基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系的制作方法

本发明涉及将微流控芯片技术应用到毒性评价体系构建的技术领域，具体涉及基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系。

背景技术：

动物实验在现代医学与生物学中占据了极为重要的位置，但是经费以及动物伦理也成了难以回避的问题。结合微流控技术与生物科学技术，创造出了一种“器官芯片”，能够用微芯片复制人体器官的功能，使医学实验变得更为简便。

口服给药作为一种传统的给药方式，以其相对的方便性与安全性而为人们所广泛接受。吸收过程是决定口服药物生物利用度的关键因素之一。而小肠是口服药物吸收的主要部位，所以目前国内外主要利用各种体外及在体肠吸收模型研究药物在小肠部位的跨膜转运过程，从而预测其口服吸收情况。其中，caco-2单层细胞模型是目前被广泛应用于研究药物分子的生物膜通透性和跨膜转运机制的体外模型之一，已经成为研究药物吸收特征的代表性体外研究体系。

肾脏是药物毒副作用的主要靶器官之一。肾脏由超过20种具有不同超微结构、吸收能力和转运功能的细胞构成，是药物排泄的重要器官。化学药物经肾脏排泄时会选择性地富集在肾细胞中，造成细胞膜、线粒体、内质网和溶酶体损伤，破坏细胞的完整性，使肾细胞凋亡或坏死。降低肾小球的滤过作用和肾小管的重吸收功能，进而造成体内水和电解质的不平衡，严重时还会引起急性肾衰竭。因此，观察药物肾毒性是药物安全性评价和药物毒理学研究的重要内容。现代药物毒理学研究开始由体内研究向体内和体外研究相结合发展，利用体内和体外技术，在整体、器官、细胞、亚细胞和分子水平等多个层次研究药物的肾毒性。在药物肾毒性的体外研究中，建立肾脏体外模型并将其应用于药物体外肾毒性评价与筛选已逐步成为热点。现有工作大都集中在药物直接对肾的毒性评价，未考虑药物体内实际过程，如能构建肠-肾模型模拟药物在体内的吸收过程来评估肾毒性具有重要意义。

微流控芯片技术作为一门迅速发展起来的科学技术，已经在生物医学领域展现了其独特的优势，更因其同细胞尺寸匹配、环境同生理环境相近、在时间和空间维度上能够提供更为精确的操控，易于通过灵活设计实现多种细胞功能研究等特点而成为新一代细胞研究的重要平台。应用微流控技术构建具有功能的肾小球芯片具有十分重要的优势和意义。

目前，利用微流控技术构建具功能的复杂多器官芯片进行相关研究分析还处于空白阶段，应用微流控技术构建结合具有吸收功能的肠芯片结合具有滤过功能的肾小球芯片具有十分重要的优势和意义。如能实现在生物学研究及医药研发中具有极大的应用前景。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系，该方法可以模拟体内吸收过程进行药物毒性评价，应用于药物经吸收后的肾毒性评价。

一种流控芯片，该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过pdms与底层芯片的上表面粘合封接；

顶层芯片由u形的顶层芯片主通道和顶层芯片主通道入口连接而成，

底层芯片由左侧主通道、右侧主通道、和胶原通道、胶原通道入口、底层芯片左侧主通道入口以及底层芯片右侧主通道入口组成，胶原通道左连左侧主通道，右连右侧主通道；

顶层芯片主通道通过多孔滤膜下连底层芯片左侧主通道；底层芯片左侧主通道通过多孔滤膜上连顶层芯片主通道，右连胶原通道。

所述底层芯片的左侧主通道为i形，所述底层芯片的右侧主通道为u型，所述底层芯片细胞胶原通道为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧通道和右侧通道相连接，横向结构的数量为1～10个；胶原通道与左侧主通道的交界为半球形界面，胶原侧为凹面。

所述底层芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道、右侧主通道高度为200-500μm，胶原通道高度为80-200μm，主通道高度：胶原通道高度为1～3:1。

所述芯片材料为可透光透气的pdms聚合物，pdms单体与引发剂比例为5～10:1，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.01～10um。

顶层芯片主通道和底层芯片右侧主通道设计为弯型，底层芯片左侧主通道和胶原通道设计为直型，这样，各通道入口能够相互避开，且具一定距离，不会影响操作，避免距离过近导致的接触污染。每层芯片的下表面和多孔滤膜为不可逆封接，每层芯片的上表面和多孔滤膜为pdms粘合。

本发明提供的微流控芯片的制备方法，不可逆封接方法为紫外活化1小时，硅烷化处理30分，氧等离子封接。

pdms粘合方法为使用单体与引发剂比例为20:1的pdms聚合物，在玻片上甩10～50um厚，芯片上表面蘸取pdms后，与已不可逆封接有上层芯片的多孔滤膜对齐封接，放入80度烘箱，30分。

一种基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系，采用上述微流控芯片，按照以下方法构建而成：

(1)芯片预处理

设计制作芯片，用移液器将配制好的胶原工作液加入胶原通道，加1mlpbs缓冲液于培养皿中，将固定芯片的培养皿放入培养箱中孵育30min，促使胶原由粘稠状液体变为果冻状凝胶，凝胶过程结束后，细胞主通道加入新鲜的细胞培养液；

(2)细胞的接种与培养

肠细胞调整至1～5×10⁶cells/ml的细胞悬液，加入上层芯片主通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次；

提取原代大鼠肾小球微组织，调整至10⁴～10⁵cells/ml的细胞悬液，取10μl细胞悬液加入左侧主通道，左侧主通道向上，胶原通道向下侧立培养过夜，使细胞贴附在底层芯片左侧主通道与胶原通道的半球形界面，在光学显微镜下观察可见肾小球微组织贴附于胶原界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次；

(3)待细胞生长状态良好，可进行后续试验；观察药物经吸收后对肾小球功能的影响及其他。

一种采用上述方法构建的模拟药物体内吸收过程的肠-肾芯片的应用，其特征在于：可采用上述体系，对药物毒性进行评价，具体过程如下：

(1)使用cck-8试剂盒进行细胞活性的检测，cck-8试剂：细胞培养基的体积比为1:9，混合均匀成检测工作液，加入底层芯片左侧主通道，置培养箱中3小时后，转入96孔板中，酶标仪测定450nm处吸光度，用于对细胞活力进行定量，作为药物毒性的指标之一；

(2)ldh漏出，收集芯片通道内细胞培养液，使用ldh试剂盒，操作检测ldh浓度，用于观察药物对细胞的损伤程度，作为药物毒性的指标之一；

(3)免疫荧光，常规免疫染色操作，荧光显微镜观察拍照，进行live/dead染色，观察细胞活力；zo-1染色，观察细胞紧密连接情况；f-actin染色，观察细胞骨架蛋白等作为药物毒性的指标；

(4)蛋白滤过，使用白蛋白(mw:70kda)，加入左侧主通道，1小时后，收集右侧主通道培养液，白蛋白试剂盒操作检测蛋白浓度，观察中分子量白蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标；

(5)蛋白滤过，使用igg(mw:150kda)，加入左侧主通道，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60min拍照，分析igg渗透性，观察高分子量蛋白的滤过率，作为药物对肾滤过功能影响的指标。

本发明基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系，顶层芯片接种有肠细胞，可以模拟体内药物的吸收过程；底层芯片主要由左侧主通道和右侧主通道通过胶原通道连接。在左侧主通道接种肾小球微组织，通过侧立培养使肾小球微组织在左侧主通道与胶原通道的半球形界面生长并形成细胞屏障，右侧主通道作为收集区，可以观察肾小球的滤过作用，以及药物经肠吸收后的化学成分造成的肾毒性对肾小球滤过功能的影响。实现模拟体内吸收过程的药物毒性评价体系的构建，及其在药物经吸收后的肾毒性评价应用。

本发明基于微流控芯片的模拟药物体内吸收过程的肠-肾体系，构建了一个能够模拟体内吸收过程的肾毒性评价平台，不但能够模拟药物在体内的吸收，观察药物的相互作用对吸收的影响，同时能够实现在体外评价肾滤过功能。以此平台进行药物评价，获得的数据更符合人的实际情况，降低因为研发前期药物毒性数据不可靠导致的药物研发后期的失败率。

附图说明

图1本发明微流控芯片示意图；a底层芯片胶原通道结构示意图；b底层芯片主通道结构示意图；c底层芯片俯视示意图；d底层芯片胶原界面放大示意图；e顶层肝芯片结构示意图；f发明微流控芯片俯视示意图；g发明微流控芯片整体示意图；h发明微流控芯片横截面示意图。

其中：1顶层芯片主通道，2肠细胞，3底层芯片左侧主通道，4肾小球微组织，5多孔滤膜，6底层芯片右侧主通道，7胶原通道，8胶原通道入口，9底层芯片左侧主通道入口，10底层芯片右侧主通道入口，11顶层芯片主通道入口，12半球形界面。

图2本发明肠-肾芯片肠功能表证；a肠绒毛结构；b肠绒毛极性，碱性磷酸酶定量；c肠细胞紧密连接蛋白(zo-1)免疫荧光染色。

图3药物的肾毒性评价；a肾小球的live/dead染色图b肾小球cck-8活力定量结果；c药物对肾小球ldh漏出的影响。

图4药物对肾小球滤过功能的影响；aigg在肾小球的渗透性；b白蛋白在肾小球的渗透定量结果。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

设计并制作微流控芯片，构造如图1所示。该微流控芯片主要由顶层芯片、多孔滤膜、底层芯片组成，多孔滤膜通过不可逆封接顶层芯片的下表面，封有顶层芯片的多孔滤膜下表面通过pdms与底层芯片的上表面粘合封接；

顶层芯片由u形的顶层芯片主通道1和顶层芯片主通道入口11连接而成；

底层芯片由左侧主通道3、右侧主通道6、胶原通道7、胶原通道入口8、底层芯片左侧主通道入口9以及底层芯片右侧主通道入口10组成，胶原通道7左连左侧主通道3，右连右侧主通道6；

顶层芯片主通道1通过多孔滤膜5下连底层芯片左侧主通道3；底层芯片左侧主通道3通过多孔滤膜5上连顶层芯片主通道1，右连胶原通道7。

所述底层芯片的左侧主通道3为i形，所述底层芯片的右侧主通道6为u型，所述底层芯片细胞胶原通道7为“丰”字形，在胶原通道中间的位置上为横向结构，胶原通道通过横向结构与左侧通道3和右侧通道6相连接，横向结构的数量为3个；胶原通道7与左侧主通道3的交界为半球形界面12，胶原侧为凹面。

所述底层芯片是由高度不同的两部分组成，左侧主通道3、右侧主通道6高度为300μm，胶原通道7高度为100μm，主通道高度：胶原通道高度为3:1。

所述芯片材料为可透光透气的pdms聚合物，pdms单体与引发剂比例为5:1，多孔滤膜材料为聚碳酸酯膜，聚碳酸酯膜的孔径为0.4um。

配制浓度为4mg/ml的胶原工作液，将胶原灌注到芯片胶原通道，孵育30min后，各芯片通道加入细胞培养液。肠细胞调整至合适的细胞密度，加入上层芯片主通道，细胞贴附于多孔滤膜界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养。肠细胞培养14天后，提取原代大鼠肾小球微组织，调整至合适的细胞密度，取10μl细胞悬液加入下层芯片左侧主通道，侧立培养过夜，在光学显微镜下观察可见肾小球微组织贴附于胶原界面生长，将芯片平移放入37℃培养箱中继续培养、每隔24h换液一次。

扫描电镜观察肠细胞形态，如图2a所示，可见明显的肠绒毛结构。收集上层芯片(ap)培养液与下层芯片(bl)培养液检测碱性磷酸酶活性，结果如图2b所示，可见ap层碱性磷酸酶活性明显高于bp层，是肠绒毛极性的标志。进行zo-1免疫荧光染色，如图2c所示，可见有明显的紧密连接结构。肠芯片具有完整的单层屏障功能。

实施例2

药物肾毒性的评价应用

地高辛具有肾毒性，考来烯胺可以减少地高辛的肠吸收，维拉帕米则增加地高辛的肠吸收，肾毒性随之发生改变。

构建肠-肾芯片。上层芯片通道分别加入含地高辛(dig)80μm，地高辛(dig)80μm联合考来烯胺(col)200μg/ml，地高辛(dig)80μm联合维拉帕米(ver)20μm的细胞培养液培养，处理48小时后收集下层芯片主通道培养液进行ldh漏出检测，结果如图2c所示。可见，地高辛联用考来烯胺较单独应用地高辛的ldh漏出低；地高辛联用维拉帕米较单独应用地高辛的ldh漏出高，药物联用经肠细胞吸收后影响了地高辛的肾毒性。对肾小球进行cck-8定量测试及死活染色，荧光显微镜拍照，结果如图2a和图2b所示。地高辛联用维拉帕米较单独应用地高辛的死细胞数量多，细胞活力明显降低，而地高辛联用考来烯胺较单独应用地高辛的死细胞数量少，细胞活力增高，药物联用经肠吸收后的肾毒性发生了变化。在下层芯片左侧主通道分别加入igg(红色荧光)，荧光显微镜下于0min、15min、30min、60min拍照。结果如图3a所示，分子量为150000的igg在肾小球芯片渗透在维拉帕米联用地高辛较多，而在考来烯胺联用地高辛较少。白蛋白(分子量70000)标准液15mg/ml加入左侧主通道，1小时后，收集右侧主通道培养液，使用白蛋白试剂盒操作检测蛋白浓度，结果如图3b所示。可见药物联用经肠吸收影响了作为肾毒性指标的肾小球滤过功能。