡核苷酸和捕获结构，但通常只使用一种捕获结构。

为了除去荧光信号并从dnb洗去多余的试剂和未并入的核苷酸类似物，捕获寡核苷酸可以暴露于释放剂，该释放剂例如通过减少抗体对结合抗原的亲和力破坏配体-抗配体(例如，染料-抗体)的相互作用。任选地，捕获寡核苷酸和延伸寡聚体中的δg杂交差异可用于仅去除捕获寡核苷酸。所有添加的试剂(例如，过量的猝灭化学品)也在洗涤步骤期间被除去。在已经去除前一个循环的所有试剂后，然后除去保护基团。例如，可以向阵列中添加化学试剂以从延伸的延伸寡核苷酸(例如延伸的引物)中除去保护基团，得到3'-羟基。如图1d所示，阵列准备好重复这个循环过程。

许多变化

对于读者，显而易见的是，许多变化和替代方法是预料得到的，包括偏离图1和图14的大纲的变化和方法。下面更详细地讨论本发明的某些方面。

用于为靶核酸测序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸类似物。

模板核酸

在各种实施方案中，模板多核苷酸是dna(例如cdna、基因组dna或扩增产物)或rna。在各种实施方案中，多核苷酸是双链或单链的。

在一些实施方案中，将模板核酸固定在固体表面上。在一些实施方案中，将模板核酸固定在底物(例如珠、流通池、垫、微流体装置中的通道等)中。底物可以包括硅、玻璃、金、聚合物、pdmf等。

在一些实施方案中，模板核酸被固定化或包含在液滴内(任选地固定在珠上或液滴内的其他底物上)。

在一些实施方案中，模板核酸是包含互补捕获序列的多个拷贝(有时与dnb类比称为“衔接物序列”)的固定化dna连环体。

重要的是，在本文的某些附图、说明性实施方案和讨论中，模板核酸被表示为dna连环体，例如dna纳米球(例如，dnb；参见美国专利no.7,666,593)。然而，应当理解，该方法不需要dnb，但可以是任何模板，例如dna连环体、树枝状聚合物(dendrimer)、克隆的模板群(例如，通过桥扩增或wildfire扩增产生的)或单个多核苷酸分子。因此，重要的是，本说明书应该被阅读，好像每次参考作为模板的连环体另一方面涉及其他形式的模板。

核苷酸类似物

描述了测序的某些方面。重要的是，本文提供了使用本文所述的核苷酸类似物对靶核酸进行测序的方法。本文公开的方法不限于本文所述的特定类似物，并且不限于荧光检测系统，而可以广泛地应用于如下所述的其他系统。考虑到这一点，为了方便和清楚，将参考这些类似物来描述该系统。

酶

使用dna聚合酶将本发明的核苷酸类似物并入与模板互补的链中。示例性的聚合酶是dna指导的dna聚合酶(ec2.7.7.7)。对于一些应用，rna指导的dna聚合酶(ec2.7.7.49)是合适的。

在一些实施方案中，提供磷酸酶或切割试剂以切割结合分子和末端磷酸酯之间或在结合分子和连接基团之间的键。在一些实施方案中，在上述引物延伸反应期间提供磷酸酶或切割试剂(例如，聚合酶和磷酸酶同时存在)。在其他实施方案中，在上述引物延伸反应后提供磷酸酶或切割试剂。在核苷酸类似物含有连接基团的实施方案中，在结合分子和连接基团之间的键被切割开。在一些实施方案中，连接基团是ph敏感连接基团或uv可切割连接基团。在这些实施方案中，通过进行含有核苷酸类似物的溶液或混合物的ph的变化或通过uv光处理，结合分子和连接基团之间的键可被切割开。在其中核苷酸类似物是根据式ii的化合物并且不含连接基团(即，不存在连接基团)的实施方案中，磷酸酶切割结合分子和末端磷酸酯之间的键。在其中核苷酸类似物是根据式iii或式iv的化合物并且不含有连接基团(即不存在连接基团)的实施方案中，切割试剂切割开在结合分子和末端磷酸酯之间的键。示例性的切割试剂包括例如磷化氢、还原剂或氧化剂。因此，磷酸酶或切割试剂产生包括检测标记和结合分子(即x-b-)的核苷酸类似物的片段(即，(ii)、(iii)或(iv)的片段)。释放的片段可以称为标签元件。

在本发明的一些实施方案中，使用磷酸酶来产生标签元件。在一些实施方案中，使用碱性磷酸酶(ec3.1.3.1)。在一些实施方案中，使用酸性磷酸酶(ec3.1.3.2)。在一些实施方案中，使用除磷酸酶之外的切割试剂。

在一些实施方案中，磷酸酶可以与dna结合(例如，与互补捕获序列结合)。任选地，可以向猝灭化学品提供磷酸酶以猝灭任何背景信号。如本领域技术人员所理解的，磷酸酶和猝灭化学品可以相伴地或依次提供。磷酸酶和/或猝灭化学品消除磷酸酯的猝灭能力以产生具有未猝灭标记的片段。

保护基团

当并入的核苷酸类似物含有保护基团时(即，当式ii的r²为保护基团时)，所得的延伸引物不能进一步延伸(即，通过另外的核苷酸类似物进行的随后的并入被阻断)，直到保护基团被除去。

用于dna测序的保护基团是本领域熟知的。

在本发明的一些实施方案中，核苷酸类似物的脱氧核糖3'-位是未封闭的。在一些实施方案中，可逆封闭包括在3'-位，其可以有益于减少流动循环数。在这些实施方案中，聚合酶可以是therminator酶(newenglandbiolabs，inc.；ipswich，ma)。替代地，循环可以使用例如taq聚合酶顺序进行而不进行3'-位封闭。

可以从并入的核苷酸类似物中除去保护基团，从而允许在随后的循环中并入下一个碱基。任选地，可通过化学方法除去保护基团。例如，可以通过酶裂解反应或水解反应除去保护基团。在一些实施方案中，通过使用还原剂(如二硫苏糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep))除去保护基团。任选地，通过改变含有并入的核苷酸类似物的溶液或混合物的ph来除去保护基团。任选地，通过使用磷化氢从并入的核苷酸类似物洗涤保护基团来除去保护基团。

捕获元件

包含未猝灭标记的标签元件能够与捕获元件相互作用。标记元件和捕获元件之间的相互作用可以是任何合适的配体-抗-配体相互作用。在一些实施方案中，配体-抗配体相互作用是标签元件的核酸部分与捕获元件的互补核酸部分的杂交，或者标签元件与结合部分(如抗体或适配体)之间的相互作用。

捕获元件可以直接或间接地固定在表面上。在一些实施方案中，表面可以是其上固定或定位模板序列的表面。在一些实施方案中，表面可以是除含有模板序列的表面以外的表面。

在标签元件包含寡核苷酸部分的情况下，捕获元件可以包含与寡核苷酸部分杂交或结合的互补序列。互补序列可以称为捕获序列。

在一些情况下，捕获元件是具有捕获序列的多个拷贝的固定化dna连环体。在一些情况下，通过与用于基于连接的测序中的dnb类似，可将连环体的捕获序列称为锚定序列。通常，连环体还包含模板序列。例如，连环体可以包含包含模板序列和捕获序列的单体的多个(例如，50-500)拷贝。

在一些情况下，捕获元件是包含捕获序列的多个拷贝的树枝状聚合物。在一些情况下，捕获元件是包含包含捕获序列的多核苷酸的固定化克隆群(扩增反应的产物)的簇。

捕获元件可以包含与标签元件结合的部分的多个拷贝。例如，当捕获元件是核酸连环体、树枝状聚合物或簇时，捕获序列可以表示为1至10⁶倍，有时为50-10⁴倍，有时为50-500倍。

在一些实施方案中，捕获元件为或包含寡核苷酸，该寡核苷酸包含10-100个碱基，更经常为12-50个碱基，有时为10至15个碱基。

在一些实施方案中，捕获元件包括硫基或硫醇基团。

在一些实施方案中，捕获元件包括链霉亲和素、抗体、适配体、蛋白质或树枝状聚合物。

捕捉元件可以经由如说明性实施方案5中所述的中间结构间接地固定。捕获元件可以在结合标签元件之前或之后被固定。

在一些实施方案中，捕获元件，例如链霉亲和素或抗体，可以与聚合酶偶联而不干扰聚合酶的功能。在这些示例中，在延伸反应之前没有为每个循环添加新的捕获元件的单独步骤。

在一些实施例中，捕获元件被限制在液滴内。

在一些实施方案中，捕获元件如链霉亲和素或抗体可以与聚合酶偶联而不干扰聚合酶的功能。在这些示例中，在延伸反应之前没有为每个循环添加新的捕获元件的单独步骤。

洗涤步骤

任选地，在并入和切割步骤之后，从表面除去(例如冲洗掉)过量的试剂和未并入的核苷酸类似物。

检测/成像

然后使用本领域技术人员已知的技术(例如电荷耦合器件任选地与过滤器组合使用)来检测来自片段的标记的荧光发射。示例性的检测方法包括荧光显微镜、全内反射荧光显微镜、高倾斜照明显微镜或平行共焦显微镜。

标记

在一些实施方案中，使用少于四个的检测标记，如例如在美国专利no.8,617,881中所述的。在一些实施方案中，使用两个标记。在一些实施方案中，如下文所述使用单个标记。可以使用单一或双色图案(例如，使用单个或两个检测过滤器或通道)。

去除标签元件

本文所述的方法还可以包括从表面上的捕获元件去除标签元件。

在一些实施方案中，去除步骤包括加热片断和捕获元件。在一些实施方案中，去除步骤包括用缓冲液或杂交破坏剂(例如甲酰胺)洗涤片段捕获元件复合物。任选地，缓冲液具有低的盐含量以破坏杂交。在设计本发明的测序系统的元件时，本领域普通技术人员将选择在不破坏其他相互作用的情况下破坏某些相互作用的洗涤步骤。例如，可以设计系统以避免破坏被测序的模板和延伸的引物的关联。在一些实施方案中，去除步骤包括添加酶以将片段从表面上的捕获元件切割开。在一些实施方案中，去除步骤包括添加还原剂或置换剂以从表面上的捕获元件去除片段。

2.3'-o-修饰的末端磷酸酯-标记的可切割的核苷酸类似物

本文描述的是适用于无疤痕逐步合成测序方法的3'-o-修饰的末端磷酸酯-标记的可切割的核苷酸类似物。

与其他可逆终止剂相反，本文所述的核苷酸类似物的优点包括消除疤痕，从而导致更快和更有效的并入，更容易的合成过程，以及不存在或减少的荧光背景和由磷酸酯猝灭染料。由于没有荧光背景，所以可以使用非常高浓度的核苷酸以在非常短的时间内将3'-o-修饰的末端磷酸酯-标记的核苷酸的并入驱动到完成，这进而通过合成测序中使用的未标记的可逆终止子消除随后的“填入”反应步骤。在一种方法中，将具有3'保护基团但缺少另外的磷酸酯和染料的核苷酸的混合物与染料标记的分子混合，或者随后进行追踪反应，以填充在该循环期间未延伸的任何位点。

用于本文所述方法的核苷酸类似物包括由式ii表示的化合物：

在式ii中，n为0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式ii中，l不存在或者是连接基团。在一些实施方案中，l是选自经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基或者经取代或未经取代的芳基的连接基团。例如，连接基团可以是亚甲基或经取代的苯基。在一些实施方案中，连接基团还包含猝灭剂，其示例在本领域已知并在上文描述，其在本文中表示为“q”。

另外在式ii中，r¹是适合用作核苷碱基的含氮碱基。例如，r¹可以是选自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及这些的衍生物的碱基。

此外，在式ii中，r²是氢或保护基团。如本文所使用的，术语“保护基团”是指可以被切割以在核苷酸类似物的3'-位上提供羟基的任何基团。保护基团可以通过物理方式、化学方式、热和/或光来切割。任选地，所述保护基团可通过酶法来切割。在一些实施方案中，保护基团是含氨基的保护基团(例如-nh2)。在一些实施方案中，保护基团是含烯丙基的保护基团(例如-ch2ch＝ch2)。在一些实施方案中，保护基团是含叠氮基的保护基团(例如，-ch2n3)。在一些实施方案中，保护基团是含烷氧基的保护基团(例如-ch2och3)。在一些实施方案中，保护基团是聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，保护基团是经取代或未经取代的烷基(即经取代或未经取代的烃)。

也在式ii中，b是结合分子。如本文所使用的，术语“结合分子”是指核苷酸类似物的部分，其在从连接基团(如果存在)断裂时或者当连接基团不存在而从磷酸酯部分断裂时与本文所述的捕获元件相互作用。在一些实施方案中，结合分子是生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素或肽。任选地，结合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任选地，结合分子含有寡核苷酸。

此外，在式ii中，x是如上所述的检测标记。

根据式ii的核苷酸类似物的示例包括以下：

在替代的实施方案中，根据式ii的核苷酸类似物是与含有三个磷酸基团(即，n＝0)的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7或化合物8相似的化合物。

本文所述方法中有用的核苷酸类似物还包括由式iii表示的化合物：

在式iii中，n为0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式iii中，l不存在或者是连接基团。在一些实施方案中，l是选自经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基或经取代或未经取代的芳基的连接基团。例如，连接基团可以是亚甲基或经取代的苯基。在一些实施方案中，连接基团还包含在本文中表示为“q”的猝灭剂。例如，猝灭剂可以是二甲基氨基苯磺酸；可从biosearchtechnologies(petaluma，ca)商购获得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可从anaspec，inc.(fremont，ca)商购获得；猝灭剂，其可从integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack产品系列中商购获得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可从li-corbiosciences(lincoln，ne)商购获得。

另外在式iii中，r¹是适合用作核苷碱基的含氮碱基。例如，r¹可以是选自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物的碱基。

另外在式iii中，b是结合分子。如本文所使用的，术语“结合分子”是指核苷酸类似物的部分，其在从连接基团(如果存在)断裂时或者当连接基团不存在而从磷酸酯部分断裂时与本文所述的捕获元件相互作用。在一些实施方案中，结合分子是生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素或肽。任选地，结合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任选地，结合分子含有寡核苷酸。

此外，在式iii中，x是检测标记。在一些实施方案中，检测标记是含有带电基团的分子(例如，含有阳离子基团的分子或含有阴离子基团的分子)、荧光分子(例如荧光染料)、荧光性分子或金属。任选地，检测标记是荧光性标记。荧光性标记可以是任何能够在处于不猝灭形式时(例如，当不被另一种试剂猝灭时)发出光的标记。荧光部分当被合适的激发波长激发时，以特定的发射波长发射光能(即发荧光)。当荧光部分和猝灭剂部分非常接近时，由荧光部分发射的光能被猝灭剂部分吸收。任选地，检测标记是荧光性染料。在一些实施方案中，荧光性染料是荧光素、罗丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些实施方案中，荧光性染料是羧基荧光素。合适的荧光性染料的其他示例包括在alexafluor产品系列(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商购的荧光性染料。荧光性染料还可以是例如在grimmetal.,2013,progressinmolecularbiologyandtranslationalscience,113卷,第1章,第1-34页中所描述的。任选地，标记是氧化还原标记。任选地，标记是还原标签、含硫分子或经取代或未经取代的烷基。

根据式iii的核苷酸类似物的示例包括以下：

在替代的实施方案中，根据式iii的核苷酸类似物是与含有三个磷酸基团(即，n＝0)的化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15或化合物16相似的化合物。

本文所述方法中有用的核苷酸类似物还包括由式iv表示的化合物：

在式iv中，n为0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式iv中，l不存在或者是连接基团。在一些实施方案中，l是选自经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基或经取代或未经取代的芳基的连接基团。例如，连接基团可以是亚甲基或经取代的苯基。在一些实施方案中，连接基团还包含在本文中表示为“q”的猝灭剂。例如，猝灭剂可以是二甲基氨基苯磺酸；可从biosearchtechnologies(petaluma，ca)商购获得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可从anaspec，inc.(fremont，ca)商购获得；猝灭剂，其可从integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack产品系列中商购获得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可从li-corbiosciences(lincoln，ne)商购获得。

另外在式iv中，r¹是适合用作核苷碱基的含氮碱基。例如，r¹可以是选自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鸟嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物的碱基。

此外，在式iv中，r²是氢或保护基团。如本文所使用的，术语“保护基团”是指可以被切割以在核苷酸类似物的3'-位上提供羟基的任何基团。保护基团可以通过物理方式、化学方式、热和/或光来切割。任选地，所述保护基团可通过酶法来切割。在一些实施方案中，保护基团是含氨基的保护基团(例如-nh2)。在一些实施方案中，保护基团是含烯丙基的保护基团(例如-ch2ch＝ch2)。在一些实施方案中，保护基团是含叠氮基的保护基团(例如，-ch2n3)。在一些实施方案中，保护基团是含烷氧基的保护基团(例如-ch2och3)。在一些实施方案中，保护基团是聚乙二醇(peg)。在一些实施方案中，保护基团是经取代或未经取代的烷基(即经取代或未经取代的烃)。

还在式iv中，b是结合分子。如本文所使用的，术语“结合分子”是指核苷酸类似物的部分，其在从连接基团(如果存在)断裂时或者当连接基团不存在而从磷酸酯部分断裂时与本文所述的捕获元件相互作用。在一些实施方案中，结合分子是生物素、抗体、氨基酸、胆固醇、异硫氰酸荧光素或肽。任选地，结合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任选地，结合分子含有寡核苷酸。

此外，在式iv中，x是检测标记。在一些实施方案中，检测标记是含有带电基团的分子(例如，含有阳离子基团的分子或含有阴离子基团的分子)、荧光分子(例如荧光染料)、荧光性分子或金属。任选地，检测标记是荧光性标记。荧光性标记可以是任何能够在处于非猝灭形式时(例如，当不被另一种试剂猝灭时)发出光的标记。荧光部分当被合适的激发波长激发时，以特定的发射波长发射光能(即发荧光)。当荧光部分和猝灭剂部分非常接近时，由荧光部分发射的光能被猝灭剂部分吸收。任选地，检测标记是荧光性染料。在一些实施方案中，荧光性染料是荧光素、罗丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些实施方案中，荧光性染料是羧基荧光素。合适的荧光性染料的其他示例包括在alexafluor产品系列(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商购的荧光性染料。任选地，标记是氧化还原标记。任选地，标记是还原标签、含硫分子或经取代或未经取代的烷基。

根据式iv的核苷酸类似物的示例包括以下：

在替代的实施方案中，根据式iv的核苷酸类似物是与含有三个磷酸基团(即，n＝0)的化合物17、化合物18、化合物19或化合物20相似的化合物。

合适的核苷酸类似物的其他示例在图1-14中描绘。

本文所述的化合物可以以本领域技术人员所理解的有机合成领域中已知的各种方式或其变化来制备。本文所述的化合物可以由容易获得的原料制备。最佳反应条件可以随所用的具体反应物或溶剂而变化，但这些条件可由本领域技术人员确定。

关于式i、式ii、式iii和式iv以及本文所述的化合物的变化包括如针对各化合物所述的各种组分的加成、减少或移动。类似地，当分子中存在一个或多个手性中心时，可以改变分子的手性。此外，化合物合成可涉及各种化学基团的保护和去保护。本领域技术人员可以确定保护和去保护的使用以及合适的保护基(protectinggroup)的选择。保护基的化学性质可以在例如wutsandgreene,protectivegroupsinorganicsynthesis,4thed.,wiley&sons,2006中找到，其全部内容通过引用并入本文。如本文所述的各种化合物的合成和随后的测试以确定功效是能预料到的。

产生本文所述化合物的反应可以在可由有机合成领域的技术人员选择的溶剂中进行。在使得反应得以进行的条件(即温度和压力)下，溶剂可以与起始材料(反应物)、中间体或产物基本上不反应。反应可以在一种溶剂中或多种溶剂的混合物中进行。可以根据本领域已知的任何合适的方法监测产物或中间体形成。例如，产品形成可通过光谱手段(如通过核磁共振光谱(如¹h或¹³c)红外光谱、分光光度法(如紫外可见)或质谱法)或通过色谱法(如高效液相色谱法(hplc)或薄层色谱法)进行监测。

任选地，本文所述的化合物可以通过使用市售的dntp合成。市售的dtnp可以通过磷酸酯缀合反应与接头或结合分子缀合。可以通过使化合物与保护基反应来封闭dntp的3'-位。缀合和封闭反应可以以任何顺序进行。

本文提供了使用本文所述的核苷酸类似物对靶核酸进行测序的方法。本文公开的方法不限于本文所述的特定类似物，并且不限于荧光检测系统，而可以广泛地应用于其他系统，如下文所述。考虑到这一点，为了方便和清楚，将参考这些类似物来描述该系统。

在本方法中，在通过引物延伸反应将核苷酸类似物并入多核苷酸后，检测核苷酸类似物的同一性。在一种方法中，对靶核酸进行测序包括以下步骤：(1)提供本文所述的模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸类似物；(2)通过并入核苷酸类似物(和任选的其他核苷酸)延伸引物；(3)提供磷酸酶以切割(在不存在连接基团的情况下)在结合分子和末端磷酸酯之间或(在存在连接基团的情况下)在结合分子和连接基团之间的并入的核苷酸类似物，从而产生式ii、式iii或式iv的包含标签和结合分子的片段，其中标记是未被猝灭的；(4)将片段与固定在表面上的捕获元件结合；以及(5)检测来自表面上捕获的片段的标记物的荧光发射。以下进一步描述每个步骤。

用于对靶核酸进行测序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸类似物。

任选地，所提供的核苷酸类似物是根据式ii、式iii或式iv的四种核苷酸类似物的混合物，每种包含不同的碱基(即，不同的r¹基团)。在一些实施方案中，四种核苷酸类似物中的每一种都包含不同的检测标记(即，不同的x基团)。例如，根据式ii的核苷酸类似物的混合物可以包括以下化合物：

其中x¹、x²、x³和x⁴分别表示不同的检测标签。在一些实施方案中，使用一种或多种不同的或另外的碱基，例如u(尿嘧啶)或i(肌苷)。在一些实施方案中，通过使标签与磷酸酯邻近而使标签猝灭。

如上所述，在一些实施方案中，使用少于四个的检测标记，如例如在美国专利no.8,617,881中所述的。在一些实施例中，使用两个标记。在一些实施方案中，使用单个标记，如下文所述。

聚合酶使核苷酸类似物并入核酸，从而延伸引物。当并入的核苷酸类似物含有保护基团时(即当r²为保护基团时)，不能进一步延伸所得的延伸的引物(即，通过另外的核苷酸类似物进行的随后的并入被阻挡)直至保护基团被除去。

任选地，提供磷酸酶以切割在结合分子和末端磷酸酯之间或在结合分子和连接基团之间的键。在一些实施方案中，在上述引物延伸反应期间提供磷酸酶。在其他实施方案中，在上述引物延伸反应后提供磷酸酶。在其中核苷酸类似物是根据式ii的化合物并且不含有连接基团(即，不存在连接基团的情况下)的实施方案中，磷酸酶切割在结合分子和末端磷酸酯之间的键。磷酸酶因此产生核苷酸类似物的包含检测标记和结合分子(即x-b-)的片段(即，(ii)、(iii)或(iv)的片段)。

在一些实施方案中，提供切割试剂以产生核苷酸类似物的包含检测标记和结合分子的片段。在其中核苷酸类似物是根据式iii或式iv的化合物的实施方案中，检测标记和结合分子可以通过如本文所述的切割试剂(例如，通过膦、tcep、dtt或还原剂)从核苷酸类似物释放。这种切割使得结合分子的表位能以本文所述的捕获方法中可被捕获元件识别的形式暴露。

在一些实施方案中，磷酸酶可以与dna结合(例如，与互补捕获序列)结合。任选地，可以提供猝灭化学品与磷酸酶以猝灭任何背景信号。如本领域技术人员所理解的，磷酸酶和猝灭化学品可以相伴地或依次提供。磷酸酶和/或猝灭化学品消除磷酸酯的猝灭能力以产生具有非猝灭标记的片段。片段的非猝灭标记发光。

3.系统

本发明提供用于实施本文所述方法的系统和试剂盒。示例性试剂盒包含本文所述的核苷酸类似物、捕获元件或酶中的一种或多种。本发明的系统可以包括包含固定的捕获元件的底物。

4.说明性实施方式

以下实施例旨在进一步说明本文所述的方法和组合物的某些方面，并不意图限制权利要求书的范围。

说明性实施方案1：荧光分子的生产

图2示出了本文所述的包含荧光标签的核苷酸类似物。如图2所示，聚合酶将核苷酸并入延伸的多核苷酸中，导致包含荧光分子和三磷酸的片段的释放。荧光被三磷酸酯基团猝灭。磷酸酶然后从磷酸酯末端切割开荧光性标签，得到包含非猝灭荧光分子的标签。

说明性实施方案2：含有dnb的液滴

使用本文所述的核苷酸类似物的合成测序的方法可以在液滴内进行。图3示出了定位在由疏水表面包围的亲水区域(“斑点(spot)”)的高密度阵列的亲水区域上的液滴。参见美国专利7,666,593；drmanacetal.,2010,science327(5961):78-81。示例性疏水表面包括cytop，一种无定形含氟聚合物(bellexinternationalcorporation，wilmington，de)。应认识到，当向这种表面添加水溶液时，液滴自发形成。本文所述的测序反应可以在含有dna模板和捕获元件的液滴内进行。dna模板可以固定在液滴内的阵列表面上或珠上。该系统的一个示例性特征是液滴限制了试剂的扩散，包括可以由液滴内的捕获元件捕获的标签元件。在一个实施方案中，dna模板是包含捕获序列(捕获元件)的多个拷贝的固定化dna连环体。例如，通过在dna和表面上的涂层之间的相互作用将连环体固定在表面上。任选地，可以将连环体固定在液滴内的珠或其他底物上。在聚合捕获循环完成时，阵列表面可以如本文所述进行洗涤。

示例性实施方案3：使用可逆瞬时接头的表面捕获

图4示出了根据本发明的一种测序方法，其中标签元件和末端磷酸酯通过硫-氧键连接。通过聚合酶并入核苷酸并用磷酸酶处理产生可以任选地通过可逆接头连接到结合分子(b)上的含硫标签元件(例如，磺化荧光染料)。替代地，含硫标签元件通过可逆接头直接连接到捕获元件上。在一种方法中，如图4所示，含硫标签元件与二溴马来酰亚胺反应以产生可逆的瞬时接头。荧光含硫片段和二溴马来酰亚胺复合物然后结合固定在表面上的捕获元件。在该实施例中，捕获元件包括硫醇聚合物，例如bsa(包含35个半胱氨酸残基)。然后为了信号，使用检测器扫描该阵列，并用谷胱甘肽或β-巯基乙醇洗涤阵列以除去荧光含硫片段和二溴马来酰亚胺复合物。用于本发明的方法中的示例性氧化还原基因标签描述于美国专利公布20140001055。

示例性实施例4：通过捕获元件在引物的5'-末端的表面捕获

图5描绘了其中捕获元件结合到引物的5'端(而不是例如阵列表面)的实施方案。在该配置中，捕获元件更接近于核苷酸并入位点，从而确保对标签元件的更有效的捕获。并非意图受到特定机制的束缚，标签元件-磷酸酯复合物的快速去磷酸化在捕获元件之前使扩散最小化。在图5中，生物素用作核苷酸类似物中的结合分子。

在循环完成后，在检测到捕获的信号后，通过使用含有链霉亲和素的洗涤缓冲液来除去生物素，然后用测序缓冲液洗涤以除去链霉亲和素，从而再生阵列。

说明性实施方案5：通过捕获元件与寡核苷酸在引物的5'末端结合的表面捕获

图6描述了测序方法，其中捕获元件是配体-抗配体对(例如链霉亲和素)的第一个成员和寡核苷酸的缀合物。捕获元件上的寡核苷酸与固定在阵列或珠表面上的第二寡核苷酸互补，或与测序引物连接。当标签片段(这里显示为包含生物素)结合捕获元件的抗配体(此处显示为链霉亲和素)时，发生捕获元件的捕获，并且捕获元件的寡核苷酸部分与固定的互补寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，捕获元件的寡核苷酸和固定的互补寡核苷酸是短的，例如10-50个碱基，有时10-15个碱基。

选择短寡核苷酸和结合分子，使得结合分子对标签元件具有强亲和力，而短寡核苷酸对捕获序列(或其他固定化的互补寡核苷酸)具有低亲和力。这使得结合分子在循环结束时能被洗去。

应当理解，在捕获元件被间接固定化的其他实施方案中，捕获元件的寡核苷酸部分和固定化的互补寡核苷酸可以用不同的配体-抗配体对替代。

说明性实施方案6：通过杂交的表面捕获

图7示出了一种核苷酸类似物，其中核苷酸类似物的结合部分是寡核苷酸。在该实施方案中，核苷酸-寡磷酸酯通过寡核苷酸与标签部分连接，使其不可杂交。在图示的实施方案中，核苷酸-寡磷酸酯通过肽键与寡核苷酸的鸟嘌呤连接(即肽核酸结构)。在并入核苷酸之后，使用磷酸酶以去除寡磷酸酯。

说明性实施方式7：通过杂交的表面捕获

图8示出了其中猝灭剂位于连接到类似物的末端磷酸酯的可切割接头上的实施方案。在图8中，核苷酸类似物类似于图7所示的核苷酸类似物。然而，图8的核苷酸类似物包括连接于该类似物的末端磷酸酯的可切割接头上的猝灭剂。

说明性实施方案8：通过去除捕获元件的再生

图9a示出了其中标签元件的结合部分被封闭以使其不能结合相应抗配体的实施方案。在图示中，封闭结合部分的结构包括猝灭剂。图9a还示出了其中捕获元件-标签元件复合物在成像之后被去除而不是仅去除标签元件的实施方案。

在该示例中，标签元件包含荧光团、生物素和猝灭剂。捕获元件包含与链霉亲和素缀合的寡核苷酸(“寡核苷酸拴系的链霉亲和素”)。显示捕获元件与连环体的固定化互补序列(衔接物序列)杂交，但也可以以其他形式杂交到互补寡核苷酸。应认识到，连环体上的互补序列不能作为“捕获元件”，尽管它可能在结构上类似。相反，互补序列类似于说明性实施方案5的固定化互补寡核苷酸。

在一个实施方案(如图所示)中，链霉亲和素的生物素结合位点被4'-羟基偶氮苯-2-羧酸(haba)(链霉亲和素的一种弱结合类似物)占据。

通过聚合酶引入碱基并通过磷酸酶切割后，生物素是未封闭的并且可自由结合链霉亲和素捕获元件，置换更弱结合的haba。

阵列以两个步骤再生。首先，通过破坏捕获元件的寡核苷酸部分和与其结合的互补序列的缔合以及去除(洗去)捕获元件-标签元件复合物来除去捕获元件标签元件复合物。可以通过任何合适的方法进行破坏，例如用缓冲液(任选低盐条件)洗涤表面，用杂交破坏剂(如甲酰胺)洗涤，或加热以熔化寡核苷酸双链体。其次，通过添加另外的寡核苷酸拴系的链霉亲和素(即新的捕获元件)来置换捕获元件。

因为捕获元件在每个周期从阵列中除去，所以荧光受体分子可以是强劲地(或不可逆地)结合捕获元件。

说明性实施方案9：通过去除捕获元件的再生

图9b示出了说明性实施方案8的方法的变体。在该变体中，核苷酸类似物任选地不包括磷酸酯以外的猝灭剂。荧光团连接到链霉亲和素捕获元件，并且相应的猝灭剂附着于haba分子。haba猝灭剂通过捕获标签元件而被置换。fret相互作用允许一个照明波长以通过激发链霉亲和素-fret供体并将该能量转移到生物素-fret受体荧光团来激发所有生物素缀合的荧光团。haba的置换使得能够吸收适当的波长，这进而使得能够检测适当的碱基。单个碱基的顺序添加使得单个检测部分能够存在并减轻对磷酸酯切割的需要。

应当认识到，该说明性实施方案和说明性实施方案8存在各种变体的实施方案。例如，可以使用生物素和链霉亲和素以外的配体-抗配体组合，可以使用除寡核苷酸以外的捕获元件，haba可以被省略等。

说明性实施方案10：其中核酸类似物不会包含(或任选地包含)荧光团的单色系统

任选地，可以使用单色系统，通常需要单个碱基的顺序流动。在这种方法中，核苷酸类似物含有通过聚合酶释放的“诱导物”，该聚合酶在α和β磷酸酯之间进行切割并引发磷酸酶，从而导致“诱导物”的释放。诱导物激活捕获元件上的猝灭的染料。如该说明性实施方案中所使用的，“捕获元件”是指结合诱导物而不一定结合标签元件的分子。在图10中，“捕获元件”是含有寡核苷酸拴接的单体fab和荧光团的缀合物的复合物。如图10所示，诱导物可以是抗原，捕获元件可以是抗体、适配体或其他结合分子。抗体结合位点被猝灭剂和抗原的缀合物占据。在通过聚合酶并入碱基并通过磷酸酶切割之后，抗原是未封闭的并且可自由结合捕获元件。在该实施方案中，抗原置换猝灭剂-抗原复合物以结合抗体。在不存在猝灭剂的情况下，抗体可以发射荧光以用于检测。

应认识到，在该实施方案中，核苷酸类似物的结构是

ant-c-pn[1-4]

其中“ant”是指抗原，c是可裂解位点(例如，可被碱性磷酸酶切割的磷酸酯键)并且pn如上文所述的。

用于该方法的合适抗原的示例包括但不限于生物素、fitc、小分子(如氨基酸)、胆固醇和肽。

在结合后，对底物进行成像。在循环完成时通过用缓冲液(任选地含有如本文所述的切割试剂或具有低ph或低盐条件)或用杂交破坏剂(如甲酰胺)洗涤表面而使阵列再生，并且释放抗原。任选地，可以通过加热和熔化寡核苷酸来使阵列再生。

在一些实施方案中，可以使用单色合成测序程序。例如，可以包含不同量的生物素作为可以基于核苷酸而变化的诱导物(如说明性实施方案9中进一步描述的)。例如，a可以包含大于99％的生物素；t可以包含约50％的生物素；c可以包括约25％的生物素，并且g可包括少于10％的生物素或不含生物素。由于在单一延伸步骤中本文所述的核苷酸类似物达到了近100％的并入(例如，大于98％、大于99％或大于99.9％)，并且没有序列上下文相关的信号猝灭(染料不是在并入的核苷酸上)，因此，对于每个碱基所获得的信号与具有生物素的核苷酸的比值足够成正比。使用控制循环或多个实际循环，可以为每个dna斑点定义强度归一化因子和/或背景值。此外，可以为每个归档图像定义强度或背景归一化或校正因子。

示例性实施例11：通过含硼酸盐猝灭剂捕获元件的表面捕获

图11显示了一种变体，其中与猝灭剂-硼酸盐缀合物复合的寡核苷酸拴系的fam-锌螯合物固定在模板附近。核苷酸类似物包含染料(例如甲基或texred)-标记的末端磷酸酯。jangetal.,2005,j.org.chem.70:9603–9606描述了合适的螯合剂。

聚合酶结合碱基并释放染料/磷酸酯复合物。染料/磷酸酯复合物然后通过拴系的fam-锌螯合复合物捕获，置换猝灭剂-硼酸盐，以产生未猝灭的复合物。在没有猝灭的情况下，可能发生荧光发射(在甲基标记的情况下)和/或fret(在texred标记的情况下)。

如图11所示，在循环完成时通过洗涤未猝灭的捕获螯合复合物来再生该阵列。

说明性实施例12：通过含有链霉亲和素的捕获元件的表面捕获

在图12所示的实施方案中，核苷酸类似物含有作为结合分子的封闭的生物素和猝灭的fret对。猝灭的fret对具有背景低的优点。生物素结合到末端磷酸脂，因此被封闭而不与链霉亲和素结合。在通过聚合酶引入碱基并通过磷酸酶切割之后，生物素是未封闭的并且可自由结合捕获元件(例如链霉亲和素)。此外，猝灭剂分子被释放，使得荧光团不被猝灭。

如在图12所描绘的合成测序的实施方案中所示，捕获元件(图12中标记为“结合分子”)可以是具有针对标签元件的抗体的寡核苷酸。在图12中，捕获元件是寡核苷酸拴系的单体链霉亲和素和荧光团分子的缀合物。核苷酸类似物可为该方法提供四色或双色系统。具体地，由于使用相同的捕获元件，因此不同染料的配体和抗配体结合的亲和力没有偏差。由于所有分子以相对相似的速率被捕获，因此经标记的分子的比例可以在混合物中辨别。因此，高亲和力结合限制了扩散，从而能够检测双色系统中的染料比例。

链霉亲和素定位信号。在足够的时间后，对底物进行成像。在循环完成时通过用缓冲液(任选低盐条件)或用杂交破坏剂(如甲酰胺)洗涤表面来再生该阵列。任选地，可以通过加热和熔化寡核苷酸来再生阵列。然后置换捕获元件。

说明性实施方式13通过双色系统中的诱导物的表面捕获

如在图13所描绘的合成测序的实施方案中所示，可以使用两种不同的捕获元件。第一捕获元件可以是寡核苷酸-拴系的单体fab和荧光团分子的缀合物与抗原-荧光猝灭剂分子的缀合物之间的复合物。第二捕获元件可以是寡核苷酸拴系的单体链霉亲和素和荧光团分子的缀合物和haba荧光猝灭剂分子的缀合物之间的复合物。

核苷酸类似物含有封闭诱导物，例如生物素或抗原表位。在通过聚合酶并入碱基并通过磷酸酶切割之后，抗原或生物素是未封闭的并且可自由结合捕获元件。然后，未封闭的抗原可以置换抗原-猝灭剂分子。未封闭的生物素可以置换haba猝灭剂分子。在这种方法中，抗原可以与一种染料结合，而生物素可以与不同的染料相关联。进而，荧光团不再猝灭，并且可以被检测。抗原的示例包括例如生物素、fitc、小分子(如氨基酸)、胆固醇和肽。

在结合后，对底物进行成像。在循环完成时通过用缓冲液(任选低盐条件)或杂交破坏剂(如甲酰胺)洗涤表面来再生该阵列。任选地，可以通过加热和熔化寡核苷酸来再生阵列。然后置换捕获元件。

所附权利要求的化合物和方法的范围不受本文所述的具体化合物和方法的限制，这些化合物和方法意在说明权利要求的几个方面，并且功能上等同的任何化合物和方法在本公开的范围内。化合物和方法的除了本文所示和所述之外的各种修饰将落入所附权利要求的范围内。此外，虽然仅具体描述了这些化合物和方法的某些代表性的化合物、方法和方面，但其他化合物和方法以及化合物和方法的各种特征的组合将落入所附权利要求的范围内，即使没有具体叙述也如此。因此，本文可以明确地提及步骤、元件、组件或组分的组合；然而，包括步骤、元素、组件和组分的所有其他组合，即使没有明确说明也如此。本文引用的所有出版物、专利和专利申请的全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。