一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物及其试剂盒的制作方法

本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物及其试剂盒。

背景技术：

短体线虫，也称为根腐线虫，是一种重要的迁移性内寄生线虫，该类线虫由70多个有效种组成。短体线虫在植物根内移动、穿刺和取食引起根组织形成坏死斑、空腔进而使根组织坏死。由于植株根部坏死，被短体线虫危害的植物会表现出缺水和营养不足的症状，短体线虫是造成经济损失最大的三类植物线虫之一。

玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫均可危害甘蔗，而且会复合侵染；另外这三种短体线虫不单分布广泛，而且寄主也较广，除侵染甘蔗外，还可以侵染其它重要的农作物，如玉米。只有正确鉴定区分这三种线虫，才能在实际工作中制定合理的防治措施，避免更大的经济损失。因此，正确、精确的鉴定三种短体线虫对于实际工作具有重要的意义。

然而，目前对短体线虫的鉴定主要是依据传统形态学的方法，而根据形态鉴定玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫是一个复杂而费时的工作。特别是对于玉米短体线虫和拟玉米短体线虫，它们形态极为相似，可用于区分的特征很少，而且在甘蔗地里会混合出现，这就需要鉴定人员有非常丰富的形态鉴定经验。此外，形态学的鉴定方法只能准确地鉴定短体线虫的成熟雌虫，但是在田间调查的时候，常常是大量的线虫处于幼虫阶段，还包括其他种类的线虫，要通过形态学方法准确地鉴定这些短体线虫幼虫，几乎是不可能的，实际工作中往往会出现鉴定的准确性低的问题，因此，在实际的工作中，准确地区分玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫这三种线虫，以评价三种线虫的感染情况，是很困难的。

环介导等温扩增（ loop-mediated isothermal amplification, LAMP）的方法具有方法简单、快速高效的特点，国内外已有报道利用该方法检测一些重要植物线虫，如：松材线虫、根结线虫、香蕉穿孔线虫和柑橘半穿刺线虫等。然而，目前国内外还未见有通过环介导等温扩增方法鉴定和检测短体线虫的报道。由于玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫侵染甘蔗的根部，严重的影响甘蔗的产量与品质。因此，为避免更大的经济损失，亟需一种能够高效、准确鉴定这三种短体线虫的分子生物学方法。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服现有玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫鉴定检测技术的不足，尤其是难以区分三者的缺陷，提供一种更加安全、简单、快速、高效、特异性好、灵敏性高的鉴定区分检测玉米短体线虫（Pratylenchus zeae）、拟玉米短体线虫（P. parazeae）和最短尾短体线虫（P. brachyurus）的环介导等温扩增方法。该方法仅需要使用恒温水浴，而且可以通过裸眼观察直接判断样品中是否分别含有靶标的玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

本发明的目的是提供一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物。

本发明另一目的是提供一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物，包括三组引物，分别为外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP，外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP，以及外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～12所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

上述的鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物在鉴定或检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，或在制备鉴定或检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的试剂盒方面的应用，都应在本发明的保护范围之内。

一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温检测方法，是同时以待测样品DNA为模板，分别利用所述的三组引物进行环介导等温扩增反应，根据扩增反应的结果判断样品中所含线虫的种类。

一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温检测试剂盒，包含上述三组引物，所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

进一步优选地，所述试剂盒还包含环介导等温扩增反应所需要的DNA聚合酶、甜菜碱、MgSO₄、缓冲液和/或dNTPS。

优选地，试剂盒的使用方法为：同时以待测样品DNA为模板，分别利用所述的三组引物进行环介导等温扩增反应，根据扩增反应的结果判断样品中所含线虫的种类。

进一步地，所述根据扩增反应的结果判断样品中所含线虫的种类的方法和标准是：

将扩增产物分别进行凝胶电泳，如果外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有玉米短体线虫；如果外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有拟玉米短体线虫；如果外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有最短尾短体线虫；

或者分别向扩增产物中加入SYBR Green I或钙黄绿素，如果外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP组的扩增产物颜色发生变化（具体是由橘红色变为浅绿色），则判定样品中含有玉米短体线虫；如果外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP组的扩增产物颜色发生变化（具体是由橘红色变为浅绿色），则判定样品中含有拟玉米短体线虫；如果外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP组的扩增产物颜色发生变化（具体是由橘红色变为浅绿色），则判定样品中含有最短尾短体线虫。

另外，优选地，所述环介导等温扩增反应的反应体系为：每25 μL 体系中加入1 μL DNA，0.2 μM外引物对，1.6 μM内引物对，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶缓冲液，4 μL甜菜碱（5 M），1.5 μL MgSO₄ (100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O补足。

优选地，所述三种短体线虫环介导等温扩增反应的反应条件为：64℃反应60 min。

上述方法或试剂盒在鉴定区分或检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫方面的应用，尤其是在同时检测甘蔗上玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫这三种短体线虫方面的应用，也在本发明的保护范围之内。

本发明通过大量的研究和探索，最终得到的上述外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP，外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP，外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP，并建立了环介导等温扩增方法，不仅能够特异地鉴定区分玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条，灵敏度是普通PCR方法的10倍，效果非常好，灵敏度很高。而且环介导等温扩增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，对实验检测人员的要求也低，是一种安全、简单、快速、成本低的检测方法。结果判定方法简单，两种方式判断：扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；或通过向反应体系中加入SYBR Green I或钙黄绿素，通过肉眼观察出现颜色变化的样品为阳性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了的引物特异性强、灵敏度好、且具有很好的重复性，能够特异性的鉴定区分检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫，克服了现有技术中三种线虫难以区分的难题，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条，灵敏度很高。

本发明仅需使用简单的恒温仪器就能完成全部的检测，不需要依赖于任何昂贵的仪器，并且检测时间仅为60 min，比普通的PCR快了2～3 h，简单快速、对环境要求低、无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。

另外，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可以实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全，为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。

附图说明

图1为不同反应温度对扩增效率的影响。A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；M：Marker 2000；1，2，3和4分别代表反应温度为62℃，64℃，66℃和68℃；5表示在64℃的反应温度下使用灭菌水作为模板灭菌水对照。

图2为反应时间与LAMP产物的量的关系；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；图中100、80、40、10、1和0.1表示使用的DNA来自于100、80、40、10、1和0.1条线虫，CK表示使用灭菌水作为模板；Y轴为荧光强度，X轴为反应时间。

图3为LAMP检测三种短体线虫的电泳检测图；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫。图中1-4表示使用的DNA来自于100、10、1和0.1条线虫，5表示使用灭菌水作为模板，M为Marker 2000。

图4为LAMP检测三种短体线虫的可视化检测效果图；A图为玉米短体线虫；B图为拟玉米短体线虫；C图为最短尾短体线虫；图中1-4表示使用的DNA来自于100、10、1和0.1条线虫，图中5表示使用灭菌水作为模板。

图5为LAMP反应后加入SYBR Green I 染料检测三种短体线虫引物组的特异性；A图为玉米短体线虫引物组特异性的结果；B图为拟玉米短体线虫引物组特异性的结果；C图为最短尾短体线虫引物组特异性的结果；图中离心管上的编号为供试线虫的种群编号，各种群编号对应的线虫种类详见表1；具体为：A图第一行从左至右依次为SG209、ZC13、YNZT、GX1004、U19、A24、A39、HN297，A图第二行从左至右依次为A65、GX655、GSY24S、SD1275、GSY24L、JXP、Miti、NMG，A图第三行从左至右依次为TA、SW、CB、LX、MI、MJ、ddH₂O；B图第一行从左至右依次为A65、A6L、A90、GX1043、HN297、GX655、GSY24S、SD1275，B图第二行从左至右依次为GSY24L、JXP、Miti、NMG、TA、SW、CB、LX，B图第三行从左至右依次为MI、MJ、ddH₂O；C图第一行从左至右依次为GX655、HN336、HN340、HN297、A65、GSY24S、SD1275、GSY24L，C图第二行从左至右依次为JXP、Miti、NMG、TA、SW、CB、LX、MI，C图第三行从左至右依次为MJ、ddH₂O。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例中所述的“0.1条线虫的DNA模板”是指分别用1条玉米短体线虫、1条拟玉米短体线虫和1条最短尾短体线虫提取的DNA稀释10倍后的DNA模板，“10条线虫的DNA模板” 是指分别用100条玉米短体线虫、100条拟玉米短体线虫和100条最短尾短体线虫提取的DNA稀释10倍后的DNA模板。其中用单条线虫提取DNA的方法采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行。

实施例1 引物设计

1、根据NCBI中玉米短体线虫、拟玉米短体线虫、最短尾短体线虫和其他短体线虫的线粒体DNA COI序列设计引物，引物设计使用软件PRIMEREXPLORER v.4 software (http://primerexplorer.jp)进行。

（1）设计的玉米短体线虫引物组及其序列如下：

PZF3（如SEQ ID NO.1所示）：

5’-GGTTTAGATCTTGATTCTCGG-3’

PZB3（如SEQ ID NO.2所示）：

5’-GTAAAAATAAATCCAAAGTGGCA-3’

PZFIP（如SEQ ID NO.3所示）：

5’-ACCAGGTAAAAACCTTAATTCCGGggatccGCTTATTTTAGGGGGGCT-3’

PZBIP（如SEQ ID NO.4所示）：

5’-TATTCGTTTTGGTCCGGTTTTTTTaaaaaaCAAAATAACCCCAGAGCAAC-3’

（2）设计的拟玉米短体线虫引物组及其序列如下：

PPF3（如SEQ ID NO.5所示）：

5’-GGWTTTATTGGTTGTATGGTRTG-3’

PPB3（如SEQ ID NO.6所示）：

5’-GAGAAACCCCCCACAGTA-3’

PPFIP（如SEQ ID NO.7所示）：

5’-AGGCAATGGCTATTGTCGCCggatccGGGTTGGTCTAGATTTAGATTCC-3’

PPBIP（如SEQ ID NO.8所示）：

5’-CAGGGATTAAGGTTTTTACCTGGTTaaaaaaCCACAAAACCATTGTAGAGC-3’

（3）设计的最短尾短体线虫引物组及其序列如下：

PBF3（如SEQ ID NO.9所示）：

5’-GTGTACGTTTTAATCGCTCC-3’

PBB3（如SEQ ID NO.10所示）：

5’-ACTATAGTGGCCACCCTAA-3’

PBFIP（如SEQ ID NO.11所示）：

5’-GCGCCTCTTATACCTTTTAAGCTAggatccGTTTGAGTAGTCAAATTCTTTCAAG-3’

PBBIP（如SEQ ID NO.12所示）：

5’-AAGTGTTGGTTTTGTTGGTTGTTaaaaaaATAACCACGGGAGTCTTG-3’

实施例2引物反应条件优化

1、反应温度（引物退火温度）优化

分别使用玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的DNA作为模板，优化上述引物的退火温度。

（1）提取DNA

所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin et al. (2008) 所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加入16 μL 灭菌双蒸水，2 μL 10×PCR buffer (无Mg²⁺) (购于Takara)和 2 μL 蛋白酶 K (600 mAnson U/mL) (购于Takara)，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65℃中1 h和95℃中15 min。

（2）环介导等温PCR反应

环介导等温PCR反应体系为：1 μL DNA，2.5 μL10×引物，引物包括内引物和外引物： 内引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶缓冲液，4 μL甜菜碱（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O补足，共25 μL。

环介导等温PCR反应条件：设计玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的退火温度梯度分别为62℃、64℃、66℃、68℃；反应时间均为90 min。

（3）反应结束后，各组分别取10 μL 环介导等温PCR产物用2 %琼脂糖电泳分离，结果如附图1所示。A图、B图和C图分别表示玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫引物的不同退火温度对扩增效率的影响。结果均表明玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的特异引物组在温度为62~64℃时扩增出典型LAMP产物，其中，反应温度为64℃时，合成效率最高，条带最为清晰，因此选择64℃作为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫引物组的最佳退火温度。

2、反应时间优化

由于LAMP反应时间过长会增加假阳性机会，然而反应时间过短则会产生假阴性的结果，因此我们使用实时荧光定量PCR仪来优化反应的时间。

环介导等温PCR反应体系为：1 μL DNA，内引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶缓冲液，4 μL甜菜碱（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，另外再加入1.5 μL 20×EvaGreen荧光染料（购于广州美津生物）余量ddH₂O补足，共25 μL。

反应在64℃下进行，每2 min采集一次荧光信号。

结果如附图2所示，反应到达平台期的时间与靶标线虫的数量成负相关。结果表明在玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫数量较多时（100条）反应40 min荧光强度达到最大值，在线虫数量较少时（0.1条），反应60 min能达到最大值。

综上所述，三种短体线虫环介导等温扩增反应的反应条件为：64℃反应60 min。

实施例3 LAMP反应的可视化检测及灵敏性检测

1、综上所述，本发明建立的分别快速检测玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的环介导等温扩增方法如下：

环介导等温PCR反应体系为：1 μL DNA， 内引物PZFIP/ PZBIP或PPFIP/ PPBIP或PBFIP/ PBBIP各1.6 μM，外引物PZF3/ PZB3或PPF3/ PPB3或PBF3/ PBB3各0.2 μM，3.5 μL dNTPS（10 mM），2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶缓冲液，4 μL甜菜碱（5 M），1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O补足，共25 μL。

所述三种短体线虫环介导等温扩增反应的反应条件为：64℃反应60 min。

2、根据上述反应体系和优化后的反应条件进行LAMP反应，反应结束后，不仅能通过2 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，还能够通过反应结束后直接添加SYBR Green I染料或钙黄绿素进行可视化检测，结果判断方法更灵活、更简便。

3、分别以不同浓度的玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的DNA为模板，以上述反应体系和反应条件进行LAMP反应，反应结束后，使用2 %的琼脂糖凝胶电泳对上述产物进行检测，结果如附图3所示。

同时，在LAMP反应产物中加入1 μL 5000×SYBR Green I染料（购自鼎国生物，使用前加入灭菌水稀释至5000X的浓度）混匀后观察结果，阳性产物呈现出由橘红色变为荧光黄或荧光绿色的颜色变化（如附图4所示）（具体颜色的深浅由产物的含量决定），说明验证可视化结果的准确。

电泳检测与可视化的结果一致，也说明了本发明检测方法结果的稳定性和可靠性。

同时上述结果也说明了本发明所述的LAMP反应方法能分别检测到0.1条玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫的DNA模板，具有很高的灵敏性。

实施例4 LAMP反应的特异性

1、为验证本发明引物和LAMP反应体系的有效性和特异性，我们同时使用了多个不同种群的玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫和其他非靶标的线虫作为模板进行检测，具体线虫种类如表1所示。

表1 实验使用的线虫种群及对应的可视化检测结果

注：^a. 用外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP组进行环介导等温PCR后，产物加SYBR Green I可视化结果。

^b. 用外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP组进行环介导等温PCR后，产物加SYBR Green I可视化结果。

^c. 用外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP组进行环介导等温PCR后，产物加SYBR Green I可视化结果。

2、环介导等温PCR反应体系和条件与实施例3相同。DNA模板分别提取自表1中各种群的单条线虫。

3、结果如附图5所示，三组引物的检测结果显示，各自分别只有其靶标线虫（玉米短体线虫、拟玉米短体线虫或最短尾短体线虫）颜色发生变化，即出现了橘红色变为浅绿色。说明本发明的三组引物及其LAMP反应方法能有效的检测不同种群的靶标线虫（玉米短体线虫、拟玉米短体线虫或最短尾短体线虫）。并且对非靶标线虫不会有特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。

同时也说明了本发明所述的LAMP反应方法能有效的检测到单条的靶标线虫，不仅特异性非常好，还具有很高的检测灵敏性，能够满足实际检测、鉴定工作的需要。

实施例5 试剂盒组装

1、一种鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温检测试剂盒，包含三组引物，外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP，外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP，外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～12所示；所述三种短体线虫为玉米短体线虫、拟玉米短体线虫和最短尾短体线虫。

还包含环介导等温扩增反应所需要的DNA聚合酶、甜菜碱、MgSO₄、缓冲液和/或dNTPS。

2、上述试剂盒的使用方法为：同时以待测样品DNA为模板，分别利用所述的三组引物进行环介导等温扩增反应，根据扩增反应的结果判断样品中所含线虫的种类。

其中，所述环介导等温扩增反应的反应体系为：每25 μL体系中加入1 μL DNA，0.2 μM外引物对，1.6 μM内引物对，3.5 μL dNTPS， 2.5 μL 10×BST 2.0 DNA聚合酶缓冲液，4 μL甜菜碱，1.5 μL MgSO₄，1 μL BST 2.0 DNA聚合酶，余量ddH₂O补足25 μL。

所述三种短体线虫环介导等温扩增反应的反应条件为：64℃反应60 min。

另外，所述根据扩增反应的结果判断样品中所含线虫的种类的方法和标准是：

将扩增产物分别进行凝胶电泳，如果外引物对PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有玉米短体线虫；如果外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有拟玉米短体线虫；如果外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP组出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有最短尾短体线虫；

或者分别向扩增产物中加入SYBR Green I，如果外引物PZF3/ PZB3和内引物对PZFIP/ PZBIP组的扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有玉米短体线虫；如果外引物对PPF3/ PPB3和内引物对PPFIP/ PPBIP组的扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有拟玉米短体线虫；如果外引物对PBF3/ PBB3和内引物对PBFIP/ PBBIP组的扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有最短尾短体线虫。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一套鉴定甘蔗上三种短体线虫的环介导等温扩增引物及其试剂盒

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物PZF3

<400> 1

ggtttagatc ttgattctcg g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物PZB3

<400> 2

gtaaaaataa atccaaagtg gca 23

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物PZFIP

<400> 3

accaggtaaa aaccttaatt ccggggatcc gcttatttta ggggggct 48

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 引物PZBIP

<400> 4

tattcgtttt ggtccggttt ttttaaaaaa caaaataacc ccagagcaac 50

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物PPF3

<400> 5

ggwtttattg gttgtatggt rtg 23

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物PPB3

<400> 6

gagaaacccc ccacagta 18

<210> 7

<211> 49

<212> DNA

<213> 引物PPFIP

<400> 7

aggcaatggc tattgtcgcc ggatccgggt tggtctagat ttagattcc 49

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 引物PPBIP

<400> 8

cagggattaa ggtttttacc tggttaaaaa accacaaaac cattgtagag c 51

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物PBF3

<400> 9

gtgtacgttt taatcgctcc 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物PBB3

<400> 10

actatagtgg ccaccctaa 19

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> 引物PBFIP

<400> 11

gcgcctctta taccttttaa gctaggatcc gtttgagtag tcaaattctt tcaag 55

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 引物PBBIP

<400> 12

aagtgttggt tttgttggtt gttaaaaaaa taaccacggg agtcttg 47