技术领域本发明涉及一种用于病毒检测的PCR引物组、含有该引物的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于巢式PCR检测猫艾滋病病毒的引物组、含有该引物组的试剂盒及其用途。本发明属于生物检测技术领域，
背景技术：
猫获得性免疫缺陷综合征(Felineacquiredimmunodeficiencysyndrome；FAIDS)是由猫免疫缺陷病毒(FelineImmunodeficiencyVirus,FIV)引起的，临床上主要表现为免疫功能低下(CD4T淋巴细胞数量严重下降)，呼吸、消化系统炎症，神经系统功能障碍及死亡。由于在病原学、临床症状、致病机理等方面与人艾滋病极其相似，故又称为猫艾滋病。FIV自然情况下感染20多种猫科动物，在世界范围内广泛存在。在家猫中主要发生于流浪猫，感染率随年龄增长而增高，且与流浪猫的密度成正比，一般家猫发病率在3％(北美)～40％(日本)，某些地区非家猫的感染率达100％。本病潜伏期长，从感染到出现临床症状约需3～10年。在FIV阳性的死亡动物病例中，猫艾滋病并不是直接致死原因，而是由于FIV长期损害免疫系统，造成机体对其他疾病的易感性增强，发生继发感染而死。近年来，非洲狮、美洲豹和虎等野外生存的大型猫科动物的FIV感染率和死亡率逐年上升，是非洲狮数目锐减的主要原因。我国动物园大型猫科动物感染FIV的风险很高，且现有的慢病毒疫苗无法有效保护猫科动物。既然目前尚无有效保护野生猫科动物的FIV疫苗，那么实践中只能以早期诊断、切断传播途径为主要预防措施。目前在猫艾滋病的诊断方法中，多是以免疫学诊断方法为主，主要是利用双抗夹心ELISA和间接ELISA原理检测猫艾滋病病毒抗原或抗体，但特异性、灵敏度并不是很好，而且假阳性率较高。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的一个金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术等,而PCR引物的设计成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。由于猫艾滋病病毒是反转录病毒，在反转录过程中很容易发生错配，且这种错配得不到纠正，再加上基因变异频率高，目前临床上已知的主要有5个亚型，在本病毒的基因组参考序列中，找不到高度保守、不变的引物序列，因此，本发明在对大量参考序列进行分析后，经过总结比对，设计出内套和外套引物各一对，并且在每对引物中引入简并碱基，保证引物适用于任何亚型的猫艾滋病病毒检测。利用巢式PCR技术对猫艾滋病病毒进行检测，能够克服单次扩增平台期效应的限制，使扩增倍数提高，从而极大的提高了PCR的敏感性，降低了非特异性反应连续放大进行的可能性，保证了反应的特异性，而且内侧引物扩增的模板是外侧引物扩增的产物，第二阶段反应能否进行，也是对第一阶段反应正确性的鉴定，进而保证了整个反应的准确性及可行性。此外，巢式PCR比常规PCR引物的特异性、敏感性更强，所以利用巢式PCR技术对猫艾滋病病毒进行检测，其检测结果比常规PCR方法更为精确。利用巢式PCR方法对猫艾滋病病毒实施精准检测，对预防猫艾滋病病毒感染的传播和我国动物园猫科动物疾病管理具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种精准、特异检测猫艾滋病病毒感染的PCR方法。本发明的目的是这样实现的：本发明选择猫艾滋病病毒Gag基因为靶基因，通过基因序列的比对分析，选取靶基因的相对保守区设计合成内、外两套引物，建立了巢式PCR检测方法，对实验证明，本发明设计的引物组能够实现对猫艾滋病病毒的精准定性检测。具体的，本发明一种利用巢式PCR法检测猫艾滋病病毒的引物组，由内外两套引物组成，其中，内套引物中上游引物的碱基序列如SEQIDNO.1所示，下游引物的碱基序列如SEQIDNO.2所示，外套引物中上游引物的碱基序列如SEQIDNO.3所示，下游引物的碱基序列如SEQIDNO.4所示。进一步的，本发明还提出了所述的引物组在制备检测猫艾滋病病毒试剂中的用途。一种利用巢式PCR方法检测猫艾滋病病毒的诊断试剂盒，其含有本发明所述的引物组。在本发明中，优选的，所述的诊断试剂盒还包含阳性对照品、阴性对照品、TaqDNA聚合酶和PCR反应液。综上，本发明根据猫艾滋病病毒Gag基因的相对保守区设计合成了内套、外套两对引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了猫艾滋病病毒巢式PCR精准检测方法。本发明分别以猫艾滋病病毒、猫细小病毒HRB090516、猫瘟病毒HRB110402、猫杯状病毒HRB140907、猫白血病病毒HRB060702、猫疱疹病毒HRB120314的基因组进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对猫艾滋病病毒进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他病毒之间无交叉反应。此外，灵敏度试验表明本发明方法对猫艾滋病病毒具有高度的检测灵敏性，最低检测下限可达到0.015ug/mL。因此本发明可用于临床猫艾滋病病毒的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。附图说明图1为巢式PCR方法检测猫艾滋病病毒检测方法的建立；M:DNAMarker2000；1-2:巢式PCRFIV阳性结果；3:巢式PCRFIV阴性结果；图2为利用本发明的巢式PCR方法检测猫艾滋病病毒的特异性检测结果；M:DNAMarker2000；1-2:巢式PCRFIV阳性结果；3-7为猫细小病毒HRB090516、猫瘟病毒HRB110402、猫杯状病毒HRB140907、猫白血病病毒HRB060702、猫疱疹病毒HRB120314基因组阴性结果。图3为利用本发明的巢式PCR方法检测猫艾滋病病毒的灵敏度检测结果。M:DNAMarker2000；1：模板浓度为1.88ug/mL；2：模板浓度为0.376ug/mL；3：模板浓度为0.0752ug/mL；4：模板浓度为0.015ug/mL；5：模板浓度为0.003ug/mL；6：模板浓度为0.0006ug/mL。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1引物的设计与合成本发明在对大量参考序列进行分析后，经过总结比对，选择猫艾滋病病毒Gag基因为靶基因，通过基因序列的比对分析，选取靶基因的相对保守区设计合成内、外两套引物(表1所示)，并且在每对引物中引入简并碱基，保证引物适用于任何亚型的猫艾滋病病毒检测。引物序列交由生物公司合成。表1引物序列注：D＝A,G,T；R＝A,G；H＝A,C,T；Y＝C,T.实施例2猫艾滋病病毒的诊断试剂盒的建立猫艾滋病病毒的诊断试剂盒由以下各部分组成：1、引物引物序列如实施例1表1所示。2、阳性对照品采用巢式PCR法扩增猫艾滋病病毒Gag基因片段，将PCR产物与pMD-19-Tvector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，并对其进行序列测定、酶切分析，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒；具体操作如下：(1)cDNA的获取按试剂盒说明书提取病毒总RNA，用30ul洗脱液洗脱后随机引物在反转录酶作用下进行反转录合成cDNA，反应体系为RTbuffer8ul，RTAce2ul，dNTPs4ul，RRI1ul，DEPC水3ul共18ul。向总RNA中加入2ul下游引物，75℃水浴10min，取出后冰浴5min，向每个RNA样中加入18ul上述反转录体系，42℃水浴1h，最后72℃水浴15min，得到体外经反转录酶催化得到的cDNA；(2)PCR扩增PCR扩增反应体系：总体系25ul，2.5ul10*ExTaqbuffer，2uldNTPs，上下游引物各1ul，0.5ulExTaq酶，共22ul，取3ulcDNA为模板进行PCR扩增。反应条件为：预变性95℃/5min；95℃/1min，54℃/45s，72℃/10min，30个循环；72℃/7min。(3)PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。(4)第一次PCR反应及产物的回收(5)第二次PCR扩增以第一次的PCR产物为模板，取5ul加入PCR反应体系，两次扩增反应条件相同，反应条件为：95℃/2min；94℃/1min，50℃/45s，72℃/1min；75℃/5min；共35个循环，75℃延伸5min。PCR体系均为50ul。(6)第二次PCR扩增产物的回收(7)PCR产物连接、转化、双酶切鉴定(BamHⅠ、SphⅠ)，PCR产物胶回收后得到目的片段，与pMD-18T载体连接，获得重组质粒pMD18-T-gag，重组质粒转移到TG1上，37℃震荡培养1小时，转移到具有氨苄抗性的的平板上倒置培养生长至少8小时，挑取单菌落，于37℃震荡培养箱中培养过夜，次日用试剂盒提取质粒，所提质粒经双酶切鉴定(BamHⅠ、SphⅠ)，验证其分子量大2.3.9基因序列的分析，经测序分析证明得到阳性克隆的准确性。(8)提取并纯化重组质粒pMD18-T-gag，即为阳性对照品。3、阴性对照品：去离子水4、TaqDNA聚合酶5、10*ExTaqbuffer。6、dNTP。实施例3本发明的引物组或试剂盒在检测猫艾滋病病毒中的用途检测具体操作如下：1、制备模板参照TIANampBacteriaDNAKit说明书进行猫艾滋病病毒cDNA的提取和纯化；2、PCR反应体系经过优化，确定了猫艾滋病病毒巢式PCR方法的检测反应体系和反应条件，即：PCR扩增反应体系：总体系25ul，2.5ul10*ExTaqbuffer，2uldNTPs，10μM上下游引物各1ul，0.5ulExTaq酶，共22ul，取3ulcDNA为模板进行PCR扩增。反应条件为：预变性95℃/5min；95℃/1min，54℃/45s，72℃/10min，30个循环；72℃/7min。3、利用琼脂糖凝胶电泳方法判断检测结果。相应的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。4、特异性实验本发明分别以猫艾滋病病毒、猫细小病毒HRB090516、猫瘟病毒HRB110402、猫杯状病毒HRB140907、猫白血病病毒HRB060702、猫疱疹病毒HRB120314的基因组进行试验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对猫艾滋病病毒进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他病毒之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性(见图2)。本发明的试剂盒还具有快速简单、精准的优点。5、灵敏度试验采集猫全血，利用DNA提取试剂盒从猫全血中提取浓度约为1.88ug/mL的基因组DNA，进行5倍梯度稀释(0.376ug/mL、0.0752ug/mL、0.015ug/mL、0.003ug/mL、0.0006ug/mL)，从每级稀释液中各取1μL作为模板利用建立的巢式PCR方法进行检测，以确定该方法的检测灵敏性。结果显示，本发明方法具有高度的检测灵敏性，最低检测下限可达到0.015ug/mL(见图3)。6、重复性和稳定性实验利用本发明方法重复30次检测同一阳性标准品，检测结果均相同；两次(时间间隔3个月)检测同一批次制备的阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。