一种赤红球菌PTA-2及其固定化和应用的制作方法

本发明涉及环境微生物技术领域，具体地涉及一种赤红球菌pta-2及其固定化和应用。

背景技术：

对甲苯磺酸是一种重要的化工原料，被广泛用作合成医药(如萘普生、强力霉素等)、农药(如精喹禾灵、三氯杀螨醇等)及染料(酸性橙7等)的中间体；也被用作合成酯类(如丙酸苄酯、丁酸苄酯等)的催化剂、聚合反应的稳定剂以及树脂、油漆、涂料、铸造、人造板等行业的固化剂；同时在石油化工、医疗、塑料等行业中也广泛存在。

对甲苯磺酸具有中等毒性，对眼睛、皮肤、粘膜等都有刺激性。因其分子结构中的磺酸基团亲水性强，使其易溶于水、醇、醚，难溶于苯、甲苯和二甲苯等苯系溶剂；另外，该物质具有较强的生物毒性抑制性作用，其bod5/cod为0，因此，这类废水若直接排放到环境中，将会对生态系统以及人类健康造成极其严重的影响。

微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，已在很多方面得到应用，所以筛选出对甲苯磺酸降解菌对于处理对甲苯磺酸生产废水具有重大意义。

技术实现要素：

本发明提供了一种赤红球菌pta-2，其能以对甲苯磺酸为唯一碳源进行生长，对甲苯磺酸的降解率达90％。

本发明的技术方案是这样的，一种赤红球菌pta-2，其分类命名为rhodococcusruberpta-2，保藏日期为2015年2月9日，保藏单位全称为中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，其保藏登记号为cgmccno.10538。

本发明还提供了上述赤红球菌pta-2制备的固定化小球，其制备是采用cacl2和活性炭进行固定化，具体制备过程，包括下列步骤：

1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于lb液体培养基中于30-37℃，160-220r/min条件下振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌液于10000-12000r/min的条件下离心2-3min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后10000-12000r/min离心2-3min，如此洗两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液；

3)称取1.2g海藻酸钠溶解于20ml蒸馏水中，加入500mg/l活性炭粉末，超声分散。

4)取1ml菌体液与20ml的步骤3)溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的4％cacl2溶液，于4℃交联钙化8h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。

步骤1)中所述的lb培养基为：nacl10.0g/l,蛋白胨10.0g/l,酵母粉5.0g/l,ph7.0。

本发明还提供了所述固定化小球在对甲苯磺酸降解中的应用。

所述固定化小球在对甲苯磺酸降解中的应用，具体为：1)将固定化小球在废水中曝气10-15h进行活化，活化过程中保持水温26-30℃，曝气量为1-1.5l/min；2)将废水中对甲苯磺酸浓度调整≤2000mg/l，温度调整为26-30℃，ph值调整为6.8-7.2后，将活化后固定化小球加入至废水中，以1-1.5l/min曝气量进行曝气，水力停留时间为72h以上，其中，固定化小球的加入量与废水的体积比18-20：100。

优选的，进水废水中对甲苯磺酸浓度调整≤500mg/l。

本发明所述的赤红球菌pta-2能以对甲苯磺酸为唯一碳源进行生长，对500mg/l对甲苯磺酸的降解率达96％；本发明所述的赤红球菌pta-2所制备的固定化小球，对500mg/l对甲苯磺酸的降解率达到90％以上，具有很好的降解效果，另外，固定化小球生产成本低，使用方便，适合在含有对甲苯磺酸的废水处理中推广使用。

附图说明

图1是赤红球菌pta-2菌体结晶紫染色照片(1000x)；

图2是赤红球菌pta-2以对甲基苯磺酸为唯一碳源生长曲线；

图3是固定化小球对对甲苯磺酸去除率随时间变化的曲线图；

图4是固定化小球对废水中不同对甲苯磺酸浓度的降解去除率的对比图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1赤红球菌pta-2的分离和鉴定

赤红球菌pta-2是从农药化工厂污水处理站活性污泥池分离筛选得到。

筛选的具体过程为：

1)取农药化工厂污水处理站活性污泥5ml，接种至含200mg/l对甲基苯磺酸的无机盐培养基中，其配方为：200mg/l对甲基苯磺酸、1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/l(nh4)2so4，摇床培养箱30℃-37℃培养至7天后，去混合液5m接种至含有400mg/l对甲基苯磺酸的无机盐培养基中，配方为：400mg/l对甲基苯磺酸、1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/l(nh4)2so4，培养7天后获富集液；

2)取对甲苯磺酸富集菌液1.0ml，加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-1的富集液，再吸取1.0ml配好的10^-1的富集液加入9.0ml无菌水中，充分混匀配成10^-2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1ml涂布于含500ug/l对甲苯磺酸的无机盐固体培养基上，其配方为：500ug/l对甲苯磺酸、1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/l(nh4)2so4，20g/l琼脂，ph7.0，30℃培养7天；7天后从以上的无机盐固体培养基上挑取单菌落，于5ml的lb液体培养基中培养24小时后，于8000r/min的条件下离心2min，倒去上清液，加入5ml的无菌水摇匀，仍于8000r/min的条件下离心2min，按此方法用无菌水洗两遍后，加入5ml无菌水悬浮该菌。吸取1ml该菌液加入100ml对甲苯磺酸浓度为500ug/l的无机盐液体培养基中，其配方为：500ug/l对甲苯磺酸、1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/l(nh4)2so4，ph7.0，于160r/min，30℃条件下振荡培养72h后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率最高的一株菌株进行保存，其菌体革兰氏染色照片(1000x)如图1所示，经16srdna鉴定，属于赤红球菌属(rhodococcusruber)；该菌株的16srdna基因序列如seqidno：1所示，该菌株分类命名为rhodococcusruberpta-2，并于2015年2月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏登记号为cgmccno.10538。

该赤红球菌pta-2主要生物学特性为革兰氏阴性，以周生鞭毛运动，专性好氧，严格呼吸代谢，专性好氧，氧化酶和接触酶阳性，不产生吲哚，不水解纤维素和七叶灵。

实施例2赤红球菌pta-2以对甲苯磺酸为唯一碳源的培养状况

从生长有赤红球菌pta-2的平板上挑取一单菌落，接种于lb液体培养基中，于30℃，160rpm摇床中培养12h(od600≈1.0)，8000-12000rpm离心后，弃去上清液，用无菌水洗涤三次，重悬于等体积的无菌水中作为种子液。

在250ml三角瓶中装入含200mg/l对甲基苯磺酸的无机盐培养基，其配方为：200mg/l对甲基苯磺酸、1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl、1.0g/l(nh4)2so4，按1％(体积分数)的接种量接入pta-2种子液，于30℃、160rpm摇床中培养，每隔2h取出4ml培养液，样品经8000rpm离心机离心后弃去上清液，重悬于等体积的无菌水中测定od600，根据实验数据绘制赤红球菌pta-2利用p-tsa的生长曲线，如图2所示，其表明赤红球菌pta-2能以对甲苯磺酸为唯一碳源进行生长，经测定，对500mg/l对甲苯磺酸的降解率达96％。

实施例3赤红球菌pta-2制备成固定化小球的方法

1)用接种环在斜面培养基上挑取少量菌种接种于lb液体培养基中，于30℃，160r/min条件下振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌液于10000r/min的条件下离心2min，倒掉上清液，加入相同体积的无菌水，摇匀后10000r/min离心2min,如此洗两遍，用相同体积的无菌水悬浮，制成菌体液。

3)称取1.2g海藻酸钠溶解于20ml蒸馏水中，加入500mg/l活性炭粉末，超声分散。

4)取1ml菌体液与20ml的步骤3)溶液于常温混匀，然后用注射器将混合液滴入常温下的4％cacl2溶液，于4℃交联钙化8h后得到海藻酸钙凝胶固定化小球，无菌水洗两遍保存于4℃备用。

其中，步骤1)中所述的lb培养基为：nacl10.0g/l,蛋白胨10.0g/l,酵母粉5.0g/l,ph7.0。

实施例4固定化小球在对甲苯磺酸降解中的应用方法

1)将实施例3固定化小球在废水中曝气10h进行活化，活化过程中水温26-30℃，曝气量在1.5l/min；

2)将废水温度调整为26-30℃，ph值调整为6.8-7.2中，废水中对甲苯磺酸浓度调整为分别调整为500、1000、1500和2000mg/l后，每升废水中加入200ml固定化小球，以1.5l/min曝气量进行曝气，水力停留时间为72h，对甲苯磺酸的降解率如图3所示。

当进水废水中对甲苯磺酸的浓度为500mg/时，随着水力停留时间的增加，对甲苯磺酸的降解率如图4所示。

从图3可看出，对甲苯磺酸的去除率随着进水废水中对甲苯磺酸的浓度的升高而降低，当进水废水中对甲苯磺酸浓度在低于2000mg/l的范围内时，对甲苯磺酸都有较高的去除率，可以达到85％以上，在进水废水中对甲苯磺酸浓度为500mg/l的范围内时，对甲苯磺酸去除率达到最高，达95％以上。

从图4可看出，当进水废水中对甲苯磺酸的浓度为500mg/时，随着水力停留时间的增加，对甲苯磺酸的降解率升高的，当水力停留时间为72h时，对甲苯磺酸的去除率，达95％以上。

实施例4中废水经配置而成，由无机盐和相应含量的对甲苯磺酸组成，无机盐的含量为：1.5g/lk2hpo4、0.5g/lkh2po4、0.2g/lmgso4·7h2o、1.0g/lnacl和1.0g/l(nh4)2so4。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。