技术简介：
本发明发现困难梭状杆菌感染可导致体重下降及肠道结构异常，创新性提出通过发酵乳酸杆菌GMNL-296促进IL-10分泌及调节型T细胞相关因子（如FoxP3、GATA3）表达，实现免疫调节治疗。该方案不直接抑制病原体生长，而是通过增强肠道免疫应答改善感染症状，为肠道感染治疗提供新思路。
关键词：乳酸杆菌治疗肠道感染,GMNL-296改善症状,调节T细胞抗炎
本发明是有关于一种改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌gmnl-296组合物与用途，特别是关于一种可治疗或预防困难梭状杆菌感染症状的抗发炎的发酵乳酸杆菌gmnl-296组合物与用途。
背景技术：
：困难梭状杆菌(clostridiumdifficile)，为造成住院病人因使用抗生素而导致腹泻的主要病原菌，症状从轻微腹泻到严重肠道发炎如伪膜性肠炎(pseudomembranousenteritis)、毒性巨肠症(toxicmegacolon)，菌血症，严重甚至可能造成死亡。困难梭状杆菌可通过孢子的型式散播，过去的研究发现困难梭状杆菌感染(c.difficileinfection；cdi)感染率有逐渐上升的趋势(pxzheng,genomeannounc.2013.1:e00149-12.)。根据美国疾病管制局的统计，每年有十万名美国病患死于院内感染，其造成的死亡率正在攀升中(mfshih.,int.j.immunopathol.pharmacol.2012.25:39-48.2)。目前临床上治疗困难梭状杆菌的方式，若因抗生素引起cdi的症状，则建议先停止目前使用的抗生素，再依照其疾病严重程度使用甲硝唑(metronidazole)及万古霉素(vancomycin)。然而，此两种药物在某些病人的治疗上是无效的，或者复发率较高(yclin,2011.antimicrob.agentschemother.55:1701-5.)。目前治疗的困境除了因为困难梭状杆菌产生的抗药性外，就是病人本身难以形成适当的保护性免疫反应，因此可能造成重复性感染问题。由于困难梭状杆菌在医疗照护机构的感染率逐渐升高，于治疗上又有复发的可能性。因此寻找非抗生素治疗及改善困难梭状杆菌感染已成为一个亟需重视的问题。虽然过去研究发现，某些特殊乳酸菌菌种对于困难梭状杆菌有很强的抑菌能力，藉此能改善小鼠感染困难梭状杆菌后的症状；但过去并没有任何报导指出乳酸菌能通过免疫调节的方式，用来改善困难梭状杆菌感染造成的肠炎症状。故，有必要提供一种抗发炎的发酵乳酸杆菌菌株及其组合物与使用发酵乳酸杆菌gmnl-296制造改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌组合物的用途，以解决习用技术中所存在的问题。技术实现要素：本发明的主要目的在于提供一种改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌gmnl-296组合物与用途，可通过发酵乳酸杆菌(lactobacillusfermentum)gmnl-296来刺激免疫反应，以改善困难梭状杆菌造成的体重减轻及肠道不良反应。所述发酵乳酸杆菌可通过食道进入消化系统内，刺激抑制发炎的细胞激素介白质-10(interleukin-10，il-10)的分泌及增强调节型t细胞功能，可抑制及降低肠道发炎现象。为达成本发明的前述目的，本发明的一实施例提供一种发酵乳酸杆菌组合物，用于改善困难梭状杆菌感染症状，其包含发酵乳酸杆菌(lactobacillusfermentum)gmnl-296，所述发酵乳酸杆菌gmnl-296以保藏编号m2016225保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。在本发明的一实施例中，所述发酵乳酸杆菌gmnl-296为活菌菌株。在本发明的一实施例中，所述发酵乳酸杆菌组合物是一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合。为达成本发明的前述目的，本发明的另一实施例提供一种使用发酵乳酸杆菌gmnl-296制造改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌组合物的用途。在本发明的一实施例中，发酵乳酸杆菌组合物具有促进抗发炎细胞激素il-10分泌以及foxp3及gata3增加的能力。在本发明的一实施例中，所述发酵乳酸杆菌gmnl-296为活菌菌株。在本发明的一实施例中，所述困难梭状杆菌感染症状是体重减轻或肠道异常。在本发明的一实施例中，所述肠道异常为结肠到盲肠段长度变短。附图说明图1：本发明实验1的抑菌圈试验后，各菌株对于困难梭状杆菌的抑制结果比较图。图2：本发明的发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296在实验2的抗发炎测试中，不同剂量对no含量影响。图3a至3b：实验3中喂食发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296或磷酸盐生理食盐水(pbs)对已感染困难梭状杆菌后的小鼠的影响。图4：实验3中喂食发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296或磷酸盐生理食盐水(pbs)对肠道组织的调节型t细胞(treg)重要转录因子foxp3、gata3以及可抑制发炎的细胞激素il-10的mrna的表现量。具体实施方式为了让本发明的上述及其他目的、特征、优点能更明显易懂，下文将特举本发明较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。此外，本发明所提到的单数形式“一”、“一个”和“所述”包括数个引用，除非上下文另有明确规定。数值范围(如10％至11％的a)若无特定说明皆包含上、下限值(即10％≦a≦11％)；数值范围若未界定下限值(如低于0.2％的b，或0.2％以下的b)，则皆指其下限值可能为0(即0％≦b≦0.2％)。上述用语是用以说明及理解本发明，而非用以限制本发明。本发明的一实施例提供一种改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌菌株，其中所述发酵乳酸杆菌菌株是指发酵乳酸杆菌(lactobacillusfermentum)gmnl-296，且以保藏编号m2016225保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)。本发明的一实施例提供一种发酵乳酸杆菌组合物，其包含如上所述的改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌菌株。优选的，所述发酵乳酸杆菌组合物也可以一医药组合物、一营养补充品、一保健食品、一医疗食品或其组合的方式呈现。所述组合物可以根据有效性或方便性来考量设计成不同的形态。此外，所述组合物是以食用方式进入消化系统，可刺激免疫反应来抑制肠道发炎。本发明的一实施例提供了一种使用发酵乳酸杆菌gmnl-296制造改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌组合物的用途，其包含下列步骤：使用如上述的发酵乳酸杆菌gmnl-296活菌菌株，以促进调节型t细胞(treg)相关转录因子foxp3及gata3，以及可抑制发炎的细胞激素il-10的mrna的表现量，从而改善困难梭状杆菌感染症状是体重减轻或肠道异常，其中所述肠道异常指一般为直肠、结肠至盲肠段发炎，而且外观长度变短或变粗。上述实施例中的所述发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296主要是从人体肠道筛选分离获得的多个分离株的其中一株。利用表1的引子(seqidno:1及seqidno:2)进行pcr以复制多个分离株各自的16srdna片段，接着将其加以定序，定序完成后得到其中一株的16srdna基因序列如下(seqidno:3)；随后，如下表2所示，由ncbi网站比对后的结果可知，所述分离株的16srdna序列与发酵乳酸杆菌菌株(lactobacillusfermentum)的16srdna序列相似，相似度均为99％以上，故可知此菌株gmnl-296确实为发酵乳酸杆菌属。表1、引子序列对照引子序列编号序列pafseqidno:1agagtttgatcctggctcag536rseqidno:2gtattaccgcggctgctg表2、菌株序列比对表所述发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296的完整16srdna序列(seqidno:3)如下：gggatacatgcaagtcgaacgcgttggcccaattgattgatggtgcttgcacctgattgattttggtcgccaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgcccagaagcgggggacaacatttggaaacagatgctaataccgcataacaacgttgttcgcatgaacaacgcttaaaagatggcttctcgctatcacttctggatggacctgcggtgcattagcttgttggtggggtaacggcctaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacacgtatgagagtaactgttcatacgttgacggtatttaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgggg对所述发酵乳酸杆菌菌株gmnl-296进行酦酵试验，可获得如表3的结果。表3、酦酵试验结果为了验证本发明所提供的所述发酵乳酸杆菌gmnl-296具有抗发炎的特性，并能达到改善困难梭状杆菌感染症状，进行了以下实验1至3。实验1：病原菌处理：将困难梭状杆菌病原菌(clostridiumvpi10463)画盘后隔夜培养，将其刮下并悬浮于0.5mlbhisbroth中取病原菌液测浓度(调整为1x1010cfu/ml)，取100μl涂病原菌盘培养。乳酸菌处理：将1x108cfu/ml的发酵乳酸杆菌(lactobacillifermentum)gmnl-296及下表4中所示其他乳酸菌种(对照组)培养至隔夜，并分别收集活菌上清液，并利用0.22μm过滤膜过滤(#1)，并将mrs肉汤以hcl滴定至与原上清液相同ph值做为控制组(#2)。取100μl各组不同乳酸菌种的待测物加至病原菌盘上打好的孔洞内，并放至厌氧培养箱培养隔夜，以游标卡尺测量抑菌圈内径与外径。表4、抑菌圈测试组别组别菌种名(英文)菌种名(中文)菌株号1l.rhamnosus鼠李糖乳杆菌#1、#22l.fermentumgmnl-296发酵乳酸杆菌#1、#23l.plantarum胚芽乳酸菌#1、#24l.paracasei副干酪乳杆菌#1、#25l.salivarius唾液乳杆菌#1、#26l.bulgaricus保加利亚乳杆菌#17l.brevis短乳杆菌#1、#28l.pentosus戊糖乳杆菌#1、#29l.reuteri罗伊氏乳杆菌#1实验结果请见图1，可看出菌种2的#1即l.fermentumgmnl-296的活菌菌液并无明显抑制clostridiumvpi10463生长的情形，控制组(mrs,ph＝4.0)的实验结果也未出现抑菌圈。因此可知，发酵乳酸杆菌(lactobacillusfermentum)gmnl-296并无直接抑制困难梭状杆菌生长的能力。实验2：菌液培养:自冻管接种发酵乳酸杆菌gmnl-296到1ml的mrs肉汤，并于37℃有氧下静置培养20小时。次日，取15μl隔夜培养菌液至1.5ml的mrs肉汤(1％二次活化)，37℃有氧下静置培养20小时。细胞培养：将巨噬细胞株(raw264.7)的细胞数调整为8x105cells/ml，在24孔盘中加入0.5ml细胞液(最终细胞数为4x105cells/well)，并于37℃静置隔夜后，先以磷酸盐生理食盐水(以下简称pbs)清洗1次后，将细胞培养基更换成0.4ml/well不含血清的培养基(dmem)进行饥饿(starvation)2小时。菌液与细胞共培养：取出前一晚培养的菌液进行离心(13,000rpm、1分钟)，并进行两次pbs洗菌，再次移除上清液后，取20μl的pbs悬浮菌块混合980μl的pbs(稀释50倍)，测量od600，回推调整菌液浓度为1x1010cfu/ml；将调整好的菌液取0.2ml再混合0.8mldmem(无血清)，使最终菌数成为2x109cfu/ml，并预先将此最终浓度依序调整菌量成为2x109、1x109、5x108、1x108、5x107cfu/ml备用。待细胞进行饥饿2小时后，再加入100μl已制好的不同稀释倍数的菌液，处理细胞2小时。菌液与细胞共培养2小时后，继续在每个孔洞中加入0.5ml含200ng/ml的lps的dmem；控制组(mock)则加入0.5mldmem，再共同培养20小时后，收集细胞上清液，并测定no含量。将no试剂(80μlgriessreagenta+80μlgriessreagentb)混合80μl细胞上清液，于室温下作用5分钟后，利用elisareader测定od550nm的吸光值。结果如图2所示，可发现lps能有效的促进raw264.7细胞的发炎物质一氧化氮(no)的产生。此外，在不同剂量gmnl-296预先处理后，随着gmnl-296剂量的提升，no含量也逐渐降低，特别是从剂量5x107cfu/ml到2x108cfu/ml，相较于不加gmnl-296而单纯只加lps的组别有非常显著的下降，显示发酵乳酸杆菌gmnl-296在特定剂量区间可抑制发炎反应，是具有抗发炎能力的菌株。因此，发酵乳酸杆菌gmnl-296可以有效抑制lps刺激raw264.7细胞所产生的发炎现象。实验3：实验材料：7-8周龄小鼠(c57bl/6)及发酵乳酸杆菌gmnl-296活菌菌粉。实验方法：7-8周龄小鼠(c57bl/6)每日管喂gmnl-296菌液(4*108cfu/kg)，持续管喂10日，在第5日进行疾病动物模式造症，给予饮用抗生素水卡那霉素(kanamycin)0.4mg/ml、庆大霉素(gentamycin)0.057mg/ml、多粘菌素(colistin)0.057mg/ml、甲硝唑(metronidazole)0.215mg/ml、万古霉素(vancomycin)0.045mg/ml，持续五天，并在饮用抗生素水的第4天开始每12小时管喂一次质子帮浦抑制剂(ppi)、埃索美拉唑(esomeprazole，nexium)40mg/kg/天。另外，以同样模式将gmnl-296菌液替换为pbs进行管喂及造症作为对照组。第5天抗生素水去除甲硝唑及万古霉素。感染当日以腹腔注射克林霉素(clindamycin)4mg/kg，并喂食每只小鼠困难梭状杆菌(clostridiumvpi10463)菌量1x108cfu，此过程仍持续给予管喂gmnl-296。同步观察老鼠体重变化，并解剖分析肠子长度。将小鼠肠道组织取出并纯化其rna，利用即时定量pcr(real-timepcr)来分析调节型t细胞(treg)相关转录因子foxp3及gata3及可抑制发炎的细胞激素il-10的mrna的表现量。由实验3可发现，小鼠感染困难梭状杆菌后的确会造成小鼠肠炎病症，包含体重下降及盲肠至结肠段长度变短。请参照图3a至3b，喂食gmnl-296的组别，能有效保护小鼠因困难梭状杆菌感染而引起的体重下降(图3a)与盲肠至结肠段长度变短(图3b)的症状。从上述结果中，可以显示发酵乳酸杆菌gmnl-296能改善因困难梭状杆菌感染而造成的盲肠与结肠段异常现象。此外，请参照图4，其显示了转录因子foxp3及gata3及可抑制发炎的细胞激素il-10的mrna的表现量。从图4中也可以发现，发酵乳酸杆菌gmnl-296的给予能促进小鼠肠道组织中，foxp3基因的增加；同时，也能够促进抗发炎细胞激素il-10的分泌，这两个分子与treg的活化极为相关，gmnl-296能通过这些分子的增加，进而活化调节型t细胞的产生，达到免疫调节的能力。此外，也发现gmnl-296具有增加gata3(trans-actingt-cell-specifictranscriptionfactor3)基因表达的能力；gata3为影响调节型t细胞功能的重要转录因子；gmnl-296也可经此分子，达到改善困难梭状杆菌急性感染后造成的免疫紊乱。从此结果来看，发酵乳酸杆菌gmnl-296降低因困难梭状杆菌感染而引起的体重减轻与肠道结构的异常症状，其主要是通过增加肠道组织的foxp3、il-10及gata3基因表现调节免疫反应，而非抑制困难梭状杆菌的生长。综合上述结果，可以确定本发明所提供的发酵乳酸杆菌gmnl-296组合物与使用发酵乳酸杆菌gmnl-296制造改善困难梭状杆菌感染症状的发酵乳酸杆菌组合物的用途，已成功建困难梭状杆菌感染的动物模式平台，由于受感染的小鼠在疾病表症贴近临床人的疾病病症，包含严重腹泻、体重减低、盲肠与大肠的溃疡甚至死亡等等。从实验结果发现发酵乳酸杆菌(lactobacillusfermentumgmnl-296)确实具有改善困难梭状杆菌感染所造成的动物体重与肠组织长度变短的效果，代表发酵乳酸杆菌gmnl-296具有预防及治疗因困难梭状杆菌感染所形成的恶性症状的效果。此外，发酵乳酸杆菌gmnl-296主要通过促进调节型t细胞相关的分子foxp3及il-10的表达增加，也亦有少量gata3的表达增加，而达到改善困难梭状杆菌感染后的症状，与直接抑制困难梭状杆菌生长的能力有着显著不同，亦即，在困难梭状杆菌感染的改善机制上是明显不同于以往。本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已公开的实施例并未限制本发明的范围。相反地，包含于权利要求书的精神及范围的修改及均等设置均包括于本发明的范围内。当前第1页12