本发明属于生物医药领域，涉及食管鳞癌标志基因IBSP的检测及应用。
背景技术：
：食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是食管癌的高发国家，尤以食管鳞癌最为常见，每年因食管癌死亡的人数约占全部恶性肿瘤死亡总数近1/4。由于早期食管癌发生并无明显体征，患者在就诊时大多已处于中晚期，相当部分的病人已不能进行手术治疗，总的5年生存率仅为10％-20％。2014年发表在亚洲癌症预防杂志上的一篇研究分析了我国1991年至2012年间食管癌的死亡分布规律，并预测了在未来五年内我国食管癌的发生率和标化死亡率仍将不断增加。因此，探索食管鳞癌发生发展的分子基础，寻找相关的肿瘤标志物，对十食管鳞癌的早期诊断及治疗具有十分重要的意义。食管癌的发生是一个多阶段的进行性发展过程，不仅受到环境因素的影响，更是涉及到多个基因、多个通路的交互作用。食管癌的形成是由正常的食管粘膜上皮细胞发生不同程度的非典型增生，之后逐渐发展成原位癌、早期浸润癌，最终发生癌变，在这期间的每一步进展都涉及到相关基因的表达或功能改变。尽管研究者们已经发现了诸如p53，p21，cyclinD1，β-catenin和CmyC等一系列与食管癌相关的癌基因或抑癌基因，但对于是否有一些特定分子参与食管癌发生发展，并最终可以用于临床靶向治疗方面仍然有待阐明。近年来，随着对肿瘤发生发展的分子机制研究的不断深入，这为探究食管癌发病过程中的分子事件，为寻找相关肿瘤标记物提供了新的靶点。食管鳞癌尚未发现具有一定准确性的标记物。最敏感的免疫标记物鳞状细胞癌相关抗原(SCC-RA)在良性食管瘤中常为阴性，而在食管癌病人血清阳性率为40％～52％，并随病变之进一步侵袭、淋巴结转移、病期变晚，以及肿瘤体积加大而增高，可惜在早期癌中很少出现阳性，且不论何期之低分化癌中也是阴性。另一免疫指标为表皮样生长因子(EGF)受体，用碘125EGF结合测试发现高结合率者淋巴结转移多，预后差。其他肿瘤标记物如癌胚抗原(CEA)、CA-50、CA19-9等经过研究，无一能提供可靠的预后指标。因此，寻找食管鳞癌诊断的分子标志物，对于更有效的预防和治疗食管鳞癌都具有重要的临床意义。技术实现要素：为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食管鳞癌的分子标志物，该分子标志物应用于临床，可以实现食管鳞癌的早发现早治疗。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测IBSP表达的的试剂在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用。进一步，所述的IBSP在食管鳞癌患者中表达下调。进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测IBSP基因及其表达产物的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。其中，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增IBSP基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增IBSP基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与IBSP蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与IBSP基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与IBSP蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与IBSP基因的核酸序列杂交的探针。进一步，所述用实时定量PCR诊断管鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增IBSP基因的引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。本发明提供了一种诊断食管鳞癌的产品，所述产品能够通过检测样本中IBSP基因的表达水平来诊断食管鳞癌。其中，所述“样本”是指从目标患者得到的组合物，其包含细胞和/或其他分子体—将进行特征化和/或识别，例如，根据物理、生化、化学和/或生理特征。例如，短语“临床样本”或“疾病样本”及其变体，是指从目标患者获得的任何样本，将预期或已知所述样本中能够获得细胞和/或分子体，例如将被特征化的生物标志物。进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测IBSP基因转录水平的针对IBSP基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的IBSP蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测IBSP基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括IBSP蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括针对IBSP基因的引物和/或探针。本发明所述的基因芯片或基因检测试剂盒可用于检测包括IBSP基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白芯片或蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括IBSP蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。本发明提供了IBSP基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。进一步，所述药物组合物包括IBSP基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制IBSP基因表达的物质、抑制IBSP基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制IBSP基因表达产物活性的物质。进一步，所述抑制剂是针对IBSP基因的siRNA、针对IBSP蛋白的抗体。在本发明的具体实施方式中，所述抑制剂针对IBSP基因的siRNA。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBIBLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。优选的，所述siRNA的序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示。本发明还提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包含IBSP基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制IBSP基因表达的物质、抑制IBSP基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制IBSP基因表达产物活性的物质。进一步，上述的药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。本发明的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。本发明所述药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下，药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织，本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话，可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时，可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如，通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋，也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于补充内源性的IBSP蛋白的缺失或不足，通过提高IBSP蛋白的表达或增强IBSP蛋白的功能，从而治疗因IBSP蛋白减少导致的食管鳞癌。本发明的药物还可与其他治疗食管鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。本发明所述的药物组合物也可以脂质体输送系统形式给药，如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡。脂质体可有多种磷脂形成，如胆甾醇、硬脂基胺或磷脂酰胆碱。本发明药物组合物可以局部给药的药物组合物，可以配制成软膏、乳膏剂、混悬剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在本发明中，“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamidenucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，lockednucleicacid，BridgedNucleicAcid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridgednucleicacids)、GNA(Glycerolnucleicacid，甘油核酸)、TNA(Threosenucleicacid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。本发明中所述IBSP蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段、组合抗体等，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明中“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体相同和/或结合相同表位，除了生产单克隆抗体的过程中可能产生的可能变体外，此类变体一般以极小量存在。此类单克隆抗体典型的包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。克隆抗体在本发明中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。“完整抗体”在本发明中指包含两个抗原结合区及Fc区的抗体。优选的是，完整抗体具有功能性Fc区。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例，标志物基因可具有SEQIDNO.1或SEQIDNO.2指定的编码序列或氨基酸序列。在一些实施方案中，其具有与所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列，诸如上述所列的序列至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％相同或相似的cDNA序列或氨基酸序列。在本发明的上下文中，IBSP基因表达产物包括人IBSP蛋白以及IBSP蛋白的部分肽。所述IBSP蛋白的部分肽含有与食管鳞癌病相关的功能域。“IBSP蛋白”包括IBSP蛋白以及IBSP蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括IBSP蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、在高或低的严紧条件下能与人IBSP的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是IBSP蛋白的融合蛋白。对于与IBSP蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留IBSP蛋白的生物学活性即可。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。在本发明中，术语“治疗”是指包括但不限于治愈，减缓(减少)靶定的病理状况或病症或防止复发。包括但不限于，(1)抑制作用，在一定程度上抑制疾病进展，其包括减缓以及完全抑制；(2)减少疾病发作和/或症状的数量；(3)减少病灶尺寸；(4)抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病细胞渗透到相邻的周边器官和/或组织；(5)抑制(即减少、减缓或完全阻止)疾病传播；(6)在一定程度上缓解与疾病相关联的一种或多种症状；(7)治疗后增加无病表现的时间长度；(8)在治疗后的给定时间点减少死亡率；和/或(9)治疗后无副作用。本发明的优点和有益效果：本发明首次发现了IBSP基因的差异表达与食管鳞癌的发生发展相关，IBSP在食管鳞癌患者中高表达，该基因可以促进癌细胞的增殖以及抑制癌细胞的凋亡。本发明提供了一种治疗食管鳞癌的精准分子手段，通过靶向于分子标志物来敏感和特异的治疗疾病。附图说明图1显示利用QPCR检测IBSP基因在食管鳞癌组织中的表达情况；图2显示利用QPCR检测IBSP基因在食管细胞中的表达情况；图3显示利用QPCR检测siRNA对IBSP基因表达的影响；图4显示软琼脂克隆形成实验检测IBSP表达对细胞增殖的影响；图5显示利用transwell小室检测IBSP基因对食管鳞癌细胞侵袭的影响。具体的实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物1、样品收集各收集6例周围正常食管粘膜组织和食管鳞癌组织，患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：1)加入Trizol，室温放置5min；2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/mlTrizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。3、逆转录和标记用LowRNAInputLinearAmplificationKit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。4、杂交基因芯片采用Aglient公司的人全基因组表达谱芯片,每张芯片包括45015个寡核苷酸，其中有43376个人基因探针和1639个实验控制探针。按芯片使用说明书的步骤进行，温度在65℃，经17h10r/min滚动杂交，37℃洗片。5、数据处理杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm，扫描仪自动以100％和10％PMT各扫描1次，2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用FeatureExtraction进行处理分析，得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准：ratio≥4为上调基因，ratio≤0.25为下调基因。6、结果与正常食管粘膜组织相比，IBSP基因在食管鳞癌组织中的表达量显著上调。实施例2QPCR测序验证IBSP基因的差异表达1、对IBSP基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常食管组织和食管鳞癌组织各50例。2、RNA提取步骤如实施例1所述。3、逆转录：1)反应体系：试剂体积MgCl22μl10×RTBuffer1μl无Rnase水3.75μldNTP混合液1μlRnase抑制剂0.25μlAMV反转录酶0.5μl寡聚dT适配子引物0.5μl实验样品1μl2)逆转录反应条件按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。3)聚合酶链反应1)引物设计根据Genebank中IBSP基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：IBSP基因：正向引物为5’-CGAGCCTATGAAGATGAG-3’(SEQIDNO.3)；反向引物为5’-GTGGTGGTAGTAATTCTGA-3’(SEQIDNO.4)。管家基因GAPDH的引物序列为：正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.5)反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)2)按照表1配制PCR反应体系：表1PCR反应体系试剂体积正向引物1μl反向引物1μlTakaraExTaqHS12.5μl模板2μl去离子水补足25μl3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。5、统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。6、结果结果如图1所示，与周围正常食管粘膜组织相比，IBSP基因在食管鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。实施例3IBSP基因在食管癌细胞系中的差异表达1、细胞培养人食管鳞癌细胞株KYSE150、KYSE450购自中科院肿瘤研究所，正常食管上皮细胞株Het-1a购自于广州吉尼欧公司。以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。2、细胞总RNA的提取1)胰酶消化贴壁细胞，吹打获得的细胞经离心、重悬、清洗后，以1640培养基(10％小牛血清)重悬；2)将重悬的细胞转移至6孔板(/孔)，添加培养基至2m1/孔，轻摇6孔板使细胞均匀重悬；3)细胞贴壁生长48h，去培养基；4)以1mlTrizol试剂裂解细胞，反复吹打6孔板壁，尽量使细胞完全裂解；5)转移细胞裂解液至1.5mlDEPC处理过的EP管中，置于冰上。加入0.2m1氯仿，剩余操作步骤同组织中RNA提取过程。3、逆转录具体步骤同实施例2.4、统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。5、结果结果如图2所示，与食管上皮细胞相比，IBSP基因在食管鳞癌细胞KYSE150、KYSE450中表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。实施例4IBSP基因的沉默1、细胞培养人食管鳞癌细胞株KYSE150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。2、siRNA设计针对IBSP基因的siRNA序列：阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQIDNO.7)，反义链为5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQIDNO.8)；siRNA1-IBSP：正义链为5’-UUGUAAAGAUAAUAUCGUGGC-3’(SEQIDNO.9)，反义链为5’-CACGAUAUUAUCUUUACAAGC-3’(SEQIDNO.10)；siRNA2-IBSP：正义链为5’-UUUCUUCGUUUUCAUUUCCUU-3’(SEQIDNO.11)，反义链为5’-GGAAAUGAAAACGAAGAAAGC-3’(SEQIDNO.12)；将细胞按5×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(KYSE150)阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-IBSP、siRNA2-IBSP、)，其中阴性对照组siRNA与IBSP基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。3、QPCR检测IBSP基因的转录水平3.1细胞总RNA的提取具体步骤同实施例3。3.2逆转录步骤同实施例2。3.3QPCR扩增步骤同实施例2。4、统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，干扰IBSP基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。5、结果结果如图3显示，相比KYSE150、转染空载siRNA-NC、siRNA2-IBSP组，siRNA1-IBSP组能够显著降低IBSP基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。实施例5IBSP基因对食管鳞癌细胞凋亡的影响使用流式细胞仪检测IBSP基因对细胞凋亡的影响。1、细胞培养步骤同实施例3。2、细胞转染步骤同实施例3。3、步骤细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。3、统计学方法实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。4、结果：转染siRNA1-IBSP组的细胞凋亡率为(14.67±0.012)％，转染siRNA-NC空载体组的细胞凋亡率为(5.32±0.013)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，IBSP基因的过表达抑制食管鳞癌细胞的凋亡。实施例6软琼脂克隆形成实验1、用0.25％胰蛋白酶消化转染后处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×103个/ml。3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO2温箱中备用。5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×103个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。8、结果结果如图4所示，与其他组相比，siRNA1-IBSP组单细胞克隆集落形成数显著降低。实施例7Transwell细胞体外侵袭实验1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的无血清培养液Matrigel浸泡30min。2、用胰酶消化处于对数生长期的稳定感染后各组细胞，PBS清洗细胞3次，用含有10％血清的培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×105/ml。3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入细胞悬液200μl。4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培养液。5、37℃，5％CO2温箱内培养24h。6、除去上室和下室中的培养液，用棉签刮除上室中的Matrigel和存留的细胞，用PBS清洗2次。7、用1％结晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。8、随机选取4个100倍视野，在显微镜下分别计数侵袭细胞数，每种不同类型的细胞设3个复孔，共重复3次。9、数据处理用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。10、结果结果如图5所示，KYSE150、siRNA1-IBSP、siRNA-NC组细胞在transwell小室中培养24h后，siRNA1-IBSP组聚碳酸酯膜下室面的细胞数显著降低。上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。当前第1页1 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