一种人体胃中微生物总DNA的提取方法与流程

本发明涉及一种人体胃中微生物总DNA的提取方法，属于生物技术科学领域。

背景技术：

胃是人体消化系统的重要部分，由于胃酸的分泌使其所包含的微生物成为消化道微生物生态系统中特殊的一部分，胃中复杂的微生物群落及其代谢产物与人体的健康和疾病有着密切关系，在人体能量代谢、营养吸收、免疫系统、胃肠道功能等方面发挥着重要作用。在胃中微生物的群落结构的研究过程中，微生物总DNA的提取显得尤为重要。然而由于胃中微生物丰度较低以及低pH的特殊环境，造成胃中微生物总DNA提取效率低下，并且提取效果差。常见提取方式采用胃粘膜组织作为实验样本，配合微生物DNA提取试剂盒进行提取，效率低下，且大部分为胃粘膜组织的人体基因组DNA，极少的部分是微生物的DNA。这样提取所得的DNA进行后续的分子生态学研究不能全面准确的反应胃中微生物群落结构与功能情况。因此一种能够有效解决样品低pH因素以及人体基因组DNA带来干扰的胃微生物总DNA提取方法的开发很有必要。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种人体胃中微生物总DNA的提取方法，该方法能够大幅提高胃中微生物的总DNA提取效率和质量。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种人体胃中微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：

步骤1，将等体积的胃冲洗液和乙醇溶液混合，于-20℃下静置一段时间，将静置后的物料于4℃下离心分离，离心分离后去除上清液，得到固相A；

步骤2，向步骤1的固相A中加入所需量的缓冲液，混合均匀后将混合物料于4℃下进行第一次离心分离，离心分离后去除上清液，保留固相；将所得的固相于4℃下进行第二次离心分离，离心分离后去除上清液，得到固相B；

步骤3，向步骤2的固相B中依次加入所需量的蛋白酶K和缓冲液，混合均匀后于56℃下进行水浴加热，加热后得到液相C；

步骤4，将步骤3的液相C使用DNA提取试剂盒进行总DNA的提取，得到总DNA，再使用微量紫外可见分光光度计，进行DNA总含量的测定；

步骤5，聚合酶链式反应扩增：PCR扩增16S rRNAv1-v2区，得到的PCR产物采用琼脂糖凝胶进行电泳检测，最终得到微生物总DNA的质量。

其中，步骤1中，所述胃冲洗液的加入体积为10～20mL，所述乙醇溶液的加入体积为10～20mL，其中，所述乙醇溶液的质量百分浓度为100％。

其中，步骤1中，所述离心分离的转速为15000转/分钟，离心时间为10～15分钟。

其中，步骤2中，所述缓冲液由如下质量的组分组成：每1L缓冲液中，含有137mmol氯化钠、2.7mmol氯化钾、10mmol磷酸氢二钾以及2mmol磷酸二氢钾。

其中，步骤2中，所述缓冲液的加入量为10mL。

其中，步骤2中，所述第一次离心分离的转速为15000转/分钟，离心时间为10～15分钟；所述第二次离心分离的转速为15000转/分钟，离心时间为5分钟。

其中，步骤3中，所述蛋白酶K的加入量为20μL，所述缓冲液的加入量为200μL。

其中，步骤3中，所述水浴加热的时间为60分钟。

其中，步骤5中，16S rRNAv1-v2引物为：

27F-5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和

338R-5’GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

其中，步骤5中，所述琼脂糖凝胶的质量百分浓度为1％。

有益效果：相比于现有的胃粘膜提取DNA方法，本发明提取胃中微生物总DNA的方法有效解决了由于样品低pH因素和人体基因组DNA干扰而导致的提取效率低和效果差的问题，其提取效率提高了一倍以上，所提取的微生物DNA浓度高，微生物总DNA占有比例高，16S rRNAv1-v2区PCR产物条带明亮清晰，进而能够更加准确全面反应胃中的微生物状况，为后续微生物群落结构与功能的研究奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1和对比实施例得到的PCR产物条带对比效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

实施例1

本发明胃中微生物总DNA的提取方法，具体包括如下步骤：

步骤1，将15mL临床中所得的胃冲洗液和15mL质量百分浓度为100％的乙醇溶液混合，于-20℃下保存24h，将保存后的物料于4℃下置于恒速离心机中，采用15000转/分钟的转速离心10min，离心后去除上清液，得到固相A；

步骤2，向固相A中加入10mL缓冲液(若缓冲液量的加入量太低，则不能完全消除胃酸的所带来的低pH干扰，若缓冲液量的加入量太高，则有较多微生物残存于液相中而被遗弃，影响DNA的提取效率)，使用振荡器振荡2min混合均匀，混合均匀后将混合物料于4℃下置于恒速离心机中，采用15000转/分钟的转速离心10min，离心分离后去除上清液，保留固相；将所得的固相于4℃下继续置于恒速离心机中，采用15000转/分钟的转速离心5min，离心分离后去除上清液，得到固相B；两次离心去除上清液，进一步去除了胃冲洗液中胃酸的干扰；

步骤3，向固相B中依次加入20μL蛋白酶K和200μL缓冲液，使用振荡器振荡2min混合均匀，混合均匀后置于56℃水浴中加热60分钟，保证蛋白酶K充分反应，得到液相C；

步骤4，将液相C使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行微生物总DNA的提取，得到总DNA；再使用Nanodrop 2000，进行DNA含量的测定。

步骤5，聚合酶链式反应扩增：PCR扩增16S rRNA v1-v2区，得到的PCR产物使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以排除人体基因组DNA干扰，确定微生物总DNA的质量；其中，16S rRNAv1-v2引物为：

27F-5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和

338R-5’GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

本发明提取方法胃冲洗液的加入体积为10～20mL，预处理后所得固相样品是DNA提取试剂盒最佳上样量，胃冲洗液低于10mL，则所提DNA浓度较低，不符合后续试验需求，高于20mL，则DNA浓度不会随之提高，反而增加了胃酸的影响。

本发明提取方法中所使用缓冲液的配方为：每1L缓冲液中，含有137mmol氯化钠、2.7mmol氯化钾、10mmol磷酸氢二钾以及2mmol磷酸二氢钾。使用该缓冲液时，采用浓盐酸将缓冲液的PH值调节至7.4。在样品中加入适量的缓冲液，能够克服样品中胃酸的影响，并且使体系的pH为7左右。

实施例1得到的微生物DNA的浓度为162.8ng/μL，OD260/280为1.98(OD260为核酸的吸光度，OD280为蛋白质的吸光度，当OD260/280在1.8～2.0之间，说明该DNA纯度高，没有受到蛋白组和RNA的影响)。

对比实施例

现有技术的胃中微生物总DNA的提取方法，包括如下步骤：

步骤1，取20mg胃粘膜组织，使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行总DNA的提取，得到总DNA；

步骤2，再使用Nanodrop 2000，进行DNA含量的测定；

步骤3，聚合酶链式反应扩增：PCR扩增16S rRNA v1-v2区，得到的PCR产物使用质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，以排除人体基因组DNA干扰，确定微生物总DNA的质量；其中，16S rRNAv1-v2引物为：

27F-5’-GCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和

338R-5’GCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNCATGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’。

对比实施例得到的微生物DNA的浓度为76.6ng/μL，OD260/280为1.68。

图1为实施例1和对比实施例得到的DNA的16S rRNAv1-v2PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示，实施例1的16S rRNAv1-v2PCR产物条带明亮清晰，对比实施例的16S rRNAv1-v2PCR产物条带暗淡模糊。

本发明提取方法所选的样本为胃冲洗液，区别于传统方法所采用的人体胃粘膜组织，胃冲洗液几乎不含有人体细胞和组织，因此采用胃冲洗液作为样本所提取到的DNA绝大部分来自于胃中微生物，而非人体细胞组织，从而克服了人体基因组DNA的干扰；另外再通过PCR采用微生物专有引物扩增16S rRNAv1-v2区，进行PCR验证，进一步排除人体基因组DNA的干扰。

本发明提取方法通过加入等体积100％乙醇，形成50％酒精体系，固定了胃冲洗液中的微生物，有效地保存了微生物总DNA；通过加入适量缓冲液并离心分离去除上清液，让微生物沉降于固相中，从而去除了胃冲洗液中胃酸的干扰；再向固相中加入缓冲液，调整样本pH为7左右，再次离心去除上清液，进一步去除胃酸的干扰，从而克服了样品低pH的干扰。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。