本发明涉及中药及中药材、中药提取物鉴定技术领域，特别是一种能够特异性鉴定金钱白花的pcr方法及其特异引物。主要用于蕲蛇药材、蕲蛇提取物、极限条件提取物，含有蕲蛇的制剂以及极限条件处理的蕲蛇制剂快速鉴定。
背景技术：
蕲蛇为中国药典(2015年版)一部收载的一种常用中药，来源于蟒科动物五步蛇agkistrodonacutusguenther的干燥体。有祛风，通络，止痉之功效。用于风湿顽痹，麻木拘挛，半身不遂，抽搐痉挛，破伤风，麻风，疥癣。
蕲蛇作为贵重动物药材的临床功效确切，但商品来源复杂、药材形态鉴别困难，市场上流通的蕲蛇药材中，多以中介蝮蛇、山烙铁头、蟒蛇等经过加工后混作正品蕲蛇销售。这些品种与蕲蛇同科不同属，因其来源相近，造成鉴定困难。此外，药材在加工处理时剖去内脏后，要进行干燥处理，皮上的花纹特征、颜色变得模糊，使得辨别困难，如百花锦蛇、玉斑锦蛇、滑鼠蛇、眼镜蛇等其大小、形态特征与蕲蛇有相似之处，这也是造成鉴定困难的另一重要原因。国内虽已有pcr方法鉴定蕲蛇药材的报道，但鉴定极限条件处理后的药物制剂中蕲蛇的pcr方法至今未见报道。由于在制剂的生产过程中，存在粉碎、混合等环节，水煎煮提取、醇煎煮提取等工艺环节，甚至是高温高压等条件处理，这些条件要么使蕲蛇粉末变为混合物，要么使蕲蛇因提取过程而被破坏掉大量有机成分，使得制剂中蕲蛇的鉴定变得困难。而有的制剂使用多种蛇类药材，或者使用多种蛇类和非蛇类动物药材，使得其它几味蛇类药材或非蛇类动物药材也存在干扰鉴定的可能，因而使制剂中蕲蛇的鉴定变得十分困难。
技术实现要素：
本发明提供了一种用于鉴定蕲蛇药材、蕲蛇提取物、极限提取物以及含蕲蛇制剂、极限条件处理后的制剂的引物及鉴定方法，该pcr鉴定方法操作简单，能快速准确的鉴定蕲蛇粉末、提取物、极限提取物、混合制剂、甚至极限条件下处理的制剂。
一对鉴定蕲蛇的特异引物：上游引物、下游引物，其序列为：
上游引物：5’-tccaaatcataaccggcttcttcttg-3’
下游引物：5’-aattaaaagggtggtgcctgatagtcaa-3’
一种蕲蛇的pcr鉴定方法，包括以下步骤：分为以下四个步骤：
1、制备样品：制备蕲蛇粉末、采用加热冷凝回流装置制备蕲蛇水提物、醇提物和高压制备极限条件提取物，混合得到几种同类药材粉末并采用加热冷凝装置制备混合水提物、醇提物，高压条件下制备极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物。
2、样品dna提取：从以上样品中提取dna。
3、pcr反应：采用pcr方法得到pcr产物，95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃45s)，72℃5min，得到扩增产物。
4、以电泳鉴定扩增产物大小，以此鉴定蕲蛇真伪，通过实验验证方法的稳定性。方法：1.5％凝胶、130v电泳25min，在230bp处有单一条带，则确定所检材料为蕲蛇。
附图说明
图1为蕲蛇粉末和其他蛇类药材粉末的pcr鉴定结果，结果如图1所示，蕲蛇在230bp处有均一条带，而其他易混淆品没有条带说明该方法可区分蕲蛇粉末与易混淆品。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1～3为蕲蛇粉末，4为乌梢蛇粉末，5为金钱白花蛇粉末，6为水。
图2为蕲蛇水提物和醇提物的pcr鉴定结果。蕲蛇水提物、醇提物提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定蕲蛇的提取物。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为蕲蛇粉末，2为蕲蛇水提物，3为蕲蛇醇提物，4为乌梢蛇水提物，5为乌梢蛇醇提物，6金钱白花蛇水提物，7为金钱白花蛇醇提物。
图3为极限(高温、高压、长时间)条件下蕲蛇水提物和醇提物的pcr鉴定结果。金钱白花蛇极限提取物均在230bp处有均一条带，说明该方法可鉴定金钱白花蛇的提取物。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为蕲蛇极限条件粉末，2为蕲蛇极限条件水提物，3为蕲蛇极限条件醇提物，4为乌梢蛇极限条件水提物，5为乌梢蛇极限条件醇提提物，6为金钱白花蛇极限条件水提物，7为金钱白花蛇极限条件醇提物。
图4为几种同类药材混合粉末、混合水提物、混合醇提物、极限条件下混合粉末、混合水提物、混合醇提物鉴定结果。含有金钱白花蛇的制剂有条带，说明可以区分蕲蛇的真伪。m为marker，从上到下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp，1为多种同类药材混合粉末，2为混合水提物，3为混合醇提物，4为极限条件处理混合粉末，5为极限条件混合水提物，6为极限条件混合醇提物，7为乌梢蛇和金钱白花蛇混合粉末，8为乌梢蛇和金钱白花蛇混合水提物，9为乌梢蛇和金钱白花蛇混合醇提物，10为极限条件下乌梢蛇和金钱白花蛇混合粉末，11为极限条件乌梢蛇和金钱白花蛇混合水提物，12为极限条件乌梢蛇和金钱白花蛇混合醇提物。
具体实施方法：
1材料
金钱白花蛇粉末、乌梢蛇粉末、蕲蛇粉末均由通化金马公司提供
2特异引物
上游引物：5’-tccaaatcataaccggcttcttcttg-3’
下游引物：5’-aattaaaagggtggtgcctgatagtcaa-3’
3样品dna提取
本发明采用的dna提取方法为：取蕲蛇样品约0.1g至1.5ml离心管中，加入275μl消化液(细胞核裂解液200μl，0.5mol/ledta50μl，蛋白酶k(20mg/ml)20μl，rna酶溶液5μl)，55℃温育1h，加入250μlwizardsvlysisbuffer混匀，加到离心管柱中，10000r/min离心2分钟；弃掉过滤液，加入800μl洗脱液(醋酸钾162.8mmol/l，tris-hcl(ph7.5)22.6mmol/l，edta(ph8.0)0.019mmol/l，60％乙醇)，10000r/min离心1min；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min离心1分钟；弃掉最后一次过滤液后再离心2min，将过滤柱转移入新的离心管中，加入100μlddh2o，室温放置2min后，10000r/min离心2min，滤液-20℃保存备用。
4pcr反应
表1pcr反应体系(25μl)
反应条件：95℃5min，30个循环(95℃30s，64℃45s)，72℃5min。
5电泳检测
配制含gelred的1.5％琼脂糖凝胶，130v电泳25min，在凝胶在紫外透射仪上观察，产物应在230bp处有单一条带。