本发明涉及微生物和生物技术领域，具体涉及一种利用水稻内生泛菌和小球藻共培养提高小球藻油脂产率的方法。
背景技术：
小球藻是一种单细胞绿藻，其环境适应性强，易于大规模培养，细胞中含有丰富的营养物质，可应用于食品开发、医疗保健品、美容和药品开发等各个领域。小球藻富含短链脂肪酸，是优质的生物柴油原料(徐进,等.高产油小球藻的筛选及其油脂分析.水生生物学报,2012,36(3):426-432.)，而且小球藻所产油脂中的亚油酸和γ-亚麻酸等具有调节血脂、降血黏等功效[张旗，等.小球藻营养活性研究进展.食品研究与开发,2015,36(13):139-142.]。提高小球藻生物量和促进藻细胞营养物质的合成是开发应用小球藻的技术关键。已有研究表明微藻和微生物之间存在从寄生到共生等广泛的互作现象，某些微生物对藻细胞的生长代谢影响显著(Ueda H,et al..Bacterial communities constructed in artificial consortia of bacteria and Chlorella vulgaris.Microbes Environment,2010,25(1):36-40.)。
植物内生菌是能够定殖在健康植物内，并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物。水稻植株含有许多内生微生物，是重要的内生细菌资源，来源于水稻植株的内生泛菌可以显著提高宿主水稻的生物量、叶绿素及磷含量，并影响光合作用产物的转移(FengY,et al.Rice endophyte Pantoea agglomeransYS19 promotes hostplant growth and affects allocations of hostphotosynthates.Journal ofApplied Microbiology,2006,100(5):938-945.刘佳,等.内生成团泛菌HAUM1对宿主水稻的定殖及促生作用.湖北农业科学,2011,50(23):4820-4824.)。由于小球藻与植物细胞一样具有叶绿体，能够进行光合作用，其生化代谢特征与植物具有相似性，理论上，对植物具有代谢调节作用的植物内生菌也能影响小球藻的生长和代谢活动，但迄今国内外未见采用包括水稻内生菌在内的植物内生菌促进小球藻生长及生化组分合成积累的技术研究和应用。
申请公布号CN 103045481 A(申请号为201310004747.X)的中国发明专利申请公开了一种促进小球藻生长并提高其叶绿素和菌体蛋白含量的方法，该技术方案是在小球藻培养液中添加来自生物质热解的内醚糖或经脱毒处理的纤维素热解液，内醚糖添加量为5mM-50mM，纤维素热解液添加量按重量计为0.25％-2％。以纤维素生物质高温热解产物内醚糖或热解液作为促进剂，结果表明：内醚糖或热解液能明显促进小球藻的生长，促进率最高达194％，并可显著提高叶绿素和菌体蛋白含量，从而可提高纤维素生物质的利用价值。
技术实现要素：
本发明提供了一种利用水稻内生泛菌和小球藻共培养提高小球藻油脂产率的方法，该方法能够提高小球藻生物量、油脂含量与油脂产率。
一种利用水稻内生泛菌和小球藻共培养提高小球藻油脂产率的方法，包括：
1)将水稻内生泛菌和小球藻在光照下进行菌藻共培养，培养结束后，得到菌藻共培养液；
2)对菌藻共培养液进行细胞分离，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液，将小球藻细胞沉淀经处理后得到小球藻细胞干品；
3)将小球藻细胞干品粉碎，得到藻粉，之后采用有机溶剂提取液提取总油脂，得到总油脂。
本发明利用水稻内生泛菌和小球藻共培养，从而促进小球藻的生长，提高了小球藻生物量，同时也提高了油脂含量与油脂产率。
以下作为本发明的优选技术方案：
步骤1)中，所述的菌藻共培养的条件为：培养条件均为23℃～33℃，光强1500～2500Lux，光周期为10～14hr昼/10～14hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀2～6次直至培养周期结束，培养周期为9～15天。进一步优选，所述的菌藻共培养的条件为：培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为12天。
所述的水稻内生泛菌与小球藻的菌藻比为0.01～10000：1，在一定范围内，水稻内生泛菌的比例越高，越能够促进小球藻的生长，越能够提高油脂含量与油脂产率。进一步优选，所述的水稻内生泛菌与小球藻的菌藻比为1～1000：1。
所述的水稻内生泛菌可采用市售产品，可采用中国农业微生物保藏中心(ACCC)出售的编码为10454的水稻内生泛菌菌种。
所述的小球藻可以为蛋白核小球藻，也可采用市售产品，可采用中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)市售的编号为FACHB-1222的蛋白核小球藻。
步骤2)中，所述的细胞分离包括：菌藻共培养液先在超声波条件下处理，之后离心，得到小球藻细胞沉淀和内含水稻内生泛菌的上清菌液。
进一步优选，所述的超声波条件为：在140W～180W、30kHz～50kHz超声波条件下处理15s～45s。所述的离心为在1000～1400r/min低速离心3～10min。更进一步优选，所述的超声波条件为：在160W、40kHz超声波条件下处理30s。所述的离心为在1200r/min低速离心5min。在160W、40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
所述的处理包括：洗涤、离心和干燥，将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经6000～10000r/min离心5～20min后收集，之后在30℃～50℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。进一步优选，将小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min后收集，之后在40℃低温条件下烘干，得到小球藻藻细胞干品。
步骤3)中，所述的有机溶剂提取液为氯仿-甲醇提取液，所述的氯仿-甲醇提取液由体积比1～3：1的氯仿和甲醇组成。进一步优选，所述的氯仿-甲醇提取液由体积比2：1的氯仿和甲醇组成。
所述的藻粉的质量与有机溶剂提取液的体积为1g：45～75m1。进一步优选，所述的藻粉的质量与有机溶剂提取液的体积为1g：60m1。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明将水稻内生泛菌应用于小球藻的培养生产，创建了一种应用植物内生菌提高小球藻生物量和油脂产率的菌藻共培养技术，为小球藻的工业化生产提供了新途径。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。本发明以蛋白核小球藻为例，开发一种水稻内生成团泛菌促进小球藻生物量和油脂积累的菌藻共培养技术，但本发明并不只限于蛋白核小球藻。
采用本发明的菌藻共培养技术使蛋白核小球藻的收获细胞干重同比对照组增加了42.80％～150.52％，使藻细胞的油脂含量同比对照增加了85.4％～133.66％，使藻细胞平均每天的油脂产率比对照提高了1.6～4.8倍，而且提取油脂后获得的藻渣蛋白含量在38％以上，可用于制备饲料、饵料和氨基酸制备、药物提取等方面。本发明技术操作简单，在小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。给出的实施例仅为了阐释本发明，而不是为了限制本发明的应用范围。以下实施例中的百分数，在没有特别说明的情况下，均为重量百分数。
实施例一：
1)采用的水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mL LB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养，将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第二次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-Forming Units)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温(25℃)8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为蛋白核小球藻，编号为FACHB-1222，取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mL BG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×105CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为1:1，混匀后进行菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×105个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为12天。
4)培养周期结束后，菌藻共培养组取菌藻共培养液在160W,40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
5)菌藻共培养组将步骤4)离心获得的上清菌液，经测定菌液中水稻内生泛菌有效活菌数为2×105CFU/mL，将此上清菌液8000r/min离心10min获得水稻内生泛菌菌体细胞沉淀，并接种至新鲜LB培养基培养至对数生长期作为再次菌藻共培养的菌体种子细胞，以实现菌细胞的重复循环利用。
6)菌藻共培养组将步骤4)获得的小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min收集小球藻细胞沉淀；纯藻培养对照组将步骤3)获得小球藻细胞培养液直接经8000r/min离心10min收集藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表1。
7)将步骤6)获得的藻细胞干品经机械研磨破碎细胞成粉状，准确称取藻粉0.05g(m1)，转移到10mL干燥离心管，按菌藻粉(g):氯仿-甲醇提取液＝1:60加入3mL氯仿-甲醇浸提液(氯仿：甲醇体积比＝2:1)在干燥密闭容器内室温(25℃)振荡浸提20min，于8000r/min离心10min分别收集上清油脂提取液和藻渣沉淀，对藻渣沉淀重复提取2次，合并离心上清得总油脂提取液，将总油脂提取液置于旋转蒸发仪中40℃条件下真空浓缩2h以上直至去除有机溶剂，得总油脂产品，在烘箱中70℃干燥2h至恒重，称量油脂质量(m2)，计算油脂含量和产率，实验设3次重复，结果取平均值，见表1。
藻细胞油脂含量(％)＝(m2/m1)×100％；
藻油脂产率(mg/L·d)＝藻细胞干重(g)×藻细胞油脂含量(％)/[藻细胞培养体积(L)×培养时间(d)]；
8)将步骤7)获得的藻渣在真空浓缩仪中去除挥发性有机溶剂后得到藻渣产品，称重计算藻渣得率，经半微量凯氏定氮法测定藻渣蛋白含量，结果见表1。
表1菌藻比＝1：1时菌藻共培养组与纯藻培养对照组油脂产率和相关指标的比较
注：表中数据为三组数据平均值。
菌藻共培养提高效率＝[(菌藻共培养组-纯藻培养对照组)/纯藻培养对照组]×100％。
实施例二：
1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mL LB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养,将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行再次扩培，连续扩培三次，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第三次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-Forming Units)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为蛋白核小球藻，编号为FACHB-1222，取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mL BG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组小球藻种子细胞初始接种浓度为2×106个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×108CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为100:1，混匀后进行菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×106个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为20天。
4)培养周期结束后，菌藻共培养组取菌藻共培养液在160W,40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
5)菌藻共培养组将步骤4)离心获得的上清菌液，经测定菌液中水稻内生泛菌有效活菌数为2×106CFU/mL，将此上清菌液8000r/min离心10min获得水稻内生泛菌菌体细胞沉淀，并接种至新鲜LB培养基培养至对数生长期作为再次菌藻共培养的菌体种子细胞，以实现菌细胞的重复循环利用。
6)菌藻共培养组将步骤4)获得的小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min收集小球藻细胞沉淀；纯藻培养对照组将步骤3)获得小球藻细胞培养液直接经8000r/min离心10min收集藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)，结果见表2。
7)将步骤6)获得的藻细胞干品经机械研磨破碎细胞成粉状，准确称取藻粉0.05g(m1)，转移到10mL干燥离心管，按菌藻粉(g):氯仿-甲醇提取液(m1)＝1:60加入3mL氯仿-甲醇浸提液(氯仿：甲醇体积比＝2:1)在干燥密闭容器内室温振荡浸提20min，于8000r/min离心10min分别收集上清油脂提取液和藻渣沉淀，对藻渣沉淀重复提取2次，合并离心上清得总油脂提取液，将总油脂提取液置于旋转蒸发仪中40℃条件下真空浓缩2h以上直至去除有机溶剂，得总油脂产品，在烘箱中70℃干燥2h至恒重，称量油脂质量(m2)，计算油脂含量和产率，实验设3次重复，结果取平均值：
藻细胞油脂含量(％)＝(m2/m1)×100％；
藻油脂产率(mg/L·d)＝藻细胞干重(g)×藻细胞油脂含量(％)/[藻细胞培养体积(L)×培养时间(d)]；
具体结果见表2。
8)将步骤7)获得的藻渣在真空浓缩仪中去除挥发性有机溶剂后得到藻渣产品，称重计算藻渣得率，经半微量凯氏定氮法测定藻渣蛋白含量，结果见表2。
表2菌藻比＝100：1时菌藻共培养组与纯藻培养对照组油脂产率和相关指标的比较
注：表中数据为三组数据平均值。
菌藻共培养提高效率＝[(菌藻共培养组-纯藻培养对照组)/纯藻培养对照组]×100％
实施例三
1)采用水稻内生泛菌菌种购自中国农业微生物保藏中心(ACCC)，编码为10454，菌种按常规方法活化挑单菌落后，接种到含10mL LB液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养，将扩增培养16h后处于对数生长期的菌液按菌液：液体LB培养基体积比＝1：10接种后进行再次扩培，连续扩培三次，培养条件为37℃，200rpm恒温摇床中黑暗培养。第三次扩培10h至OD600＝1作为菌藻共培养的种子细胞，根据生长曲线，菌生长处于对数期，采用常规平板计数法测定培养液中的有效活菌数(CFU，Colony-Forming Units)，此时菌液浓度约为2×108CFU/mL。根据菌藻共培养所需菌细胞数量，取适量种子菌液于室温8000r/min离心10min，沉淀用3倍体积无菌水洗涤两次，再离心10min收集菌体细胞，加入与种子菌液等体积的BG11液体培养基悬浮备用。
2)采用小球藻藻种购自中国科学院野生生物种质库淡水藻种库(FACHB)，具体为蛋白核小球藻，编号为FACHB-1222，取蛋白核小球藻原藻液，按10-2，10-3，10-4进行梯度稀释，取稀释藻液100μL涂布于BG11固体培养基(为BG11液体培养基中添加2％琼脂)，培养皿置于光照培养箱中培养，7天后，BG11培养基中长出深绿色的单藻落，用无菌枪头挑取单藻落到含10mL BG11液体培养基的三角瓶中，进行扩增培养。将扩增培养7天后处于对数生长期的藻细胞按藻液：液体BG11培养基体积比＝1：10接种后进行二次扩培，如此共扩培3次，每次培养7天。培养条件为：28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，每天早晚各摇动一次。第3次扩增培养结束后，应用常规血球板计数法计算细胞培养液中的小球藻细胞浓度为2.6×107个cell/mL，作为小球藻种子细胞培养液。
3)同时设定菌藻共培养组和纯藻培养对照组，其中菌藻共培养组小球藻种子细胞初始接种浓度为2×105个cell/mL，水稻内生泛菌种子细胞初始接种浓度为2×108CFU/mL，如此菌藻细胞接种比为1000:1，混匀后进行菌藻共培养。纯藻培养对照组仅接种小球藻种子细胞，初始接种浓度为2×105个cell/mL。两组培养体系均为500ml×3瓶，培养条件均为28℃，光强2000Lux，光周期为12hr昼/12hr夜，主要为静置培养，每天摇动培养瓶混匀4次直至培养周期结束，培养周期为8天。
4)培养周期结束后，菌藻共培养组取菌藻共培养液在160W,40kHz超声波条件下处理30s，使水稻内生泛菌细胞和小球藻细胞发生分离，1200r/min低速离心5min，使较大的小球藻细胞沉淀下来而较小的水稻内生泛菌仍悬浮上清中，分别收集沉淀中的小球藻细胞和上清中的水稻内生泛菌细胞。
5)菌藻共培养组将步骤4)离心获得的上清菌液，经测定菌液中水稻内生泛菌有效活菌数为5×106CFU/mL，将此上清菌液8000r/min离心10min获得水稻内生泛菌菌体细胞沉淀，并接种至新鲜LB培养基培养至对数生长期作为再次菌藻共培养的菌体种子细胞，以实现菌细胞的重复循环利用。
6)菌藻共培养组将步骤4)获得的小球藻细胞沉淀加入蒸馏水重悬洗涤后，经8000r/min离心10min收集小球藻细胞沉淀；纯藻培养对照组将步骤3)获得小球藻细胞培养液直接经8000r/min离心10min收集藻细胞沉淀；在40℃低温条件下烘干藻细胞沉淀至恒重获得小球藻细胞干品，对藻细胞干品进行称量计算藻细胞干重得率(mg/L)结果见表3。
7)将步骤6)获得的藻细胞干品经机械研磨破碎细胞成粉状，准确称取藻粉0.05g(m1)，转移到10mL干燥离心管，按菌藻粉(g):氯仿-甲醇提取液(m1)＝1:60加入3mL氯仿：甲醇(2：1)提取液，混匀，室温25℃振荡浸提20min，于8000r/min离心10min收集上清。再重复提取两次，将三次提取获得的上清合并至10mL离心管，置于真空浓缩仪中40℃条件下真空浓缩1-2h去除有机溶剂，在烘箱中70℃干燥2h至恒重，称量油脂质量(m2)，计算油脂含量和产率。实验设3次重复，结果取平均值，结果见表3：
藻细胞油脂含量(％)＝(m2/m1)×100％；
油脂产率(mg/L·d)＝藻细胞干重(g)×藻细胞油脂含量(％)/[藻细胞培养体积(L)×培养时间(d)]；
8)将步骤7)获得的藻渣在真空浓缩仪中去除挥发性有机溶剂后得到藻渣产品，称重计算藻渣得率，经半微量凯氏定氮法测定藻渣蛋白含量，结果见表3。
表3菌藻比＝1000：1时菌藻共培养组与纯藻培养对照组油脂产率和相关指标的比较
注：表中数据为三组数据平均值。
菌藻共培养提高效率＝[(菌藻共培养组-纯藻培养对照组)/纯藻培养对照组]×100％
采用本发明的菌藻共培养技术使蛋白核小球藻的收获细胞干重同比对照组增加了42.80％～150.52％，使藻细胞的油脂含量同比对照增加了85.4％～133.66％，使藻细胞平均每天的油脂产率比对照提高了1.6～4.8倍，而且提取油脂后获得的藻渣蛋白含量在38％以上，可用于制备饲料、饵料和氨基酸制备、药物提取等方面。本发明技术操作简单，在小球藻的应用开发方面效益显著，前景广阔。